灵芝提取物通过抑制miR-143-3p保护Aβ25-35处理PC12细胞损伤的机制研究.pdf

论著202J Clin Neurol,June 2023,Vol.36,No.3灵芝提取物通过抑制miR-143-3p保护A25-3s处理PC12细胞损伤的机制研究尹志鹏，吴玲玲，陈光东【摘要】目的探究灵芝提取物通过抑制miR-143-3p对-淀粉样蛋白（A25-35）诱导的PC12细胞损伤的影响。方法使使用2 0 mol/L的A25-3s处理PC12细胞用于建立体外Alzheimers病模型，细胞分为空白组（未经A25-3s处理细胞）、模型组（经过A25-3s处理细胞2 4h）、低剂量组（2.5mg/L灵芝提取物和A25-35处理细胞2 4h）、中剂量组（5.0 mg/L灵芝提取物和A25-3s处理细胞2 4h）、高剂量组（10 mg/L灵芝提取物和A25-35处理细胞2 4h）、mi R-NC+高剂量组（转染miR-NC后，使用10 mg/L灵芝提取物和A25-35处理细胞2 4h）、mi R-143-3p+高剂量组（转染miR-143-3p后，使用10 mg/L灵芝提取物和A25-3s处理细胞2 4h）。用噻唑蓝检测细胞增殖活性；流式细胞术检测细胞凋亡；WesternBlotting法检测剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved-caspase-3）、Bc l-2 相关X蛋白（Bax蛋白）的表达;ELISA检测丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性、A、T NF-、IL-6 水平；实时定量RT-PCR（q RT-PCR）检测miR-143-3p表达水平。结果与空白组相比,模型组细胞活性、SOD活性、CAT活性显著降低，调亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表达、Bax蛋白表达、MDA含量、A、T NF-、IL-6 水平以及miR-143-3p表达水平显著增加（均P0.05）。与模型组相比,低剂量组、中剂量组、高剂量组细胞活性、SOD活性、CAT活性显著增加，调亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表达、Bax蛋白表达、MDA含量、A、T NF-、IL-6 水平以及miR-143-3p表达水平显著降低（均P0.05）。与miR-NC+高剂量组相比，miR-143-3p+高剂量组miR-143-3p表达水平、Cleaved-caspase-3、Ba x 蛋白表达、调亡率、MDA含量、A、T NF-、IL-6 水平显著增加,细胞活性、SOD活性、CAT活性显著降低(均P0.05)。结论灵芝提取物可能通过下调miR-143-3p减弱A25-35诱导的神经细胞凋亡、氧化应激和炎症反应。【关键词】灵芝提取物；miR-143-3p；A l z h e i m e r s 病；神经细胞【中图分类号】R749.16【文献标识码】A【文章编号】10 0 4-16 48(2 0 2 3)0 3-0 2 0 2-0 6Mechanism of Ganoderma lucidum extract protecting A25-35 from PC12 cell injury by inhibiting miR-143-3pYIN Zhi-peng,WU Ling-ling,CHEN Guang-dong.Department of Psychiatry,Wenzhou Seventh People s Hospital,Wenzhou 325000,ChinaAbstract:Objective To explore the effect of Ganoderma lucidum extract on PC12 cell damage induced by-amyloid protein(A25-35)by inhibiting miR-143-3p.Methods PC12 cells were treated with 20 mol/L AB25-3s toestablish an in vitro Alzheimers disease model.The cells were divided into blank group(cells not treated withA25-35),model group(cells treated with A25-35 for 24 h),Low-dose group(cells were treated with 2.5 mg/LGanoderma lucidum extract and A25-3s for 24 h),medium-dose group(cells were treated with 5.0 mg/L Ganodermalucidum extract and A25-3 for 24 h),high-dose group(cells were treated with 10 mg/L Ganoderma lucidum extractand A25-3s for 24 h),miR-NC+high-dose