类球红细菌基因组密码子偏好性分析.pdf

Vol.9 No.3Jun.2023生物化工Biological Chemical Engineering第 9 卷 第 3 期2023 年 6 月文章编号：2096-0387（2023）03-04类球红细菌基因组密码子偏好性分析张艳艳1,2，江贤章1,2*（1.福建师范大学 生命科学学院，福建福州 350117；2.工业微生物发酵技术国家地方联合工程研究中心，福建福州 350117）摘 要：密码子偏好性可影响外源基因在其体内的表达，为了解类球红细菌的密码子使用模式，本研究利用 CodonW 对类球红细菌 2.4.1 的基因组进行分析。结果显示，类球红细菌密码子的使用偏好性主要受选择压力的影响，在类球红细菌使用频率较高的 27 个密码子中，其中 GC 结尾的密码子占 85.19%。同时确定了 15 个高表达优越密码子，除终止密码子外，其余都以 GC结尾，表明类球红细菌中的密码子使用偏向于 GC 结尾的同义密码子。类球红细菌与大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌的密码子在使用偏好性上差别较小，与酿酒酵母的差异相对较大。本研究对开发类球红细菌基因表达宿主以及提高外源基因在类球红细菌中的表达提供理论基础。关键词：类球红细菌；密码子偏好；最优密码子中图分类号：Q939.9 文献标志码：AAnalysisofCodonUsageBiasintheGenomeofRhodobacter sphaeroidesZHANG Yanyan1,2,JIANG Xianzhang1,2*(1.College of Life Science,Fujian Normal University,Fuzhou 350117,China;2.National Joint Engineering Research Center of Industrial Microbiology and Fermentation Technology,Fuzhou 350117,China)Abstract:The codon preference may affect the expression of foreign genes.To understand the codon usage pattern of R.sphaeroides,CodonW is used to analyze the genome of R.sphaeroides 2.4.1.The results show that the codon usage bias of R.sphaeroides is mainly affected by the selective pressure.Among the 27 codons frequently used by R.sphaeroides,the codons ending at GC accounted for 85.19%.In addition,fifteen high-expression superior codons are determined,among which,except for the stop codon,the rest of the codons all ended with GC.The analysis also show that the codon usage bias in R.sphaeroides is similar to that in Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum while it is relatively different from that in Saccharomyces cerevisiae.This study provides a theoretical basis for developing efficient hosts for gene expression in R.sphaeroides species as well as improving the expression of foreign genes in R.sphaeroides.Keywords:Rhodobacter sphaeroides;codon usage bias;optimal codons密码子是核苷酸三联体，而遗传密码是指遗传物质存储遗传信息的生化指令，由 64 个密码子组成。遗传密码具有简并性，所有的氨基酸都由 2 6 个密码子以不同的使用频率进行编码（色氨酸和甲硫氨酸除外），这种现象被称为密码子使用偏倚1。这种密码子使用的差异在使蛋白质序列保持一致的同时，也可以调节蛋白质生产的效率与准确性2。造成密码子使用差异的影响因素有很多，如自然选择（tRNA丰度、蛋白质折叠、基因长度等）、突变压力（包括 GC 含量和碱基的突变位置）以及随机遗传漂变。密码子使用偏倚在预测外源基因的最佳宿主方面具有重要作用，可通过密码子优化来提高外源基因的表达水平3。基金项目：福建省自然科学基金项目（2020J01177）。作者简介：张艳艳（1996），女，甘肃陇西人，硕士，研究方向为工业微生物利用。通信作者：江贤章（1980），男，福建福州人，博士，副教授，研究方向为工业微生物遗传育种。E-mail：。84生物化工2023 年类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）属于紫色非硫细菌，是目前研究最深入的光合微生物之一，可以产生辅酶 Q10 等，已被广泛应用于食品、农业、医药等多个领域，拥有巨大的工业化开发潜力4。同时，类球红细菌经常被用来表达外源蛋白，广泛应用于基因表达研究中。