棉花PAL基因家族的全基因组鉴定及其在逆境胁迫下的表达分析.pdf

山西农业科学 2023，51（9）：961-973Journal of Shanxi Agricultural Sciences棉花 PAL基因家族的全基因组鉴定及其在逆境胁迫下的表达分析王梓钰，古丽斯坦赛米，刘隋赟昊，黄耿青，张经博，郭彦君（新疆师范大学 生命科学学院/新疆特殊环境物种保护与调控生物学实验室，新疆 乌鲁木齐 830054）摘要：苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia lyase，PAL）是苯丙烷代谢的关键酶和限速酶，在植物的生长发育、抗病虫害和抗逆等方面发挥着重要作用。研究在全基因组水平上对棉花 PAL 基因家族进行了鉴定和分析，以了解棉花中 PAL 的功能，为后续深入研究棉花 PAL 功能提供一定参考。结果表明，在陆地棉（Gossypium hirsutum）、海岛棉（Gossypium barbadense）、草棉（Gossypium herbaceum）和雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）中分别鉴定出 15、13、7、8个 PAL基因。进化分析结果显示，棉花 PAL基因家族可分为 3个亚组。保守基序和基因结构分析显示，亲缘关系近的 PAL基因之间的保守基序组成和基因结构也十分相似。启动子分析显示，GhPAL基因的启动子上存在多个与非生物和生物胁迫应答以及激素信号转导相关的顺式作用元件。组织表达模式分析表明，GhPAL基因主要在根、茎、花丝和胚珠中高表达。转录组和 qPCR分析显示，部分 GhPAL基因的表达量在PEG、盐、高温、低温和碱胁迫下显著提高，其中一些 GhPAL基因能够对多种非生物胁迫作出响应。生物胁迫转录组数据显示，GhPAL1/GhPAL5/GhPAL13 的表达在大丽轮枝菌处理条件下发生显著上调。GhPAL 基因在逆境胁迫下的表达分析结果说明，PAL基因可能在棉花应答逆境胁迫的过程中发挥一定的功能。关键词：棉花；苯丙氨酸解氨酶（PAL）；非生物胁迫；生物胁迫；表达分析中图分类号：S562 文献标识码：A 文章编号：10022481（2023）09096113Genome-Wide Identification of PAL Gene Family in Cotton and Its Expression Analysis under StressWANG Ziyu，GULISITAN Saimi，LIUSUI Yunhao，HUANG Gengqing，ZHANG Jingbo，GUO Yanjun（College of Life Sciences，Xinjiang Normal University/Xinjiang Key Laboratory of Special Species Conservation and Regulatory Biology，Urumqi 830054，China）Abstract：Phenylalanine ammonia lyase(PAL)is the key and rate-limiting enzyme in phenylpropane metabolism,which plays an important role in plant growth,pathogen and pest resistance,and stress resistance.In this study,the PAL gene family in cotton was identified and analyzed at the whole genome level to understand the function of PAL in cotton and provid a certain reference for further study on the function of PAL in cotton.The results showed that there were 15,13,7,and 8 PAL genes in Gossypium hirsutum,Gossypium barbadense,Gossypium herbaceum,and Gossypium raimondii,respectively.Phylogenetic analysis showed that PAL gene family could be divided into 3 subgroups.The analysis of conserved motifs and gene structures showed that the conserved motifs and gene structures of PAL genes with close genetic relationships were also very similar.The promoter analysis showed