group(after transfection of miR-NC,cells were treated with 10 mg/LGanoderma lucidum extract and A25-35 for 24 h),miR-143-3p+high-dose group(after transfection of miR-143-3p,cells were treated with 10 mg/L Ganoderma lucidum extract and A253s for 24 h).Cell proliferation activity wasdetected by thiazolyl blue;cell apoptosis was detected by flow cytometry;Western blotting was used to detect theexpression of cleaved cysteine-containing aspartate protease 3(Cleaved-caspase-3),Bcl-2-related X protein(Baxprotein);ELISA was used to detect malondialdehyde（M D A)c o n t e n t,s u p e r o x i d e d i s mu t a s e (SO D)a c t i v i t y,catalase(CAT)activity,A,TNF-,IL-6 levels;quantitative real-time RT-PCR(qRT-PCR)was used to detectmiR-143-3p expression levels.ResultsCompared with the blank group,the cell activity,SOD activity and CATactivity in the model group were significantly decreased,and the apoptosis rate,Cleaved-caspase-3 protein,Bax基金项目：温州市科技局课题（Y20210507）作者单位：32 50 0 0 温州市第七人民医院精神科203临床神经病学杂志2 0 2 3年第36 卷第3期protein,MDA content,A,TNF-,IL-6 levels,and miR-143-3p expression level were significantly increased(allP0.05).Compared with the model group,the cell activity,SOD activity,and CAT activity in the low-dose group,middle-dose group,and high-dose group were significantly increased,apoptosis rate,Cleaved-caspase-3 proteinexpression,Bax protein expression,MDA content,A,TNF-,IL-6 levels,and miR-143-3p expression levels weresignificantly decreased(all P0.05).Compared with miR-NC+high-dose group,the expression level of miR-143-3p,Cleaved caspase-3,Bax protein expression,apoptosis rate,MDA content,A,TNF-,and IL-6 levels in themiR-143-3p+high-dose group were significantly increased,Cell activity,SOD activity and CAT activity weresignificantly decreased(all P0.05).Conclusion Ganoderma lucidum extract may attenuate neuronal apoptosis,oxidative stress and inflammation induced by A25-3s by down-regulating miR-143-3p.Key words:Ganoderma lucidum extract;miR-143-3p;Alzheimers disease;nerve cellsAlzheimers病（AD）又被称为“老年痴呆”,是一种不可逆的神经系统退行性疾病，随着老龄化社会的到来成为全球范围内日益严重的健康问题，对人们生活社交、工作等带来严重不利的影响。AD典型病理因素有-淀粉样蛋白（A）斑块沉积、神经元纤维缠结,经过A、过度磷酸化tau作用神经突触，可使神经元功能丧失或死亡2 。灵芝药用价值历史悠久，具有补气安神、止咳平喘的功效，常用于治疗心神不宁、失眠心悸、咳嗽痰多等疾病，药理活性效果也比较明显3。灵芝提取物对帕金森病有治疗作用,能抑制1-甲基4-苯基-吡啶离子诱导的小鼠神经瘤细胞自噬4。