基于网络药理学研究逍遥散治疗慢性乙型肝炎的作用机制.pdf

收稿日期 基金项目 国家自然科学基金()深圳市自然科学基金()第一作者简介 李晓斌女博士研究生主要研究方向:中医药防治肝病方向通信作者胡世平男主任医师博士生导师主要研究方向:中医药防治肝病方向论著网络药理学研究基于网络药理学研究逍遥散治疗慢性乙型肝炎的作用机制李晓斌胡世平.北京中医药大学(北京).北京中医药大学深圳医院(广东 深圳)【摘要】目的 利用网络药理学方法从整体角度系统分析并预测逍遥散治疗慢性乙型肝炎()的分子机制为临床研究及新药研发提供参考 方法 检索 数据库获取逍遥散的活性成分及其相关靶点并根据口服利用度()和类药性()对活性成分进行筛选 在、数据库中筛选 的相关靶点并与活性成分的靶点取交集获得逍遥散治疗 的潜在作用靶点 在 数据库中获得各靶点的相互作用关系利用.软件构建逍遥散有效活性成分潜在作用靶点网络及靶点的蛋白互作网络并进行拓扑结构分析筛选核心靶点 在 .软件中进行潜在作用靶点的基因富集分析 运用 数据库对靶点进行器官定位结果通过网络构建及拓扑结构分析发现逍遥散主要通过 个有效活性成分干预 个潜在靶点来治疗有效活性成分中以槲皮素、木犀草素等黄酮类成分为主核心靶点为、等 基因富集分析显示逍遥散主要通过干预氧化应激相关生物学过程及调控、等信号通路发挥治疗 的作用 器官定位结果表明逍遥散治疗 主要作用于肝系与脾系 结论逍遥散主要通过下调 的转录与复制、调节免疫反应及炎症反应、调控细胞周期等发挥治疗 的作用【关键词】逍遥散慢性乙型肝炎网络药理学器官定位【中图分类号】【文献标识码】【文章编号】()(.)【】().()().第 卷第 期(第 页)年 湖北民族大学学报医学版 .【】慢性乙型肝炎()是由乙型肝炎病毒()持续感染所致的慢性肝脏炎症性疾病 全球约.亿人为慢性 感染严重威胁人类的生命 目前尚缺乏根除肝内共价闭合环状()的方法积极抗病毒并降低 相关肝硬化、肝癌、肝衰竭等肝脏终末期病变的发生率仍为治疗关键主要的药物为核苷(酸)类似物()及干扰素()二者虽疗效确切但存在耐药性及严重的不良反应且停药后易复发逍遥散以柴胡为君当归、白芍为臣白术、茯苓、甘草、薄荷、生姜为佐共奏疏肝解郁、健脾养血之功已作为指南推荐方剂应用于临床 对 中医证型分布规律的研究发现肝郁脾虚为主要证型之一逍遥散作为疏肝解郁之要方恰合病机为其治疗 提供了依据 此外多项临床研究证实逍遥散具有抗 的作用 但目前尚未从整体角度探讨逍遥散治疗 的分子机制 网络药理学是通过生物信息学的研究方法对中药成分、靶点及通路进行全面、系统的分析既体现了中医整体观又实现了与现代医学的融合 因此本研究利用网络药理学的方法以中药、化合物、疾病靶点为研究对象从整体角度对逍遥散干预 的物质基础及作用机制作进行分析为系统开发逍遥散提供科学依据及研究方向 材料与方法.逍遥散化学成分收集和筛选在中药系统药理数据库和分析平台(./.)对逍遥散所含的 味中药进行化学成分信息收集并根据其吸收、分布、代谢和排泄()特性进行筛选 值在药物的研发中起着关键作用其中口服利用度()、类药性()是评估化合物吸收入血的程度及其成药可能性的指标多用于预测口服化合物是否可发展成药物 因此本研究以 和.作为活性成分的筛选标准合并后删除重复值得到逍遥散治疗 的活性成分.