that there were multiple cis-acting elements related to abiotic and biotic stress response and hormone signal transduction in the promoter of GhPAL genes.Tissue expression pattern analysis showed that GhPAL genes were highly expressed mainly in root,stem,filament,and ovule.Transcriptome and qPCR analysis showed that the expression of some GhPAL genes was significantly increased under PEG,salt,high temperature,low temperature,and alkali stress,and some GhPAL genes could respond to a variety of abiotic stresses.Biological stress transcriptome data showed that the expression of GhPAL1/GhPAL5/GhPAL13 was significantly upregulated under the treatment of Verticillum dalica.Expression analysis results of GhPAL gene under stress suggested that PAL genes might play a certain function in the process of cotton response to stress.Key words：cotton;phenylalanine ammonia lyase(PAL);abiotic stress;biotic stress;expression analysisdoidoi:10.3969/j.issn.1002-2481.2023.09.01收稿日期：2023-06-10基金项目：2021年新疆维吾尔自治区“天池博士引进计划”人才项目；新疆师范大学博士科研启动基金项目（XJNUBS2215）作者简介：王梓钰（2000-），女，新疆沙湾人，在读硕士，研究方向：棉花抗逆基因。通信作者：郭彦君（1993-），女，河南商丘人，讲师，博士，主要从事植物功能基因组和分子遗传学研究工作。961山西农业科学 2023 年第 51 卷第 9 期苯丙烷类物质代谢是研究最广泛的代谢途径之一，苯丙烷代谢物的生物合成和多样性是通过一系列酶实现的1-2。苯丙烷代谢的前 3 个步骤是苯丙烷代谢的公共途径，为下游代谢物提供前体，苯丙氨酸经苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia lyase，PAL）、肉桂酸 4-羟化酶、4-香豆酸辅连接酶一系列的酶催化后，最终生成 4-香豆酸辅酶 A，然后通过不同酶的催化作用进入下游合成途径，即木质素途径和类黄酮途径，产生木质素、花青素、原花青素、黄酮类化合物、芦丁等次级代谢产物3-4。PAL 作 为 苯 丙 烷 类 代 谢 途 径 的 起 始 酶，于1973 年开始被研究5，现已从一些藻类、裸子植物、被 子 植 物 中 分 离 得 到 了 PAL 基 因6-8，拟 南 芥（Arabidopsis thaliana）中 有 4 个9，杨 树（Populus trichocarpa）中有 5 个10，苜蓿（Medicago sativa）中有 7 个11，西瓜（Citrullus lanatus）中有 12 个12，马铃薯（Solanum tuberosum）中有 14 个13。PAL 是连接初级代谢和次级代谢的“代谢枢纽”，它不仅在植物的正常生长发育中发挥重要作用，也是植物应答生物或非生物胁迫时的一种关键酶14。罗勒草（Ocimum basilicum）中，ObPAL基因的表达量随着干旱程度的加剧而逐步升高15。在冷胁迫下，芒草（Miscanthus sinensis）的耐冷株系中 PAL 活性显著提高，这可能是因为耐冷株系对冷胁迫做出的应答16。当植物受到生物或非生物胁迫时，PAL活性常常与多酚、花青素、类黄酮等次生代谢物质的积累呈显著正相关，烟草（Nicotiana tabacum）中 PAL酶活性的增强可以提高木质素的含量，帮助植物抵御干旱胁迫17。玉米（Zea mays）苯丙氨酸解氨酶可能通过正向调节水杨酸的积累来抵抗甘蔗花叶病毒感染18，水稻过表达 OsPAL8，促进水杨酸和木质素的生物合成和积累，显著提高水稻对褐飞虱的抗性19；可见，PAL 可以通过调节次级代谢产物的合成来增强植物的抗逆水平。在一个物种中，PAL基因家族常常包含多个成员，表达分析显示，PAL 基因的表达常常具有时空特异性和组织特异性；当面临不同胁迫时，不同PAL基因的表达量变化也往往不同13。