还有研究5 显示,灵芝醇提取物能改善AD模型大鼠/小鼠的学习和记忆功能，抑制神经元细胞凋亡。关于灵芝提取物对AD细胞模型的研究相对较少。研究6 显示,在AD细胞模型中miR-143-3p表达上调，抑制miR-143-3p可减弱A142诱导的人神经母细胞瘤细胞凋亡。然而，灵芝提取物能否通过调控miR-143-3p延缓AD神经细胞损伤尚不清楚。本研究使用A25-3s诱导神经细胞PC12建立AD细胞模型，探究灵芝提取物是否能通过miR-143-3p影响A25-3s诱导的神经细胞调亡、氧化应激和炎症反应。1材料与方法1.1细胞和主要试剂神经细胞PC12购自中国科学院上海细胞细胞库；胎牛血清、杜氏改良依格尔培养基(DMEM）高糖培养基购自美国HyClone公司；A25-3s购自美国Sigma公司；miR-NC、mi R-143-3pmimic、引物由广州锐博生物科技有限公司设计合成；Lipofectamine2000试剂盒购自上海研卉生物科技有限公司；噻唑蓝（MTT）试剂盒、凋亡试剂盒、二喹啉甲酸（BCA）试剂盒、电化学发光（ECL）购自北京索莱宝生物科技有限公司；剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved-caspase-3）抗体、Bcl-2相关X蛋白（Bax蛋白）抗体、肌动蛋白（-actin）抗体购自购自美国Cell SignalingTechnology公司；丙二醛（M D A）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、过氧化氢酶（CAT)试剂盒、A试剂盒购自南京建成生物工程研究所;TNF-试剂盒、IL-6试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司；TRIzol试剂盒、miRNA逆转录试剂盒、SYBRPremixExTaq试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司。灵芝由本院药剂科提供,具体提取方法参考文献7 1.2方法1.2.1细胞培养和分组PC12细胞常规复苏后置于5%CO2、37 恒温培养箱中进行培养，细胞培养基内含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养液。取对数期PC12细胞接种9 6 孔板中，然后使用2 0 mol/L的A25-35处理PC12细胞2 4h建立AD细胞模型,用未经A25-35处理细胞作为空白组；使用灵芝提取物浓度为2.5mg/L、5.0 m g/L、10 m g/L和2 0 mol/L的A25-35处理细胞2 4h,记为低剂量组、中剂量组、高剂量组；按脂质体法将转染miR-NC、m i R-143-3p m i m i c转染细胞后,用10 mg/L灵芝提取物和2 0 mol/L的A25-3s处理细胞2 4h;记为miR-NC+高剂量组、miR-143-3p+高剂量组。细胞转染时按Lipofectamine2000试剂盒操作进行。1.2.2MTT检测细胞增殖取对数期PC12细胞接种9 6 孔板中,按1.2 法处理细胞,培养2 d后,每孔中加人2 0 lMTT试剂，继续反应5h倒掉培养液，每孔中加150 l二甲基亚砜（DMSO)试剂,置于酶标仪57 0 nm处检测细胞吸光度值（A）。1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡取各组PC12细胞加胰酶消化细胞收集细胞上清，加1BindingBuffer制备细胞悬液，依照凋亡试剂盒说明书，加磷脂结合蛋白V（A n n e x i n V）-FI T C和碘化丙啶（PI）试剂5l,避光反应15min，上流式细胞仪检测细胞调亡。1.2.4Western Blotting 法检测 Cleaved-caspase-3、Bax蛋白的表达取各组PC12细胞加放射免疫沉淀（RI PA）裂解液，反应30 min，BCA 法检测定量蛋白浓度，取35g上样蛋白进行12%SDS-PACE凝胶处J Clin Neurol,June 2023,Vol.36,No.3204理，转膜，5%脱脂奶粉封闭培养2 h，加Cleaved-caspase-3（稀释1:8 0 0）、Bax（稀释1:8 0 0）、-actin（稀释1:10 0 0），4孵育过夜，次日加带有标记的二抗（稀释1:50 0 0）室温孵育2 h,加ECL显色，曝光。使用ImageJ软件分析蛋白灰度值。1.2.5ELISA法检测MDA含量、SOD活性、CAT活性、A、T NF-、IL-6 水平耳取各组PC12细胞使用PBS清洗2 次，12 0 0 0 r/min离心5min取上清液，按照试剂盒操作步骤进行，检测MDA含量、SOD活性、CAT活性、A、T NF-、IL-6 水平。1.2.6实时定量RT-PCR（q RT-PCR）检测miR-143-3p表达水平取各组PC12细胞按TRIzol法提取细胞中RNA，测定RNA浓度，严格遵守miRNA逆转录试剂盒操作步骤合成cDNA，然后配置反应体系为1l cDNA,正反引物各0.5l,10l SYBR PremixExTaq,8lddH,O,共2 0 l,在PCR仪器上进行扩增。