凉茶渣的固态发酵工艺和产物抗氧化活力研究.pdf

St1NO.16202387试验研究福饲料研究FEEDRESEARCH?茶渣的固态发酵工艺和产物抗氧化活力研究袁明贵1唐兴刚1徐志宏1魏琦麟1田雅1孙凯辉?王晓珊向蓉*（1.广东省农业科学院动物卫生研究所广东省畜禽疫病防治研究重点实验室农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站，广东广州510 6 40；2.广东特酵生物科技股份有限公司，广东揭阳51550 0）摘要：试验旨在促进?茶渣在饲料中资源化利用。采用单因素试验和正交试验的方法，优化黑曲霉和产假丝酵母联合发酵?茶渣的工艺。结果显示，?茶渣最佳发酵工艺为含水量8 0%、浸泡液pH值9.0 0、温度34、发酵时长16 8 h，此条件下?茶渣的降解率和产物pH值分别为2 3.8 7%和3.98。当产物水提液浓度为2 4g/L时，超氧阴离子自由基、羟基自由基和DPPH自由基的清除率分别为2 8.6 5%、8 0.46%、8 2.0 6%。研究表明，发酵?茶渣具有较强的抗氧化活力。关键词：?茶渣；黑曲霉；产假丝酵母；降解率；抗氧化中图分类号：S816.6文献标识码：A文章编号：10 0 2-2 8 13（2 0 2 3）16-0 0 8 7-0 4Doi:10.13557/ki.issn1002-2813.2023.16.017udy on solid state fermentation process herbal of tea residue and antioxidant activity of producYUAN Ming-guiTANG Xing-gangXU Zhi-hongWEIQi-linTIANYaSUNKai-huiWANG Xiao-shanXIANG RongAbstract:The experiment was to promote the resource utilization of herbal tea residue in feed.The single factor test andorthogonal test were used to optimize the process of the joint fermentation of Aspergillus niger and Candida utilis to herbaltea residue.The results showed that the optimal fermentation process for herbal tea residue was 80%water content,pHvalue of 9.00 in the soaking solution,temperature of 34 a n d f e r me n t a t i o n t i me o f 16 8 h.U n d e r t h e c o n d i t i o n s,t h edegradation rate of herbal tea residue and the pH value of the product were 23.87%and 3.98,respectively.Under theoptimal process,the fermentation products have good antioxidant properties.When the concentration of the product waterextract was 24 g/L,the clearance rates of superoxide radicals,hydroxyl radicals and DPPH radicals were 28.65%,80.46%and 82.06%,respectively.The study indicates that fermented herbal tea residue has strong antioxidant activity.Key words:herbal tea residue;Aspergillus niger,Candida albicans;degradation rate;antioxidation随着?茶产业的高速发展，?茶渣的资源化利用研究也逐渐兴起。?茶渣可以直接作为饲料原料改善猪肉品质和嗣体性状，改善育肥牛空肠绒毛高度、屏障功能 2 。发酵后的?茶渣能够促进后备奶牛生长发育，提高机体免疫力，增强抗氧化能力 3-41。微贮后的?茶渣可以提高热应激状态下育肥牛的采食量和日增重，降低呼吸频率与直肠温度 5。但是关于?茶渣的发酵工艺研究依然比较缺乏。黑曲霉发酵后可以产生淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶等多种降解基质的酶类 6-9，降解后的基质转变为果糖、葡萄糖等可溶性单糖以及柠檬酸、葡萄糖酸和氨基酸等第一作者：袁明贵，博士，副研究员，研究方向为中兽药和新饲料添加剂。通信作者：向蓉，博士，研究员。基金项目：揭阳市科技计划项目（项目编号：Dzxny016）；广州市科技计划项目（项目编号：2 0 2 12 10 0 0 6 9）收稿日期：2 0 2 3-0 1-0 4小分子有机酸10-12 ；部分物质被进一步代谢为CO,等气体。