因此，PAL基因可能具有不同的分工，想要利用 PAL 基因进行植物抗逆性改良，需要从多个角度对各个 PAL基因进行分析研究。棉花是当今全球主要的经济作物之一，作为我国主要经济作物和主要天然纤维来源，已成为我国除粮食以外不可缺少的战略储备物资20，但自然降水量不足、部分地区土壤盐碱化严重、极端高温天气和“倒春寒”现象限制棉花产量和质量21。因此，解析棉花抗逆分子机制，将有助于我们通过遗传育种的方式，培育高产抗逆的棉花新品种。本研究对陆地棉、海岛棉、草棉、雷蒙德氏棉中的 PAL 基因进行了鉴定，分析了它们在不同棉种中的系统发育关系；对陆地棉 PAL 基因启动子区的顺式作用元件进行了分析，初步预测棉花中 PAL可能参与的生物学过程；对陆地棉 PAL 基因的组织表达模式、在非生物或生物胁迫下的表达模式进行了分析，初步筛选出了一些可能参与棉花逆境胁迫应答的 PAL 基因，旨在了解 PAL 基因在棉花抗逆分子机制中的作用，为棉花遗传育种提供一定的理论依据。1 材料和方法1.1棉花 PAL 家族成员的鉴定为了鉴定棉花中的 PAL 基因家族成员，首先从 pfam3.0（http:/pfam.xfam.org/）数据库中下载PAL 蛋白结构域的隐马尔可夫模型（PF00221），并从棉花基因组数据库（https:/ HMMER 3.0 软件以 PAL 蛋白结构域的隐马尔可夫模型为模板，搜索鉴定棉花中的 PAL 基因家族成员。利用 TBtools 软件对棉花 PAL 蛋白质的分子质量、等电点和氨基酸数量等基本理化性质进行分析。使用WoLF PSORT（http:/wolfpsort.seq.cbrc.jp）对棉花 PAL 蛋白的亚细胞定位情况进行预测。1.2棉花 PAL基因家族系统进化分析从 phytozome 数据库（https:/phytozome-next.jgi.doe.gov/）获得拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）和 可 可（Theobroma cacao）的 PAL 家族蛋白序列。利用 MUSCLE 对PAL 蛋白序列进行多序列比对，使用最大似然法将比对结果输入 MEGA-x 软件构建系统进化树，自展值（bootstrap value）设为 1 000。使用 Evolview（https:/evolgenius.info/evolview-v2/#login）对进化树进行美化。1.3棉花 PAL染色体定位和共线性分析从陆地棉、草棉和雷蒙德氏棉的基因组注释文962王梓钰等：棉花 PAL基因家族的全基因组鉴定及其在逆境胁迫下的表达分析件中提取 PAL 基因成员的位置信息，利用 Circos软 件 绘 制 PAL 基 因 在 染 色 体 上 的 位 置。使 用MCScanX 软件分析陆地棉 PAL 基因家族成员与草棉和雷蒙德氏棉 PAL 基因家族成员之间的共线性关系，而后利用 Circos软件对共线性分析结果进行可视化。1.4棉花 PAL基因的结构和保守基序分析将 棉 花 PAL 蛋 白 序 列 提 交 到 MEME Suite 5.1.0 在线软件预测棉花 PAL 蛋白的保守基序，基序 数 量 设 定 为 20。从 棉 花 数 据 库（CottonMD：Cotton Multiomics Database）下载基因组文件注释文件，而后将基因组注释文件输入 Tbtools 软件获取 PAL的基因结构信息。1.5棉花 PAL 基因启动子顺式作用元件预测及分析提取棉花 PAL 基因起始密码子上游 2 000 bp的 序 列 作 为 启 动 子 序 列，将 获 取 的 序 列 提 交 到PlantCARE（http:/www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）数据库，进行顺式作用元件分析。对获得的顺式作用元件进行整理，将整理后的顺式作用元件信息输入 Tbtools软件进行可视化。1.6棉花 PAL基因家族的表达模式分析从棉花数据库（CottonMD：Cotton Multiomics Database）下载陆地棉各个组织、胚珠不同发育时期和纤维不同发育时期的转录组数据（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=PRJNA490626），将转录组数据进行标准化处理，用 log2（TPM+1）代表每个基因的表达量，使用 TBtools软件绘制热图。从 棉 花 数 据 库（CottonMD：Cotton Multiomics Database）下载陆地棉在干旱、高盐、高温和低温胁迫下的转录组数据（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=PRJNA490626），将转录组数据进行标准化处理，同时以处理组/对照组作为每个基因的相对表达量，而后利用 TBtools 软件绘制热图。