胶体金免疫层析法快速检测人工养殖复齿鼯鼠所产五灵脂中氯霉素残留.pdf

2023 Vol.24 No.7732中药制剂工程与技术732胶体金免疫层析法快速检测人工养殖复齿鼯鼠所产五灵脂中 氯霉素残留李 倩1，2，宁红婷1，2，陈 煜1，2，杨国伟1，张 彬1，2（1.山西省检验检测中心药品检验技术研究所，山西 太原 030001；2.食品药品安全防控山西省重点实验室，山西 太原 030001）摘要目的：建立五灵脂中氯霉素的胶体金免疫层析快速检测方法。方法：采用免疫竞争法对比检测线与控制线两者之间颜色深浅的差距，定性判定五灵脂中的氯霉素含量。结果：检出限：0.1g/kg、灵敏度：98%、特异性：90%、假阴性率：1%、假阳性率：10%。结论：该方法可作为人工养殖复齿鼯鼠所产五灵脂药材中氯霉素的胶体金免疫层析快速检测。关键词 五灵脂；氯霉素；胶体金免疫层析法中图分类号：R284.1 文献标识码：A DOI：10.19763/ki.2096-7403.2023.07.06Rapid detection of chloramphenicol residues in Wulingzhi produced by artificially bred com-plex-toothed flying squirrel by colloidal gold immunochromatographyLiQian1，2，NingHongting1，2，ChenYu1，2，YangGuowei1，ZhangBin1，2（1.InstituteofDrugTestingTechnology，ShanxiProvincialInspectionandTestingCenter，TaiyuanShanxi030001；2.ShanxiKeyLaboratoryofFoodandDrugSafetyPreventionandControl，TaiyuanShanxi030001）Abstract Objective：ToestablishacolloidalgoldimmunochromatographicmethodforrapiddetectionofchloramphenicolinWulingzhi.Methods：ThedifferenceofcolordepthbetweendetectionlineandcontrollinewascomparedbyimmunecompetitionmethodtoqualitativelydeterminethechloramphenicolcontentinWulingzhi.Results：Detectionlimit:0.1g/kg，sensitivity:98%，specificity:90%，falsenegativerate:1%，andfalsepositiverate:10%.Conclusion：ThemethodcanbeusedascolloidalgoldimmunochromatographyfortherapiddetectionofchloramphenicolinWulingzhiproducedbyartificiallybredcomplex-toothedflyingsquirrel.Keywords Wulingzhi；chloramphenicol；colloidalgoldimmunochromatography基金项目山西省药材资源研究与药物研发重点科技创新平台（201705D151002-02）作者简介 李倩，工程师，Email：通讯作者 宁红婷，工程师，Email：中药五灵脂为鼯鼠科复齿鼯鼠的干燥粪便，生用活血散瘀，炒炭后有止血的作用1，临床上主要用于妇科疾病、心脑血管病、消化系统疾病。在山西、陕西部分地区，人工养殖复齿鼯鼠已初具规模2。在养殖过程中养殖户投喂饲料时混入氯霉素等抗生素，预防鼯鼠因细菌感染死亡，导致五灵脂中氯霉素残留。野生复齿鼯鼠主要生活在高海拔山区，于悬崖峭壁岩洞石缝中筑巢产便，洞口集中排粪。因此采集困难，野生资源极为短缺，为解决五灵脂药材的市场需求，在陕西商洛地区形成了规模性养殖鼯鼠基地，所以人工饲养鼯鼠生产五灵脂成为目前五灵脂药材的主要来源2。氯霉素是一种广谱抗生素，曾广泛应用于预防和治疗动物疾病3，氯霉素理化性质极为稳固，人体难免会出现因摄入食物引发的富集，高浓度药物残留可能诱发再生不良性贫血以及严重的中性粒细胞减少等疾病，即使是低浓度的药物残留也会影响致病菌的抗药性，从而对人体健康造成严重损害4-6。因此，欧美发达国家及我国农业部均做出明确规定在任何动物源食品、饲料、生长环境中禁用氯霉素且不得检出7。