以U6为内参基因,采用2-ACt法计算miR-143-3p表达水平。1.2.7统计学方法使用SPSS18.0统计学软件来处理本研究相关数据,结果以均数标准差(xs)表示，多组间比较使用单因素方差分析，两组间比较使用t检验。以P0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1不同浓度的灵芝提取物对A25-35诱导的PC12细胞活性及调亡的影响见图1、表1。与空白组相比,模型组细胞增殖活性显著降低（P0.05），凋亡率显著增加(P0.05);与模型组相比,低剂量组、中剂量组及高剂量组细胞增殖活性均显著增加（均P0.05），而凋亡率均显著降低（均P0.05）。空白组模型组低剂量组中剂量组高剂量组104104104104T10310元103103103102102102102102PI101-10-10101101-100100100100100100101102103104100101102103104100101102103104100101102103104100101102103104AnnexinV-FITC图1流式细胞仪检测细胞凋亡表1不同浓度灵芝提取物对A25-35诱导的PC12细胞活性及凋亡的影响(xs,n=9)组别细胞活性（A值）调亡率(%）空白组1.125 0.106.12 0.51模型组0.634 0.04*24.35 1.85*低剂量组0.751 0.06#19.53 1.36#中剂量组0.926 0.08#12.02 1.02#高剂量组1.056 0.10#8.69 0.73#F值60.017367.026P值0.0000.000注：与空白组比较*P0.05与模型组比较P0.052.2不同浓度灵芝提取物对A25-3s诱导的PC12细胞中Cleaved-caspase-3、Ba x 蛋白的表达影响见图2、表2。与空白组相比，模型组Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达显著增加（均P0.05）；与模型组相比，低剂量组、中剂量组、高剂量组Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达显著降低（均P0.05）。2.3不同浓度灵芝提取物对A25-35诱导的PC12细胞培养上清液中MDA含量、SOD活性及CAT活性的影响见表3。与空白组相比，模型组MDA含量显空白组Cleaved-caspase-331 kDa-actin42kDaBax21 kDa-actin42kDa图2Westernblotting法检测细胞中Cleaved-caspase-3、Ba x 蛋白的表达著增加（P0.05）,SO D 活性及CAT活性显著降低（均P0.05）；与模型组相比，低剂量组、中剂量组、高剂量组MDA含量显著降低（均P0.05）,SO D 活性及CAT活性显著增加（均P0.05）。2.47不同浓度灵芝提取物对A25-35诱导的PC12细胞A和TNF-、I L-6 水平的影响见表4。与空白组相比,模型组A、T NF-、IL-6 水平均显著增加（均P0.05）；与模型组相比，低剂量组、中剂量组、高剂量组A、T NF-、IL-6 水平均显著降低（均P0.05）。205临床神经病学杂志2 0 2 3年第36 卷第3期表2不同浓度灵芝提取物对A25-35s诱导的PC12细胞中Cleaved-caspase-3、Ba x 蛋白的表达影响(xs,n=9)组别Cleaved-caspase-3Bax空白组0.45 0.040.31 0.03模型组0.89 0.08*0.73 0.07*低剂量组0.72 0.07#0.61 0.06#中剂量组0.56 0.05#0.49 0.04#高剂量组0.44 0.04#0.35 0.03#F值97.597116.924P值0.0000.000注：与空白组比较*P0.05；与模型组比较P0.05表3不同浓度灵芝提取物对A25-35诱导的PC12细胞培养上清液中MDA含量、SOD活性及CAT活性的影响(xs,n=9)组别MDA(mol/g)SOD(U/mg)CAT(U/mg)空白组16.25 1.0212.36 1.0210.24 0.91模型组35.27 3.15*5.11 0.42*4.57 0.39*低剂量组31.38 2.13#6.38 0.51#6.91 0.52#中剂量组24.24 1.86#8.96 0.75#8.61 0.76#高剂量组18.53 1.42#11.35 0.96#9.83 0.91#F值142.176146.91991.847P值0.0000.0000.000注：与空白组比较*P0.05；与模型组比较P0.052.5不同浓度灵芝提取物对miR-143-3p表达的影响见表5。与空白组相比，模型组miR-143-3p表达水平显著增加,差异有统计学意义（P0.05）；与模型组相比，低剂量组、中剂量组、高剂量组miR-143-3p表达水平显著降低，差异有统计学意义（均P0.05)。2.6miR-143-3p可以逆转灵芝提取物对A25-35介导的PC12细胞损伤和炎症反应见图3、表6。