中药有效成分相关靶点及 相关靶点的预测 使用 数据库对活性成分进行靶点预测并在 数据库(.)中将所有靶点的名称校正为官方名称()剔除没有靶点的活性成分 获得逍遥散治疗 的有效成分与相关靶点信息 以“”为关键词在(.)、(.)在线数据库中检索 相关的靶点合并后删除重复值.逍遥散有效成分潜在作用靶点网络的构建将 相关靶点与逍遥散有效成分的作用靶点取交集得到逍遥散治疗 的潜在作用靶点 利用.软件将中药、有效成分及潜在作用靶点进行关联并构建逍遥散有效成分潜在作用靶点网络图 通过 功能计算出节点的度值()筛选 倍中位值为重要靶点.蛋白互作网络的构建将潜在作用靶点导入 数据库(.)获得其相互作用关系 将靶点蛋白互作()关系导入 .得到潜在作用靶点的 网络 利用 功能对 网络过滤过滤条件为 倍中位值 过滤后得到逍遥散干预 的关键靶点 将其与.网络中的重要靶点取交集得到逍遥散治疗 的核心靶点 湖北民族大学学报医学版 第 期.分析以及 通路富集分析 在 .软件中通过“.”包获取潜在作用靶点的利用“”包对其进行 注释分析及 通路分析 设置.选取 分析结果中富集程度最高的前 条及 分析中富集程度最高的前 条通路进行可视化.器官定位分析将潜在作用靶点导入 数据库(.)进行器官定位分析检索各靶点在器官中的分布并进行信息统计将其与五脏体系相对应整理结果并绘图表示 结果与分析.有效成分及靶点的获取在 数据库中最终检索到逍遥散的活性成分共 种其中柴胡 种、当归 种、白芍 种、白术 种、茯苓 种、甘草 种、薄荷 种、生姜 种合并后删除重复值得到活性成分作用靶点 个 检索、在线数据库合并去重后共获得 的相关靶点 个 将 相关靶点与逍遥散活性成分的作用靶点取交集得到逍遥散治疗 的潜在作用靶点 个对应的有效成分 个 由此可知中药的有效成分与潜在作用靶点之间存在复杂的相互作用网络并非一一对应关系.逍遥散有效成分潜在作用靶点网络的构建与分析借助 .软件将中药、有效成分及潜在作用靶点进行关联并构建网络图见图 计算有效成分和靶点的 排名前 的成分信息见表 由图 可知同一有效成分作用于不同的靶点同一靶点可被多种有效成分刺激体现了逍遥散各成分通过复杂的网络关系干预 绿色:中药红色:有效成分棕色:两种或两种以上药物的共有成分紫色:潜在作用靶点线:各节点之间的相互作用节点面积的大小与度值呈正相关图 逍遥散有效成分潜在作用靶点网络图.网络的构建与核心靶点的筛选 将 个潜在作用靶点导入 数据库设定节点之间的置信度().获得逍遥散治疗 的靶点 个靶点与靶点之间的相互关系为 条 将靶点蛋白互作关系导入 .得到潜在作用靶点的 网络 利用 进行过滤过滤条件为:倍中位值得到逍遥散治疗 的关键靶点 逍遥散有效成分潜在作用靶点网络中的重要靶点表示与多种有效成分相关 网络中的关键靶点则代表与其他靶点之间互作紧密因此二者取交集可得到逍遥散治疗 的核心靶点该靶点可能在逍遥散治疗 的机制中起到核心作用具体为、见图 表 逍遥散重要成分信息化合物度值/药材归属槲皮素.柴胡、甘草木犀草素.薄荷山奈酚.柴胡、甘草柚皮素.薄荷、甘草甲氧基甲基异黄酮.甘草刺芒柄花素.甘草甘草查尔酮.甘草异鼠李素.柴胡、甘草谷甾醇.生姜、白芍、当归豆甾醇.生姜、当归、柴胡图 核心靶点蛋白互作网络.