大丽 轮 枝 菌 处 理 棉 花 的 转 录 组 数 据 来 源 于 NCBI SRA 数据库（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=PRJNA745369），使用 hisat 2 软件将转录组数据的 reads比对到陆地棉基因组，利用 stringtie软件对转录本进行拼接，而后使用 htseq 软件对转录本进行表达定量，从中提取棉花 PAL 基因的表达数据，并利用 TBtools对表达数据进行可视化。1.7RNA提取及基因表达定量分析对陆地棉新陆早 64号 3周龄的幼苗进行处理，以霍格兰培养液水培组作为对照组，以 NaHCO3水培组作为处理组。分别在处理 0、1、3、6、12、24 h时，收集对照组和处理组的棉花叶片，利用植物RNA 提取试剂盒（成都，福际生物）提取棉花叶片的 RNA，而后用反转录试剂盒（成都，福际生物）将 RNA 反转录为 cDNA。使用 PAL 基因的特异性引物（表 1），利用双链嵌合荧光染料法（SYBR Green）进行 qPCR 试验，以 GhHIS3 作为内参基因，取 3 次生物学重复的平均值，采用 2-Ct法计算基因的表达量，并以处理组/对照组作为每个基因的相对表达量。表 1 棉花 PAL基因 qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences for qPCR of cotton PAL genes基因名称Gene nameGhPAL1GhPAL2GhPAL3GhPAL4GhPAL5GhPAL6GhPAL7GhPAL8GhPAL9GhPAL10GhPAL11GhPAL12GhPAL13GhPAL14GhPAL15上游引物（53）Forward primer(5-3)TGGTGAAACTCGGTGGTGAGAGCAATGCAATTTTTCAAACTGTGTCCAAGATGTGAACTCCTTGGGATTGCACTGGAAAAAGGCTGCGTACCCCGATTGGAGTGTCGAGCTAGTTAAGGCACTGGTCCACACGGTCAAATTAACAACGGTATTGTTGAGTTGACTCGGCCTTGCCTTAAAGCAATGCAATTTTGGCGGTACTGATGGTAAAATCCGCAACCCCTTGGCAGATGTCTCTTGCACTGGAAAAAGGCTGCTGCTACCTACCCGTTGATGCTGCAGTGCAAATTACCCCCTGGGCGCCAAGCCCTTAAATA下游引物（53）Reverse primer(5-3)AGCACCAAAACCAGTGGTGAAATAGTAGGGCGACCTTGGCCAGCACCGGTAGTGAGTGTTGGAGATGTTGTTAGTAACCCAGTTTCAGCGCCTTTGAGACCATTGGGCTGGGATCCAACATTTTGCAGGTTAAATTGCATTTTGGTTGGTTGCTGAGTGAGGCAATAGTAGGGCAACCTTGGCAACCCATCTCACGCTCTATCATTGCGGCTTGTTGGGAGGCCATTAATTATGTGCCAACATTAGTAACCCACTGATGCCCTTGCACTCTCATAGCCGGACTCCCGTTCTCTCCCTACAAGTTTCCACGCC963山西农业科学 2023 年第 51 卷第 9 期2 结果与分析2.1棉花 PAL基因家族的鉴定及序列分析利用 HMMER 软件搜索棉花基因组中的 PAL基因家族成员，在陆地棉、海岛棉、草棉、雷蒙德氏棉基因组中分别鉴定到 15 个 GhPAL 基因、13 个GbPAL基因、7个 GhePAL基因、8个 GrPAL基因，根据它们在染色体上的位置进行命名（表 2）。理化性质分析显示，棉花 PAL 蛋白的氨基酸数目为 206988 个，蛋白分子质量为 23 432.17109 057.41 u，理论等电点为 5.859.09。亚细胞定位预测分析显示，大部分 PAL 蛋白定位在叶绿体，少数定位在细胞质和质膜（表 2）。表 2 棉花 PAL基因家族成员的基本信息Tab.2 The basic information of PAL family genes in cottonGhePAL1GhePAL2GhePAL3GhePAL4GhePAL5GhePAL6GhePAL7GrPAL1GrPAL2GrPAL3GrPAL4GrPAL5GrPAL6GrPAL7GrPAL8GbPAL1GbPAL2GbPAL3GbPAL4GbPAL5GbPAL6GbPAL7GbPAL8GbPAL9GbPAL10GbPAL11GbPAL12GbPAL13GhPAL1GhPAL2GhPAL3GhPAL4GhPAL5GhPAL6GhPAL7GhPAL8Ghe01G27280Ghe04G14210Ghe04G14220Ghe06G09260Ghe09G19720Ghe10G27400Ghe11G44650Grai_01G024640Grai_04G010090Grai_04G010100Grai_06G008990Grai_09G018380Grai_10G026520Grai_11G000560Grai_11G000570GB_A01G2421GB_A04G0956GB_A04G0957GB_A06G0846GB_A09G1787GB_A10G2412GB_A11G3778GB_D01G2495GB_D04G1316GB_D04G1317GB_D09G1625GB_D10G2369GB_D11G3797Ghi_A01G12166Ghi_A04G04751Ghi_A04G04756Ghi_A06G04136Ghi_A09G08756Ghi_A10G12876Ghi_A11G18196Ghi_D01G1129671770972198872071071872161672169472071071871872872170469772071071872172149172071071872172170969772071071872177 684.7577 365.7178 268.40109 057.4177 976.0777 501.5277 802.8978 169.1367 228.6678 341.5076 403.5077 902.8977 372.3977 843.0177 825.9378 879.8778 328.5076 778.0076 803.0777 944.0377 469.4677 888.9878 179.1778 329.4054 360.0277 900.9277 376.3877 970.1378 148.1178 343.4777 254.6076 817.0977 899.9377 469.4677 888.9878 169.136.235.886.067.856.135.926.106.146.236.105.906.005.996.346.176.176.065.856.266.135.926.036.145.969.096.076.036.256.176.065.996.266.065.926.036.1430.8631.9234.2939.7032.8634.2729.0129.6431.9434.4036.3833.4734.7529.4129.6929.2433.5731.0535.8733.3433.6530.6129.6434.8332.6233.1934.8030.1829.8633.4731.9635.9832.9833.6530.6129.64-0.167-0.083-0.140-0.156-0.146-0.193-0.125-0.1680.015-0.145-0.122-0.143-0.177-0.131-0.136-0.173-0.135-0.078-0.135-0.148-0.190-0.130-0.169-0.142-0.116-0.146-0.180-0.142-0.164-0.145-0.075-0.132-0.147-0.190-0.130-0.168叶绿体质膜叶绿体质膜叶绿体叶绿体叶绿体叶绿体质膜叶绿体细胞质叶绿体叶绿体叶绿体叶绿体叶绿体叶绿体质膜细胞质叶绿体叶绿体叶绿体叶绿体叶绿体细胞质叶绿体叶绿体叶绿体叶绿体叶绿体质膜细胞质叶绿体叶绿体叶绿体叶绿体基因Gene name基因 IDGene ID氨基酸个数Number of amino acid分子质量/uMolecular weight等电点Theoretical pI不稳定系数Instability index亲水系数Hydrophilicity coefficient亚细胞定位Subcellular localization964王梓钰等：棉花 PAL基因家族的全基因组鉴定及其在逆境胁迫下的表达分析GhPAL9GhPAL10GhPAL11GhPAL12GhPAL13GhPAL14GhPAL15Ghi_D04G06436Ghi_D04G06441Ghi_D04G06446Ghi_D06G03981Ghi_D09G08166Ghi_D10G11851Ghi_D11G1808172120625872372071071878 384.4423 432.1728 491.6480 121.8677 938.9677 388.3977 800.925.967.658.386.035.975.996.2035.0321.5744.6536.6332.4634.7029.96-0.146-0.244-0.100-0.106-0.141-0.181-0.139叶绿体叶绿体细胞质细胞质叶绿体叶绿体叶绿体 基因Gene name基因 IDGene ID氨基酸个数Number of amino acid分子质量/uMolecular weight等电点Theoretical pI不稳定系数Instability index亲水系数Hydrophilicity coefficient亚细胞定位Subcellular localization使用在线网站 MEME 分析棉花 PAL 的蛋白保守基序，将预测到的 20 种基序命名为 Motif 1Motif 20。