与miR-NC+高剂量组相比，miR-143-3p+高剂量组miR-143-3p表达水平显著增加（P0.05），Cl e a v e d-caspase-3、Ba x 蛋白表达、调亡率、MDA含量显著增加（均P0.05），细胞活性、SOD活性、CAT活性显著降低（均P0.05），A、T NF-、IL-6 水平显著增加（均P0.05)表4不同浓度灵芝提取物对A25-35诱导的PC12细胞培养上清中A和TNF-、IL-6 水平的影响(x s,n=9)组别A(ng/L)TNF-(ng/L)IL-6(ng/L)空白组235.21 18.0254.21 4.6825.35 2.07模型组402.5632.55*125.94 9.36*73.65 6.14*低剂量组364.94 28.35#102.43 8.73#61.35 5.32#中剂量组281.35 22.59#71.59 6.28#42.69 3.25#高剂量组218.64 19.26#60.35 4.38#28.94 2.17#F值94.933170.048227.185P值0.0000.0000.000注：与空白组比较*P0.05；与模型组比较P0.05表5不同浓度灵芝提取物对miR-143-3p表达的影响(x s,n=9)组别miR-143-3p空白组1.00 0.10模型组3.25 0.26*低剂量组2.91 0.24#中剂量组2.18 0.18#高剂量组1.32 0.11#F值237.789P值0.000注：与空白组比较*P0.05；与模型组比较*P0.05miR-NC+高剂量组miR-NC+高剂量组104Cleaved-31 kDacaspase-3103103-actin42kDa102102PI101101Bax21kDa100100100101102103104100101102 103104-actin42kDaAnnexinV-FITC图3miR-143-3p可以逆转灵芝提取物对A25-35介导的PC12细胞凋亡和相关蛋白表达A：流式细胞仪检测细胞凋亡;B：W e s t e r n b l o t t i n g 检测Cleaved-caspase-3Bax表达J Clin Neurol,June 2023,Vol.36,No.3206表6miR-143-3p可以逆转灵芝提取物对A25-35介导的PC12细胞损伤和炎症反应(xS,n=9)组别miR-143-3pCleaved-caspase-3Bax细胞活性（A值）凋亡率(%)miR-NC+高剂量组1.00 0.100.45 0.040.34 0.031.058 0.118.65 0.71miR-143-3p+高剂量组2.69 0.170.89 0.080.75 0.070.612 0.0523.51 1.98t值25.70614.75816.15111.07321.194P值0.0000.0000.0000.0000.000组别MDA(mol/g)SOD(U/mg)CAT(U/mg)A(ng/L)TNF-(ng/L)IL-6(ng/L)miR-NC+高剂量组18.51 1.5311.31 1.039.85 0.83218.71 16.5360.29 5.2828.91 2.09miR-143-3p+高剂量组35.69 2.625.24 0.414.51 0.41422.69 32.14147.63 9.6879.16 7.04值16.98716.42617.30516.93223.76320.528P值0.0000.0000.0000.0000.0000.0003讨论AD患者伴随着出现学习、记忆及认知功能减退,对患者生活带来严重不便8 。A是AD发病机制中的起始因素和关键环节，A在大脑中的过量产生和沉积可引起神经细胞凋亡、氧化应激和炎症等一系列反应，导致神经元受损并引起学习记忆障碍9 。MDA是脂质氧化产物,与抗氧化酶（SOD、CA T 等）共同维持细胞氧化应激水平10 。TNF-、IL-6 是典型的炎性指标，当AD患者认知功能受到损伤时,TNF-、IL-6 处于较高水平 。在本研究中,使用 A2535处理神经细胞后,细胞活性、SOD活性及CAT活性均降低，同时细胞调亡率、MDA含量、Cleaved-caspase-3、Ba x 蛋白表达增加，且A和TNF-、I L-6 水平升高，表明A25-35诱导神经细胞出现调亡、氧化应激和炎症反应，提示AD细胞模型构建成功。灵芝作为中国传统医药，是一种药食同源的多用途植物,具有抗炎、抗氧化、抗溃疡、降低血糖等药理作用12-13。研究14 发现,灵芝提取物可通过提高肝组织的抗氧化能力，对酒精性肝损伤小鼠发挥保护作用。灵芝提取物能减缓1-甲基4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶诱导的神经元细胞调亡和自噬，并保护多巴胺能神经元免受氧化应激损伤15。此外，灵芝多糖和水提取物能改善AD小鼠的认知功能，延缓AD发展16 。以上研究表明灵芝提取物是治疗AD的潜在药物。但是关于灵芝提取物对A25-35诱导神经细胞损伤不清楚。在本研究中，灵芝提取物可增强A25-35诱导的神经细胞细胞活性、SOD活性及CAT活性，降低调亡率、MDA含量、Cleaved-caspase-3、Ba x 蛋白表达,以及A和TNF-、IL-6 水平,表明灵芝提取物可抑制A25-35诱导的神经细胞调亡、氧化应激和炎症反应，提示灵芝提取物能抑制A25-35诱导的神经细胞损伤。