分析以及 通路富集分析利用.软件对 个潜在作用靶点进行 及 通路富集 分析从分子功能()、生物过程()和细胞组分()个方面分析各潜在作用靶点的富集情况共获得符合条件的 条 条 条体现了逍遥散治疗 的复杂网络机制 结果显示在 中大部分生物过程与氧化应激反应相关 研究发现活性氧()可促进 核衣壳的组装导致其复制增第 期 湖北民族大学学报医学版 强 在 感染的小鼠体内存在过度的氧化应激反应诱导 损伤进而导致 的不良预后 由此可推测逍遥散可能通过干预氧化应激反应相关的生物过程起到干扰 复制、抑制 发生发展的作用 通路富集结果显示潜在作用靶点共富集在 条通路上分析发现逍遥散治疗 与 感染、炎症反应、免疫反应、细胞凋亡等多条通路密切相关 选取 分析结果中富集程度最高的前 条及 分析中富集程度最高的前 条通路进行可视化详见图 图 图 功能富集分析图 功能富集分析.潜在作用靶点五脏体系定位中医认为人体可分为肝、心、脾、肺、肾五脏机能子系统五脏系统构成一个多维联系的立体网络与疾病的发生发展密切相关为明确逍遥散治疗 的潜在作用靶点与五脏体系之间的关系本研究将所有靶点导入 数据库中进行器官定位统计各器官信息并与中医五脏体系相对应结果见图 由此可知在逍遥散治疗 的潜在作用靶点中个靶点作用于肝系 个靶点作用于脾系 个靶点作用于心系 个靶点作用于肺系 个靶点作用于肾系图 潜在作用靶点五脏体系定位 讨论逍遥散中柴胡为君疏肝解郁当归养血和血白芍敛阴柔肝二者共为臣药君臣相和补肝体而助肝用佐药中白术、茯苓、甘草健脾益气扶土抑木薄荷、生姜辛散达郁 诸药相合起到调和肝脾之功效 由器官定位分析可知逍遥散治疗 的靶点在五脏体系中均有分布体现了中医的“五脏一体观”其中在肝系和脾系富集最多符合逍遥散疏肝健脾的功效 此外文献报道 的主要证型为“肝郁脾虚”和“肝胆湿热”主要病位为肝脾 与本研究结果一致故从病机和病位的角度可推测逍遥散具有抗 的潜在作用本研究显示逍遥散治疗 的重要活性成分以黄酮类为主包括槲皮素、木犀草素、山奈酚等研究发现黄酮类成分可降低 复制中间体、转录及 水平作用于 生命周期的多个环节同时激活 信号通路并下调 诱导炎症介质的产生 其中以槲皮素和木犀草素的研究较为深入 槲皮素可降低 的水平并通过影响亚基因组 的转录有效抑制 和 的分泌具有良好的抗 活性且高剂量(/)对.细 胞 无 显 著 毒性 此外槲皮素可通过干预 信号通路调控 的复制和转录 等将槲皮素与模拟的 聚合酶活性位点进行分子对接发现二 湖北民族大学学报医学版 第 期者具有较强的结合力提示槲皮素可作为 聚合酶抑制剂进行深入的实验研究 体外实验发现木樨草素可抑制.细胞中 和 的分泌 在 复制小鼠模型中同样观察到木犀草素能降低、复制中间体的水平 研究表明木犀草素通过激活细胞外信号调节激酶下调肝细胞核因子()的表达抑制其与 启动子的结合进而下调 基因组的转录 的复制可能与 相关受细胞内氧化还原状态的影响 而木樨草素作为还原性物质可减少 诱导 的产生防止相关信号通路的持续激活改变细胞内氧化还原状态减轻线粒体的功能障碍最终抑制 的复制在逍遥散治疗 的核心靶点中与有效成分作用最密切的为 其次为、等 研究发现 可阻断肝富集转录因子 与 增强子的结合使增强子的活性降低抑制 基因转录并通过抑制 受体钠离子/牛磺胆酸共转运蛋白(/)启动子 