因为基质的降解率与蛋白质含量正向相关 3，且柠檬酸等有机酸降低了产物pH值，所以发酵效果可以用降解率 10,13 和产物pH值 10,141 来评价。产假丝酵母发酵可以显著提高体系中蛋白质含量，是饲料工业常用菌种之一。因此，本研究探索黑曲霉和产假丝酵母联合发酵?茶渣的最佳工艺，评价产物抗氧化性能，进一步促进?茶渣的资源化利用。1材料与方法1.1菌株与材料黑曲霉GIM3.562和产假丝酵母GIM2.148，购自广东省微生物菌种保藏中心，参照文献 15 进行活化。?茶渣由加多宝食品饮料公司提供。固态?茶渣培养基和PDA培养基参照文献 15 制备。固态?茶渣高压湿热灭菌前、后pH值分别为5.6 3、5.0 1。1.2仪器设备5804R台式冷冻离心机（Eppendorf公司），BSA124S电子天平（Sa r t o r iu s 公司），Elx50酶标仪(BioTek2NO.162023饲料研究FEEDRESEARCH88试验研究Instruments公司），SX-700高压灭菌器(TOMY公司），XS-212生物显微镜（江南光电公司）。1.3试验方法1.3.1单因素试验综合考虑降解率、产物pH值以及工业化生产的便利，参照文献 16 ，对氮源（分别添加4%豆粕、氯化铵、尿素、硫酸铵和无补充氮源）、碳源（分别添加2%葡萄糖、蔗糖、糖蜜、-乳糖和不补充碳源）、含水量(65%、7 0%、7 5%、8 0%、8 5%）、发酵时间（48、7 2、96、12 0、144h）、浸泡液pH值（5.0 0、6.0 0、7.0 0、8.00、9.0 0）、温度（室温、2 8、31、34、37）进行单因素试验，每组试验重复3次。以不接种菌种的?茶渣培养基为空白对照1.3.2正交试验根据单因素试验结果，发现发酵时间越长，降解率越高；含水量从6 5%升高至8 0%时，对降解率无显著影响，而产物pH值逐渐降低；当浸泡液pH值大于7.0 0 以后，随浸泡液pH升高，降解率增大。因此，将发酵时间延长至16 8 h，含水量降低至6 0%，以探索更宽的时间和含水量范围对发酵工艺的影响。以降解率为考察指标，利用正交试验，优化?茶渣发酵工艺。L(3*)正交试验因素和水平设计见表1。每组试验重复3次。表1L,(3*)正交试验因素和水平设计水平A含水量/%B浸泡液pH值C温度/D发酵时间/h一607.0031722708.00341203809.00371681.4降解率和产物pH值产物pH值和降解率参照文献 16 的方法测定,1.5发酵产物水提液抗氧化活性产物的超氧阴离子自由基清除率、羟基自由基清除率和DPPH自由基清除率参照文献 16 的方法测定。1.6数据统计与分析试验结果采用SPSS21软件进行方差分析，采用LSD法进行多重比较，结果以“平均值标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1氮源种类对?茶渣发酵效果的影响(见图1)由图1可知，与无氮源相比，硫酸铵显著提高了降解率（P0.05）。发酵产物pH值从低到高的氮源依次为豆粕 硫酸铵 尿素 氯化铵，4种氮源之间差异显著(P0.05)。所有发酵组的降解率均远高于空白组降解率，所有发酵组的产物pH值均远低于空白组。由于硫酸铵为氮源时的降解率最高，且产物pH值较低，因此在后续正交试验中选择4%硫酸铵作为氮源。20厂降解率ZpH值A615B%率圳刺5BCBCC4值10C3251空白豆粮尿素无氮源氯化铵硫酸铵氮源种类注：空白组不参与方差分析；大写字母不同表示降解率差异显著（P0.05)，不同小写字母表示pH值差异显著（P0.05)；下图同。图1氮源种类对?茶渣发酵效果的影响2.1.2碳源种类对?茶渣发酵效果的影响(见图2)由图2 可知，与无碳源相比，糖蜜对产物pH值无显著影响（P0.05），-乳糖显著提高了产物的pH值(P0.05），葡萄糖和蔗糖显著降低了产物pH值（P 0.0 5）。虽然碳源对?茶渣降解率无显著影响，但是添加葡萄糖对应的发酵产物pH值最低，因此选择葡萄糖作为后续正交试验的碳源。20L5降解率ZpH值415ba%率糊刺b31025100无碳源葡萄糖燕糖文一乳糖糖蜜碳源种类图2碳源种类对?茶渣发酵效果的影响2.1.3含水量对?茶渣发酵效果的影响(见图3)由图3可知，当含水量为8 5%时降解率最低，显著低于其他含水量时的降解率区（P0.05）。当含水量从6 5%增加到8 0%时，产物pH值缓慢降低。与7 5%和8 0%含水量相比，6 5%和8 5%含水量时产物的pH值显著升高（P0.05），发酵12 0 h和144h对降解率无显著影响(P0.05）；发酵48 h和7 2 h对产物pH值无显著影响（P 0.0 5），发酵96 h和12 0 h对产物pH值无显著影响(P0.05)。综合考虑工业化处理效率、产品的防腐性能及适口性，将后续试验的时间设定为7 2 h。255降解率ZpH值bAbAa204CCB%/率圳刺B1531025100487296120144发酵时间/h图4发酵时间对?茶渣发酵效果的影响2.1.5浸泡液pH值对?茶渣发酵效果的影响(见图5)由图5可知，浸泡液pH值为5.0 0、6.0 0 和8.0 0 对?茶渣的降解率无显著影响（P0.05)；当浸泡液pH值为7.00时，?茶渣的降解率显著低于其他各pH值条件下的降解率（P0.05)；浸泡液pH值为9.0 0 时，降解率显著升高（P0.05），而浸泡液pH值为9.00时，产物pH值显著升高（P 0.0 5）。