氯霉素残留检测方法主要有液质联用质谱法、微生物法、ELISA法、电泳法等8。但这些方法存在需要专业技术人员对样品预处理、操作大型检测精密设备等缺陷。基于抗原与抗体特异性结合的免疫学方法具有操作简单、检出限低和专属性强的优点，优胜于传统方法。2023 年第 24 卷第 7 期733中药制剂工程与技术733目前尚未见到有关于测定五灵脂中氯霉素残留的报道。因此，本研究采用免疫标记技术确立了一种快速测定氯霉素残留的方法，试纸条只需10min就可出结果，操作简单，费用低廉，为今后建立五灵脂质量标准，控制药材质量提供一定的参考依据。1 仪器与试剂CP213电子天平（美国奥豪斯），MS3圆周振荡器（IKA），HC-3018高速离心机（中科中佳），移液枪（Eppendorf），LC-Si固相萃取小柱（天津博纳艾杰尔科技有限公司，200mg/6ml，LOT：0170198），氯霉素快速检测卡力德力诺生物技术（北京）有限公司，批号：LDLN20171128A，氯霉素（德国Dr.Ehrenstorfer公司，41130，99.3%），甲砜霉素（农业部环境保护科研检测所，201706，100g/ml），氟甲砜霉素（农业部环境保护科研检测 所，201706，100g/ml）。除乙腈为色谱纯外、其余试剂均为分析纯。五灵脂药材购自陕西商洛市丹凤县。2 方法与结果2.1 配制对照品溶液分别取氯霉素、甲砜霉素以及氟甲砜霉素用乙腈多步稀释制得10g/ml浓度单位对照品乙腈溶液。注意低浓度对照品需要现用现配。2.2 制备供试品溶液取五灵脂药材粉碎并过3号筛，称取样品粉末5g，在塑料离心管中加入5ml试验用水涡旋1min使其分散均匀，再加入10ml乙酸乙酯涡旋振摇提取5min，8000r/min离心2min。再加入1g氯化钠和10ml正己烷涡旋1min、离心2min，弃去正己烷层，取乙酸乙酯层准备下一步的净化。用10%丙酮正己烷溶液5ml预淋洗LC-Si固相萃取小柱并弃去，乙酸乙酯样液过LC-Si固相萃取小柱，弃去不收集，最后再采用40%正己烷丙酮溶液5ml洗脱，将盛有洗脱液的比色管置于40氮吹仪上，氮吹蒸发至干，用磷酸盐缓冲液600 l复溶并在漩涡混合器上混合均匀，即得样品待测液9-10。2.3 测定步骤在检测卡上的样品添加孔中添加200 l待测的液滴，室温条件下反应5min，即可进行结果的观察判断。2.4 结果判定的要求主要由控制线以及检测线的颜色深度比较来确定结果。当控制线的颜色未显示时，表示操作错误或检测卡无效；而检测线的颜色未显色或比对照线的颜色浅时，则说明样品中有氯霉素检出，确定为阳性；检测线的颜色较对照线的颜色深，或颜色相近，说明样品中无氯霉素检出，确定为阴性9-10。目测结果判定的要求，结果见图1。2.5 性能指标考察取五灵脂阴性样品200份，分别加入氯霉素制成 为0g/kg、0.05g/kg、0.1g/kg和0.2g/kg各50份的待测样品，根据本方法预处理方法以及分析步骤分别进行考察9-11。结果见表1。2.6 交叉反应分别取甲砜霉素和氟甲砜霉素配制成乙腈标图 1 目测结果判定的要求表 1 性能指标计算表样品情况 a检验结果 b总数（份）阳性（份）阴性（份）阴性（0 g/kg）05050阳性（0.05g/kg）48250阳性（0.1 g/kg）50050阳性（0.2 g/kg）50050总数14852200灵敏度（p+）（要求 98%）0.05g/kgp+=（48/50）100%=96%0.1g/kgp+=（50/50）100%=100%0.2g/kgp+=（50/50）100%=100%特异性（p-）（要求 90%）0g/kgp-=（50/50）100%=100%假阴性率（pf-）（要求 1%）0.05g/kgpf-=（2/50）100%=4%0.1g/kgpf-=（0/50）100%=0%0.2g/kgpf-=（0/50）100%=0%假阳性率（pf+）（要求 15%）0g/kgpf+=（0/50）100%=0%相对准确度（要求 95%）（100+50）/150100%=100%注：a 代表样品实际加入的结果；b 代表用本方法检验所得的结果，灵敏度使用经过确认结果计算。2023 Vol.24 No.7734中药制剂工程与技术734准溶液，浓度为10ng/ml，并根据本方法研究试剂盒与这两种化合物之间的交叉反应11。所有结果均为阴性，表明这两种化合物和试剂盒之间没有交叉反应。结果见图2、图3。2.7 与参比方法一致性分析取五灵脂添加了3个浓度分别为0g/kg、0.1g/kg和0.2g/kg的待测样。其中20份是根据自行设计的方法的预处理和分析步骤确定结果。20份采用GB/T22338-2008动物源性食品中氯霉素残留量的测定12来确定结果。结果见表2。