结果显示，绝大多数 PAL 蛋白基序组成较 为 相 似，只 有 GhPAL10、GhPAL11、GbPAL10与其他 PAL 成员相比，缺少一些共有基序。PAL基因的结构分析结果显示，PAL基因的外显子数目为 26 个，同 一 分 支 的 基 因 呈 现 相 似 的 基 因 结构（图 1）。2.2棉花 PAL基因家族的系统进化分析利用棉花、拟南芥、可可、水稻、玉米、二穗短柄草的 PAL 蛋白序列构建系统进化树，结果显示，PAL 基因家族可以分为 7 个亚组。单子叶植物和双子叶植物的 PAL 呈现出聚类分布的特征，即group1group3 中只有单子叶植物 PAL 家族成员的分布，而 group4group7中只有双子叶植物 PAL家族成员的分布。棉花PAL家族成员分布在group4、group6 和 group7 亚组中，而 group4 只有棉花 PAL家族成员的分布，说明棉花 PAL 家族在进化过程中产生了新的分化。此外还发现，group5中只有拟南芥 PAL 家族成员的分布，而 group6 和 group7 中图 1棉花 PAL基因家族的蛋白保守基序和基因结构分析Fig.1Conserved motifs and gene structures analysis of PAL gene family in cotton续表 2 棉花 PAL基因家族成员的基本信息Tab.2（Continued）The basic information of PAL family genes in cotton965山西农业科学 2023 年第 51 卷第 9 期除了有棉花 PAL 家族成员之外，还包含了可可PAL 家族成员，说明棉花和可可 PAL 的亲缘关系较近（图 2）。2.3棉花 PAL基因家族的共线性分析为进一步探索棉花 PAL 基因家族的进化关系，对陆地棉、草棉、雷蒙德氏棉 PAL 基因进行共线性分析，结果如图 3所示。图 2棉花 PAL基因家族的系统进化分析Fig.2Phylogenetic analysis of PAL gene family in cotton图 3棉花 PAL基因家族的共线性分析Fig.3Collinearity analysis of PAL gene family in cotton966王梓钰等：棉花 PAL基因家族的全基因组鉴定及其在逆境胁迫下的表达分析图 3结果表明，陆地棉 A 基因组的 6个 PAL 基因与草棉 6个 PAL 基因存在共线性关系，陆地棉 D基因组的 6 个 PAL 基因与雷蒙德氏棉的 6 个 PAL基因存在共线性关系。说明陆地棉 PAL 基因在进化时具有很大的保守性。另外，陆地棉 GhPAL3、GhPAL10 和 GhPAL11 与 草 棉 或 雷 蒙 德 氏 棉 的PAL基因不存在共线性关系，说明它们是陆地棉形成后进化而来的基因。草棉 GhePAL3 与陆地棉PAL基因不存在共线性关系，雷蒙德氏棉GrPAL3、GrPAL8与陆地棉 PAL基因不存在共线性关系，说明陆地棉 PAL 基因的进化过程中可能发生了基因丢失。2.4陆地棉 PAL 基因启动子上的顺式作用元件分析由于陆地棉是目前种植范围最广的棉花，因此，后续重点对陆地棉 PAL 基因进行了研究。首先，对 15个陆地棉 PAL基因启动子上的顺式作用元件进行了分析，共鉴定出 22种元件，其中激素响应元件 8 种，分别为脱落酸响应元件 ABRE，赤霉素响应元件 GARE-motif、TATC-box，水杨酸响应元件TCA-element，茉 莉 酸 甲 酯 响 应 元 件 CGTCA-motif、TGACG-motif 和 生 长 素 响 应 元 件 TCA-box、TCA-element；胁迫相关的元件 3 种，包括低温响应元件 LTR，干旱响应元件 MBS，防御应激元件 TC-rich repeats；生长发育相关的元件 6种，包括类 黄 酮 生 物 合 成 元 件 MBSI，光 响 应 元 件 chs-CMA1a、GATA-motif、TCCC-motif、TCT-motif、G-box；除 GhPAL3 外，所有成员都含有光响应元件，GhPAL1 和 GhPAL11 中的光响应元件数量最多（图 4）。基于进化树的聚类分析显示，一些亲缘关系较近的 GhPAL基因启动子上顺式作用元件的种类和位置具有一定的相似性，例如，GhPAL5 和GhPAL13、GhPAL2 和 GhPAL9、GhPAL6 和GhPAL14（图 4）。2.5陆地棉 PAL基因的组织表达模式分析为探究陆地棉 PAL 基因在棉花生长发育过程中的生物学功能，利用已发表的陆地棉转录组数据分析了 15 个 PAL 基因在根、叶片、花萼、茎、花托、花药、苞片、花丝、花瓣、雌蕊和不同发育时期的胚珠、棉纤维中的表达水平，其中棉花胚珠和纤维的发育时期用开花后天数（Days post anthesis，DPA）来描述，结果如图 5 所示，很多位于同一进化枝的GhPAL 基因具有相似的表达模式，例如，GhPAL2和 GhPAL9、GhPAL6 和 GhPAL14、GhPAL4 和GhPAL12、GhPAL1 和 GhPAL8，在以上所提到的组织中表达模式相似，说明这些基因对中的 2个基图 4陆地棉 PAL基因启动子上的顺式作用元件分析Fig.4Analysis of cis-acting elements on PAL gene promoters in Gossypium hirsutum967山西农业科学 2023 年第 51 卷第 9 期因可能发挥类似的功能。