与室温相比，2 8 时对产物pH值无显著影响，31 37 显著升高了发酵产物的pH值。205降解率ZZpH值a415aab%/率糊划b310250室温28313437温度/图6温度对?茶渣发酵效果的影响2.2正交试验结果(见表2、表3)由表2 可知，通过R值判断，4个因素对?茶渣的降解率影响顺序为浸泡液pH值B发酵时间D含水量A温度C。通过k值可以发现，A,B;C,D:为正交试验得出的最优组合，即含水量8 0%、浸泡液pH值9.0 0、发酵温度34、时间16 8 h是黑曲霉和产假丝酵母联合发酵?茶渣的最佳工艺。表2L(3*)正交试验极差分析降解率/%项目ABCDXX,X1123217.3619.2621.102111113.4712.2213.573231221.2222.0922.104222118.2018.0917.755312215.7415.9916.486321320.5920.0921.757333119.2619.6821.008132322.2922.2322.239213317.7514.6312.96K18.1914.7618.5717.03k218.3119.3518.7819.04k18.9521.3418.1119.39R0.766.590.672.36由表3可知，浸泡液pH值和发酵时间对降解率有显著影响，其中浸泡液pH值影响极显著（P 时间 含水量 温度，与极差分析结果一致。表3正交试验差分析项目平方和自由度均方F值P值A3.02121.5111.1350.343B205.4952102.74877.2090.001C2.09021.0450.7850.471D29.280214.64011.0010.001误差23.950181.330注：P0.05表示影响显著，P0.01表示影响极显著。经过验证，?茶渣最佳工艺条件下的降解率为23.87%，高于所有单因素试验和正交试验中的降解率，此时产物pH值为3.98。2.3发酵产物水提液抗氧化活性(见表4)由表4可知，当发酵产物水提液质量浓度为6、12、24 g/L时，显著降低了对应浓度发酵产物的超氧自由基清除率；极显著提高了羟基自由基清除率；而DPPH自由基清除率始终保持8 4%左右。NO.162023饲料研究FEEDRESEARCH90试验研究表4发酵产物水提液抗氧化活性浓度/超氧阴离子羟基DPPH项目(g/L)自由基/%自由基/%自由基/%637.73 1.63b81.99 0.91b发酵前 16 1243.01 0.89a6.29 1.07e81.49 2.69b2443.56 1.25a4.7.06 5.53c90.71 3.92a629.00 7.09d84.89 1.22b发酵后1266.09 0.30b84.32 0.59b2428.65 3.46c80.46 6.87a82.06 1.18b注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05)；“二”表示未检出。3记讨论黑曲霉和酵母菌联合发酵具有协同作用。谭显东等 17 发现，黑曲霉和酵母菌的相互作用对发酵三七渣生产蛋白具有显著影响。黑曲霉和酵母菌在联合发酵甜高梁酒糟生产蛋白饲料118 、发酵耗牛血制备可溶性蛋白 19、发酵橙子皮生产果胶酶 2 0 等方面均表现出协同作用。菌种在快速生长前期，对大分子营养的分解速率高于自身对小分子营养物质的消耗速率 14，导致有机酸等小分子物质积累较多，使产物pH值下降。此时，由于基质发酵不完全，致使基质的降解率偏低；而在快速生长后期及稳定期需要更多的小分子营养物质，于是将生成的小分子有机酸作为碳源消耗，使产物pH值升高，基质的降解率同时增大。因此，?茶渣的降解率和产物pH值随时间延长而呈现同时增大的现象。在利用黑曲霉发酵三七渣生产蛋白的过程中，发现基质降解速率在0 7 2 h内增加较快，而7 2 h后较慢，而且产物pH值在0 6 0 h内降低，而6 0 h后开始缓慢升高 14。由于本研究从48 h开始考察时间对?茶渣的降解率和产物pH值的影响，因此没有观察到发酵前期降解率随时间延长而增大、pH值随时间延长而降低的现象，仅观察到发酵后期降解率和pH值均随时间延长而增大的现象。原因可能是在2 8 时，温度相对较低，黑曲霉和产假丝酵母生长速率均较小，当发酵48 h甚至7 2 h时，黑曲霉和产假丝酵母依然处于快速生长前期，致使更多的有机酸累积，从而使?茶渣的降解率和产物pH值均较低。同理，与硫酸铵、氯化铵和尿素相比，豆粕和无氮源不利于黑曲霉和酵母菌的增殖和生长 2 1，致使在相同的发酵时间内（7 2 h），累积了较多的有机酸，导致?茶渣的降解率和产物pH值均较低。4结论本研究发现，含水量8 0%、浸泡液pH值9.0 0、温度34、时长16 8 h是黑曲霉和产假丝酵母联合发酵?茶渣的最佳工艺，此时?茶渣的降解率和产物pH值分别为2 3.8 7%和3.98，且产物具有较高的抗氧化活性；但由于生产实际情况，正交试验因素水平的选择上存在一定的局限性，未来将进一步优化生产工艺。参考文献1谢月琴,孙小红,汪东阳,等.?茶渣对育肥猪生长性能、体性状和肉品质的影响.动物营养学报,2 0 19(10):47 7 6-47 8 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