本研究以 R.sphaeroides 基因组为研究对象，对其密码子使用偏好性进行分析，对在类球红细菌中开展合成生物学研究、改造基盘细胞、表达外源基因等具有重要的意义。1 对象与方法 1.1 数据检索与处理在NCBI（美国国家生物信息中心，https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/）公共数据库中检索获得类球红细菌 2.4.1 基因组，基因组数据编号 GCA_000012905.2。主要使用的软件有Galaxy生物信息学分析平台（https:/usegalaxy.org/）、Python 3.9、CodonW 1.4.2、Origin 9.0等。1.2 ENC-pot 与 PR2-plot 分析利 用 Galaxy 的 脚 本 过 滤 长 度 小 于 300 bp 的CDS，收集到 3 921 个 CDS。利用中性图估计和表征 3 个密码子（GC1、GC2、GC3）位置之间的密码子使用模式。以 ENC 为纵坐标，GC3 为横坐标绘制 ENC-plot 进行分析。以 G3/（G3+C3）为横坐标，A3/（A3+T3）为纵坐标绘图分析5。中心点代表无偏度使用时密码子的状态，其余点与中心点的矢量距离代表其偏倚程度和方向6。1.3 高表达密码子分析RSCU（同义密码子相对使用度）代表一个密码子的实际使用频率与无偏好性时理论使用频率间的比值。运用 CodonW 1.4.2 软件分析相对同义密码子使用度，将 RSCU 1 的密码子作为高频密码子7。根据 ENC 值的大小，取两极（最大值和最小值）10%的基因建立高、低表达基因库，计算两库的差值，将RSCU 0.08 的密码子视为高表达优越密码子8。结合统计结果筛选 RSCU 1 且 RSCU 0.08 的密码子确定为最优密码子9。1.4 密码子偏好性比较利用 CodonW 分别计算类球红细菌与常见的基盘微生物，如大肠杆菌（Escherichia coli）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）以及酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的密码子使用频率并进行比较。2 结果与分析 2.1 密码子中性分析构建了类球红细菌2.4.1基因组编码序列的中性图，结果显示多数基因分布在对角线下方（图 1）。GC12的含量分布在 0.389 0.741 2，GC3 的含量分布在0.411 0.957，基因大多分布在对角线下方，密码子中GC12 和 GC3 之间相关系数 r 为 0.128 5。结果表明类球红细菌基因组密码子受到突变的影响很弱，而自然选择压力是导致密码子偏好性产生的主要原因。y=-0.095 1x+0.509 4r=0.128 5图 1 中性绘图分析2.2 ENC-plot 分析密码子偏好性由图 2 可知，大部分基因的 ENC 观察值落在曲线下方，偏好性显著，表明类球红细菌密码子的偏好性主要受自然选择压力的影响。为更准确地估计观测 ENC 值和期望值之间的偏差，计算了（ENCexp-ENCobs）/ENCexp，结果发现 ENC 值略小于 GC3s 的图 2 ENC-plot 曲线第 3 期85张艳艳等：类球红细菌基因组密码子偏好性分析预期 ENC 值，说明突变可能是类球红细菌 2.4.1 进化史上的一个影响较弱的因素，自然选择压力可能在影响密码子使用模式中发挥重要作用。2.3 PR2-plot 分析利用 PR2-plot 绘图分析了类球红细菌 2.4.1 基因中氨基酸家族中密码子第三位碱基 A 与 T 或 G 与C 之间的关系，结果如图 3 所示，大部分基因分布在图的右上方（直线表示中位数），表明密码子第 3 位 A的使用频率高于 T，G 的使用频率高于 C。理论上，如果密码子的使用模式仅受到突变的影响，则A与T、G 与 C 碱基使用频率相等。然而，图 3 结果显示 A 和T、G 和 C 的使用存在不均衡，表明类球红细菌 2.4.1基因组密码子的使用模式除了受到突变的影响外，还可能受到其他因素，如选择压力等的影响。图 3 PR2-plot 分析2.4 最优密码子分析为了分析类球红细菌 2.4.1 基因组中不同氨基酸的相对密码子的使用度，确定同义密码子的使用模式以及 C/G 末端密码子的首选程度，本实验计算了 RSCU 值，绘制了 RSCU 堆积图（图 4）。分析表明 RSCU 1 的密码子有 27 个，其中 G 或 C 结尾的密码子占 85.19%，以 G 结尾的有 10 个，以 C 结尾的有 13 个，说明类球红细菌偏爱使用以 G 或 C 结尾的同义密码子。以 ENC 值为偏好性标准，构建高、低表达库，分别计算高表达和低表达基因中各密码子的 RSCU 值和 RSCU 值，结果发现 RSCU 值 0.3 的共有 19 个密码子是高表达优越密码子。选取高表达优越密码子与高频密码子结合分析，将其共有的密码子定义为最优密码子，共有 15 个（CUC、CUG、AUC、GUG、CCG、ACC、GCC、CAG、AAC、AAG、GAC、GAG、UGC、UGA 和 GGC）。在这 15个最优密码子中，除了 UGA 是终止密码子外，其余密码子全都以 G 或 C 结尾，进一步表明了类球红细菌中的密码子使用偏向于 G 或 C 结尾的同义密码子。2.5 与其他基盘微生物密码子偏好性的比较将类球红细菌基因组密码子使用频率分别与常见的基盘微生物，如大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌及酿酒酵母的密码子使用频率进行比较，结果发现大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌中分别有 27 个和 26 个密码子使用频率与类球红细菌 2.4.1 密码子使用频率差异倍数大于 2 或者小于 1/2，而密码子使用频率差异倍数大于 3 或者小于 1/3 的密码子分别有 16 个（占 25.0%）和 17 个（占 26.6%）。以类球红细菌为基盘细胞，表达来自大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌的基因时，需注意图 4 相对密码子使用堆积图86生物化工2023 年对 Glu、Arg、Pro、Ser 以及 Gly 等几个氨基酸密码子的优化。酿酒酵母中有 38 个密码子的使用频率与类球红细菌密码子使用频率差异倍数大于 2 或者小于 1/2（占 59.4%），有 27 个密码子的使用频率差异倍数大于 3 或者小于 1/3（占 42.2%），有 9 个密码子使用频率差异倍数大于 10 或者小于 1/10。结果说明类球红细菌与酿酒酵母的密码子使用频率差异较大，在表达类球红细菌中表达来自酿酒酵母的基因时，需要考虑整体密码子偏好性对基因表达的影响，反之亦然。3 结论随着合成生物学的兴起，在基盘细胞中表达多个外源基因，构建新的代谢通路，调控关键基因的表达水平，成为合成生物学研究的主要方向。类球红细菌具有重要的开发前景，因此研究类球红细菌密码子使用偏好性，对人工合成外源基因，使之在类球红细菌中高效地表达，具有重要的意义。本文通过对类球红细菌基因组进行分析，发现在类球红细菌使用频率较高的 27 个密码子中，以 G 或 C 结尾的密码子占85.19%。同时，在 15 个高表达优越密码子中，除了终止密码子外，其余密码子全都以 G 或 C 结尾，说明类球红细菌偏爱使用以 G 或 C 结尾的密码子。通过研究分析得到类球红细菌基因组密码子使用的偏好性主要受到选择压力的影响。最后经过 ENC 差异分析构建了类球红细菌高低表达基因库，确定了 19 个高表达优越密码子和 15 个高表达最优密码子。参考文献1 IKEMURA T.Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organismsJ.Mol Biol Evol,1985,2(1):13-34.2 LI X Z,SONG H,KUANG Y,et al.Genome-wide analysis of codon usage bias in Epichlo festucaeJ.Int J Mol Sci,2016,17(7):1138.3 THOMA S,HECHT U,KIPPERS A,et al.Tissue-specific expression of a gene encoding a cell wall-localized lipid transfer protein from ArabidopsisJ.Plant Physiol,1994,105(1):35-45.4 陈琳,李祖明.类球红细菌应用进展 J.微生物学杂志,2016,36(3):105-108.5 SUEOKA N.Near homogeneity of PR2-bias fingerprints in the human genome and their implications in phylogenetic analysesJ.J Mol Evol,2001,53(4/5):469-476.6 原晓龙,李云琴,王毅,等.西南桦叶绿体基因组密码子偏好性分析 J.基因组学与应用生物学,2020,39(12):5758-5764.7 LIU Q P,XUE Q Z.Comparative studies on codon usage pattern of chloroplasts and their host nuclear genes in four plant speciesJ.J Genet,2005,84(1):55-62.8 梁湘兰,覃逸明,孙晓波,等.藿香叶绿体基因组密码子偏好性分析 J.分子植物育种,2023,21(3):809-818.9 李佳灵,尹为治,方正,等.伯乐树叶绿体密码子役佣偏好分析J.甘肃林业科技,2020,45(4):1-7.科技出版社,2020.2 胡和平,张俊平,应康,等.基因芯片技术分析斑蝥素对肝癌细胞细胞毒作用的分子机制 J.第二军医大学学报,2003,24(6):645-649.3 李晓飞,侯晓晖,陈祥盛.芫菁斑蝥素对喉癌细胞和胃癌细胞的抑制作用 J.昆虫学报,2009,52(9):946-951.4 张卫东,赵惠儒,阎影,等.斑蝥素诱导人肺癌 A549 细胞凋亡及其分子机制的研究 J.中华肿瘤杂志,2005,27(6):330-334.5 何太平,莫丽儿,梁念慈.斑蝥素诱导高转移卵巢癌细胞 HO-8910PM 凋亡的研究 J.中国医科大学学报,2005,36(2):164-167.6 李修炜.斑蝥素诱导人乳腺癌细胞 MCF-7 凋亡及其机制研究 D.大连:大连医科大学,2011.7 郭建芬,李广元,翁其亮,等.去甲斑蝥素在体外对白血病细胞核酸和蛋白质合成的影响 J.西安医科大学学报,1994,15(3):227-230.8 张志勇,袁锋.斑蝥素资源价值的综合评判 J.西北农业学报,1999,8(4):17-21.9 李万梅,郑燕,杨晨量,等.温度对三星黄萤甲取食量的影响 J.西北农业学报,2011,20(10):201-203.10 陈乾锦,林智慧,杨建全,等.温湿度对斜纹夜蛾幼虫发育历期、取食量与存活率的影响 J.中国烟草学报,2001,7(3):27-30.11 冯雨艳,马光昌,金启安,等.温度对豆天蛾发育历期及取食量的影响 J.热带作物学报,2014,35(12):2442-2444.12 冯晓洁,席国成,刘福顺,等.温湿度和食物对暗黑鳃金龟幼虫存活及生长发育的影响 J.昆虫学报,2017,60(8):920-927.13 张含藻,胡周强.大斑芫菁生物学特性研究J.中药材,1988,11(3):15-19.（上接第 79 页）