的转录活性下调 在肝脏的表达起到抗 感染的作用 此外 通过调控细胞因子、抑制 的产生等途径减轻 相关肝损伤延缓 的进展 在肝细胞中促进宿主限制性因子 磷酸化抑制其抗 的作用 在肝脏中含量丰富降低 的表达能促进牛磺胆酸的摄取同时增强 的蛋白表达并增加 的分泌促进 的早期感染 属于 转录因子家族通过抑制特异性蛋白 ()与 基因组 位点的结合抑制 介导的转录激活进而下调 的基因表达影响病毒复制由此推测逍遥散通过干预 复制、转录及炎症反应等多个生物学过程来治疗 在核心靶点中、分别为 信号通路、信号通路中的重要靶点介导该通路发挥生物学作用 本研究显示以上两条通路均为逍遥散治疗 网络中的关键通路 等发现 信号通路的激活可显著抑制 及.的转录减少 细胞中 的复制 此外 感染后 通过激活 信号通路上调 在肝细胞中的表达 众所周知 是一种多功能细胞因子介导 感染后的免疫应答由此推测 信号通路的激活干预免疫反应影响 的发生发展 信号通路可调控 的表达抑制 基因组的转录又可通过参与 样受体/(/)介导的免疫应答来抑制 的复制 在 复制的肝细胞中可观察到 信号通路、信号通路同时激活导致细胞周期失调与 感染后 的发生发展相关 因此逍遥散可能通过调控上述两条关键通路干预 在肝细胞中的复制及其诱导的免疫应答、调控细胞周期等途径控制 的发展降低 相关不良事件的发生率综上所述本研究利用网络药理学的方法从整体角度系统地分析并预测了逍遥散治疗 的机制发现逍遥散通过干预 的转录与复制、调节免疫应答、介导炎症反应、调控细胞周期等途径控制 的进展改善预后 但本研究仅考虑中药各成分的叠加作用未涉及方中各药物剂量、煎煮方式及煎煮过程中成分的相互作用因此存在局限性仍有待于进一步的实验研究来验证其具体机制参考文献王贵强王福生庄辉等.慢性乙型肝炎防治指南(年版).中国病毒病杂志():.:.:():.:.():.中华中医药学会肝胆病专业委员会.慢性乙型肝炎中医诊疗指南(年版).中西医结合肝病杂志():.叶永安江锋赵志敏等.慢性乙型肝炎中医证型分布规律研究.中医杂志():.梁惠卯唐金模吴春城等.逍遥散联合 干扰素治疗 阳性慢性乙型肝炎的临床观察.中国中西医结合杂志():.田水林施琳施卫兵等.逍遥散联合恩替卡韦治疗肝郁脾虚型慢性乙型肝炎疗效研究.陕西中医():.葛冰景周薏肖铁刚等.逍遥散联合恩替卡韦对肝郁脾虚型乙型肝炎肝硬化代偿期患者纤维化及铁代谢的影响.湖南中医药大学学报():.第 期 湖北民族大学学报医学版 .()():.():.():.():.欧海亚叶小鹏李舒等.基于网络药理学的茵陈五苓散治疗非酒精性脂肪肝病的机制分析.世界科学技术中医药现代化():.():.():.():.叶永安田德禄蒋健等.例慢性乙型肝炎()患者中医常见症状及证候分布特点研究.世界中医药():.朱凌凌童瑶陈慧娟等.脾的中西医学比较研究.浙江中医杂志():.焦云涛李小科杨先照等.基于关联规则和复杂系统熵聚类的 阳性慢性乙型肝炎用药规律分析.临床肝胆病杂志():.()():.():.():.:.():.:.:.():.()():.宋梅.维甲类 受体 调控乙型肝炎病毒感染机制研究.北京:北京协和医学院.():./.():.():.()().():.责任编辑:牟冬生 湖北民族大学学报医学版 第 期