2.8 稳定性考察为了确保抗原和抗体的最佳反应，对解析后不同时间段、不同温度条件下的测定结果进行了研究。2.9 复溶溶液的选择取磷酸二氢钠0.06g、磷酸氢二钠3.58g置于两个50ml容量瓶中定容。取磷酸二氢钠溶液3.3ml、2.8ml、2.3ml、1.9ml，分别加入磷酸氢二钠溶液6.7ml、7.2ml、7.7ml、8.1ml，各自再加入氯化钠0.85g，分别定容至100ml，就可以得到pH值为7.1、7.2、7.3、7.4的复溶液13。复溶样品点板结果见图4、图5。3 讨 论如果采用纯水、磷酸盐缓冲液等水溶液系统来提取氯霉素，会导致提取液中的水溶性杂质也被提取出来，有可能会影响结果的准确性，所以不考虑使用水溶液系统。众所周知，氯霉素是一种极性比较适中的化合物，在甲醇、乙腈、乙酸乙酯中均有较高的溶解性。但是由于甲醇、乙腈能够与水互溶，也会有水溶性被提出来影响试验结果可能性，此外乙腈还有杂质沸点高、氮吹吹干时间长的缺点，因此甲醇、乙腈也不予采用。乙酸乙酯不具有亲水基团与水溶液萃取可以分层，能够在提取氯霉素的同时减少溶剂中蛋白质等水溶性的杂质，溶剂吹干只需要短短几分钟，故选用乙酸乙酯作为提取溶剂使用。在提取溶剂中加入氯化钠，可以起到盐析蛋白质、减少水分的作用，极大地提高提取效率。在提取时间的选择上，分别考察了1min、3min、5min、10min和20min的提取效果，发现提取时间5min以上的样品结果趋于稳定。考虑到时效性选择5min作为提取时间。净化过程中，在采用正己烷除脂后，增加了固相萃取的步骤，可以进一步提高样品的纯度。分别采用LC-Si硅胶小柱、C18固相萃取小柱进行试验，发现C18固相萃取小柱在试验中容易被样液堵塞、过柱耗时较长、试验很难进行下去；图 2 甲砜霉素图 3 氟甲砜霉素图 4 不同 pH 值复溶液复溶样品点板结果图图 5 不同 pH 值复溶液复溶加检出限浓度样品图表 2 五灵脂不同浓度样品检测方法一致性分析样品情况胶体金免疫层析法检验结果液相色谱-质谱法检验结果阳性阴性平均浓度（g/kg）回收率（%）阴性（0 g/kg）0200/阳性（0.1 g/kg）2000.09191阳性（0.2 g/kg）2000.19952023 年第 24 卷第 7 期735中药制剂工程与技术735LC-Si硅胶小柱样液通过则比较顺畅、效率得以提高，故选用LC-Si硅胶小柱。通过固相萃取浓缩富集后，还需要进行洗脱操作，洗脱液体积的选择分别考察了1ml、3ml、5ml、10ml体积的洗脱效率，发现淋洗体积大于5ml的样品结果比较稳定，考虑到时效性选择5ml作为洗脱体积。再对磷酸盐缓冲液复溶溶液的选择上，pH值7.17.4之间的PBS缓冲液均可得到满意结果。为了防止不同品牌的检测卡与本方法规定的复溶液不适应，也可以选择使用原试剂盒中的复溶液复溶。这次试验中设计考察复溶后放置0min、5min、10min、20min、30min、60min后再点板，结果发现没有显著的区别，此外对比了18、25、30、35、40下待测溶液点板后结果也没有明显差异。虽然时间和温度均未观测到对本试验明显的影响，但还是建议在制备完成后、室温条件下立即进行观测，以防止某些不确定因素的影响，提高效率。检出限的确认可以通过性能指标计算的结果得出。灵敏度要求98%、假阴性率要求1%，浓度0.05g/kg为96%、4%均不满足要求。而浓度为0.1g/kg以上的样液灵敏度均可达到100%、假阴性率0%满足了相关要求。参考国标GB/T22338-2008动物源性食品中氯霉素残留量的测定 的内容，最终选定0.1g/kg作为本方法的检出限8。氯霉素和甲砜霉素以及氟甲砜霉素三者都属于氯霉素类的抗生素，但是后两者为氯霉素的衍生物，毒性较小，可以作为兽药使用。因此在交叉反应中予以考察，避免结果误判，保证方法的特异性。本试验建立人工养殖复齿鼯鼠所产五灵脂中氯霉素的胶体金免疫层析快速检测方法，灵敏度、特异性等指标都能达到相关标准要求。本研究建立了一种快速检测五灵脂中氯霉素残留的胶体金免疫层析法，进而避免了因氯霉素残留的五灵脂的流通引发人们的健康隐患，保证了用药安全。参考文献1 中华人民共和国卫生部.中华人民共和国药典：一部M.北京：人民卫生出版社，1990：502 王岚，李春，杨连菊，等.野生与家养五灵脂药效学比较研究J.中国实验方剂学杂志，2013，19（7）：268-271.3 国家药典委员会.中华人民共和国药典：二部M.北京：中国医药科技出版社，2020：1660.4 陈秋玲，李仁焕.水产品中氯霉素残留检测技术综述J.养殖与饲料，2021，20（8）：56-57.5 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