有意思的是，位于同一进化枝的 GhPAL13 和 GhPAL15 在胚珠和纤维中的表达模式相似，在根、叶片、花萼、茎、花托、花药、苞片、花丝、花瓣、雌蕊中的表达模式有差异，说明它们可能在胚珠和纤维发育过程中功能相似，而在根、叶片等组织中的功能有差异。从表达量的角度看，GhPAL6 和 GhPAL14 在根、茎、花丝和开花后 15 d（15DPA）的胚珠中特异高 表 达，说 明 这 2 个 基 因 可 能 在 根、茎、花 丝 和15DPA 胚 珠 的 发 育 过 程 中 发 挥 较 大 的 作 用。GhPAL1 和 GhPAL8 在 开 花 后 10 d（10DPA）和15 d（15DPA）的胚珠中特异性高表达，说明它们可能在 10DPA 和 15DPA 的胚珠中发挥较大功能。此外，不同发育时期的胚珠中 GhPAL 的表达水平差异较大，开花前 3 d（-3DPA）、开花当天（0DPA）、开花后 1 d（1DPA）、3 d（3DPA）、5 d（5DPA）的胚珠中所有 GhPAL 均不表达，直到开花后 10 d 胚珠中才有 GhPAL表达。在棉纤维中，大部分 PAL 基因的表达量在纤维发育的各个时期均呈现较低的表达水平或者几乎不表达，只有 GhPAL1 基因和 GhPAL8 基因在10 DPA和 15 DPA 纤维中表达量较高，这说明可能只有 GhPAL1/GhPAL8参与了棉花纤维的发育过程。此外，注意到有 3 个基因 GhPAL3、GhPAL10和 GhPAL11 在 所 分 析 的 所 有 组 织 中 表 达 量 都很低。2.6陆地棉 PAL 基因在非生物逆境胁迫下的表达分析为了进一步了解 PAL 基因是否参与了棉花对非生物胁迫的应答过程，利用转录组数据分析了PAL 基因家族成员在 PEG 处理、NaCl处理、4 处理、37 处理所造成的 4种非生物胁迫下的表达模式，并利用 qPCR 技术分析了 PAL 基因在 NaHCO3处理模拟碱胁迫时的表达模式。图 6-A 结果显示，GhPAL4在 PEG 处理 1 h发生显著上调，GhPAL5、GhPAL12 在 PEG 处理 6 h 发生显著上调，还有多个 PAL 基因在 PEG 处理 12 h 发生上调，说明一些PAL 基因参与了棉花对渗透胁迫的应答过程。聚类分析显示，位于同一进化枝的 GhPAL 基因在对PEG 处理的响应方面具有一定的相似性，例如，GhPAL13 和 GhPAL15、GhPAL2 和 GhPAL9、GhPAL6 和 GhPAL14、GhPAL1 和 GhPAL8 在 受 到PEG处理后具有相似的表达模式，在相同处理时间后发生表达量的上调。但也有一个例外，GhPAL4和GhPAL12位于同一进化枝，受 PEG诱导最为显著，但 GhPAL4 是在 PEG 处理 1 h 表达量显著上调随图 5陆地棉 PAL基因的组织表达分析Fig.5Tissue expression analysis of PAL genes in Gossypium hirsutum968王梓钰等：棉花 PAL基因家族的全基因组鉴定及其在逆境胁迫下的表达分析后下降，而 GhPAL12 在 PEG 处理 6 h 时表达量显著上调，说明 GhPAL4 和 GhPAL12 基因可能在应答渗透胁迫过程中发挥较大的作用，但二者发挥作用的时间不同，可能存在功能差异，通过协作来应答渗透胁迫。图6-B结果显示，GhPAL1、GhPAL2、GhPAL4、GhPAL5、GhPAL6、GhPAL8、GhPAL9、GhPAL12、GhPAL13、GhPAL14、GhPAL15 的 表达量在NaCl处理不同时段发生上调，表明部分PAL基因与棉花应答盐胁迫过程相关。其中，GhPAL4和 GhPAL12受诱导程度最高，GhPAL4在 NaCl处理 1 h 时表达量显著上调，GhPAL12 在 NaCl 处理6 h时表达量显著上调，且能在 NaCl处理 12 h时继续上调，说明二者可能在应答盐胁迫过程中发挥较大功能。图 6PEG处理（A）、NaCl处理（B）、4 低温处理（C）和 37 高温处理（D）后陆地棉 PAL基因的表达分析Fig.6Analysis of PAL gene expression in Gossypium hirsutum after PEG treatment（A），NaCl treatment（B），low temperature treatment at 4 C（C），and high temperature treatment at 37 C（D）969山西农业科学 2023 年第 51 卷第 9 期图6-C结果显示，GhPAL2、GhPAL4、GhPAL5、GhPAL7、GhPAL15的表达量在 4 低温处理后的不同时段发生上调，说明部分 P