miRNAs由18 2 5个非编码保守单链分子组成，通过靶向mRNA降解或抑制翻译来调控靶基因的表达,参与调控多种生物学行为。先前的研究表明,在AD的进展过程中，miRNA发挥了重要作用。例如，抑制miR-331-3p和miR-9-5p可通过增强自噬促进A斑块的清除,改善AD小鼠的认知功能17 ；miR-126a-3p在海马齿状回中的过表达可以减少A斑块面积和神经炎症，并可以挽救APP/PS1小鼠的海马记忆缺陷(18 。最近的研究(6 19.0 发现，miR-143-3p是一种在AD的诊断和治疗中具有重要价值的miRNA,据报道,miR-143-3p在AD患者的血清中上调，下调miR-143-3p可促进体外AD细胞模型中的神经元存活，是AD的潜在治疗靶点。在本研究中，A25-3s诱导的神经细胞中miR-143-3p表达上调，这与既往的研究6.19-2 0 结果一致；灵芝提取物可显著下调miR-143-3p表达，提示miR-143-3p可能与灵芝提取物能抑制A25-3s诱导的神经细胞损伤有关。为了进一步验证灵芝提取物对A25-35诱导的神经细胞损伤的保护机制是否与miR-143-3p有关，本研究在灵芝提取物处理A25-35诱导的神经细胞损伤的基础上，采用miR-143-3pmimic转染来上调miR-143-3p表达。结果显示，过表达miR-143-3p可逆转灵芝提取物对A25-3s诱导的神经细胞调亡、氧化应激和炎症反应的作用，提示灵芝提取可通过下调miR-143-3p减缓A25-35诱导的神经细胞损伤。综上所述,灵芝提取物能抑制A25-35诱导的神经细胞凋亡、氧化应激和炎症反应,其作用机制可能与下调miR-143-3p的表达有关。在未来的研究中将对miR-143-3p的下游靶基因进行分析，并结合体内实验深人验证灵芝提取物对AD的治疗作用与分子机制。参考文献1 Lane CA,Hardy J,Schott JM.Alzheimers diseaseJ.Eur J Neu-rol,2018,25(1):59-70.2王金春,刘慧影,曹云鹏.tau蛋白与阿尔茨海默病J.中国组织工程研究，2 0 2 0,2 4（17）：2 7 7 5-2 7 8 1.下转第2 15页）【中图分类号】R512.3【文章编号】10 0 4-16 48（2 0 2 3)0 3-0 2 0 7-0 2【文献标识码】D病例报告（收稿日期2 0 2 2-0 6-14修回日期2 0 2 2-0 7-19）207临床神经病学杂志2 0 2 3年第36 卷第3期3苏保洲.灵芝的现代临床应用探索J.现代中西医结合杂志，2019,28(5):567-570.4丁晖,蔡彦宁，陈彪.灵芝提取物对MPP+诱导的Neuro-2a细胞自噬的影响J.首都医科大学学报，2 0 19,40（4)：59 6-6 0 1.5 Lai GX,Guo YR,Chen DL,et al.Alcohol extracts from Ganodermalucidum delay the progress of Alzheimer s disease by regulatingDNA methylation in rodents J.Front Pharmacol,2019,10:272.6 Sun CY,Jia N,Li R,et al.miR-143-3p inhibition promotes neuronalsurvival in an Alzheimer s disease cell model by targeting neuregu-lin-1J.Folia Neuropathol,2020,58(1):10-21.7】刘星含，许玉君，厉怡，等.灵芝提取物对4种人肿瘤细胞生长的抑制作用及机制研究J.中国免疫学杂志，2 0 2 0,36（2 4）：2976-2980.8 Villain N,Dubois B.Alzheimer s disease including focal presenta-tionsJ.Semin Neurol,2019,39(2):213-226.9 Youn K,Lee S,Jun M.Discovery of nobiletin from citrus peel as apotent inhibitor of-amyloid peptide toxicity J.Nutrients,2019,11(11):2648.10 Prie BE,Iosif L,Tivig I,et al.Oxidative stress in androgenetic alope-ciaJ.J Med Life,2016,9(1):79-83.11 Ng A,Tam WW,Zhang 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Bioelectron,2020,170:112710.血常规：WBC1710/L,CSF压力正常，镜检单个细胞9 0%，白细胞计数110 10/L。诊断：CNS感染。给予抗病毒等治疗，患者眼痛、头痛等症状减轻后出院。出院后规律口服抗病毒药物，但仍有眼痛、头痛症状，为求进一步诊治收人我院治疗。既往体健。个人史：自诉有性生活史，否认性病、治游史，未婚。月经史：平素月经规律，月经量中等，颜色正常，无痛经，白带无异常，无瘙