抗结核药物吡嗪酰胺对神经元活性的影响.pdf

新发传染病电子杂志 2023年6月第 8 卷第 3 期 Electronic Journal of Emerging Infectious Diseases,June 2023,Vol.8,No.312 基金项目：广西重点研发项目（桂科AB19110012）通信作者：吴锋耀，Email： 引用格式：邵宏华，朱庆东，龙倩，等.抗结核药物吡嗪酰胺对神经元活性的影响J/CD.新发传染病电子杂志，2023,8（3）：12-18.Shao Honghua,Zhu Qingdong,Long Qian,et al.Effect of antituberculosis drug pyrazinamide on neuronal activityJ/CD.Electronic Journal of Emerging Infectious Diseases,2023,8(3):12-18.论著邵宏华1，朱庆东2，龙倩3，罗晓璐4，农剑鸿5，李?俊1,4，吴锋耀4（1.南宁市第四人民医院内科，广西 南宁 530023；2.南宁市第四人民医院结核二科，广西 南宁 530023；3.南宁市第四人民医院检验科，广西 南宁 530023；4.南宁市第四人民医院传染病重点实验室，广西 南宁 530023；5.南宁市第四人民医院麻醉科，广西 南宁 530023）抗结核药物吡嗪酰胺对神经元活性的影响【摘要】目的 本研究通过构建离体神经元模型，探讨抗结核药物吡嗪酰胺（PZA）对神经元活性的影响，以期为治疗结核性脑膜炎提供理论依据。方法 构建离体神经元模型，用不同浓度的PZA孵育神经元6h，选取10mol/L浓度的PZA孵育神经元12h（10-PZA-12h）和孵育神经元6h再更换正常培养基继续培养6h（10-PZA-normal-6h）。观察神经元形态结构，检测三磷酸腺苷（ATP）含量、神经元存活率、Na+/K+-ATP酶的1亚基（ATP1A1）表达、神经元的静息电位（RP）和动作电位（AP）。结果 10mol/L浓度的PZA孵育神经元6h后，ATP含量、ATP1A1表达以及AP振幅均降低，RP升高。在10-PZA-12h组，神经元的结构、形态发生改变，ATP含量、细胞存活率、ATP1A1表达以及AP振幅均降低，而RP升高。在10-PZA-normal-6h组，神经元结构、形态，以及ATP含量、细胞存活率、ATP1A1、RP和AP无显著改变。结论 PZA抑制神经元的细胞活性，随着药物作用时间延长，神经元出现损伤，及时祛除诱因可挽救神经元。【关键词】抗结核药物；吡嗪酰胺；神经元；三磷酸腺苷；电生理 DOI：10.19871/ki.xfcrbzz.2023.03.003 【中图分类号】：R52Effect of antituberculosis drug pyrazinamide on neuronal activityShao Honghua1,Zhu Qingdong2,Long Qian3,Luo Xiaolu4,Nong Jianhong5,Li Sijun1,4,Wu Fengyao4(1.Medical Department,The Fourth Peoples Hospital of Nanning，Guangxi Nanning 530023,China;2.Tuberculosis Department,The Fourth Peoples Hospital of Nanning，Guangxi Nanning 530023,China;3.Clinical Lab,The Fourth Peoples Hospital of Nanning，Guangxi Nanning 530023,China;4.Infectious Diseases Laboratory,The Fourth Peoples Hospital of Nanning，Guangxi Nanning 530023,China;5.Anesthesiology Department,The Fourth Peoples Hospital of Nanning，Guangxi Nanning 530023,China)【Abstract】Objective Previous study suggests that pyrazinamide(PZA),a common anti-tuberculosis drug,may lead to neuronal damage.The mechanism of neuronal damage caused by PZA remains unclear.To further investigate the potential mechanism of neuronal damage caused by PZA,We constructed an in vitro model to study the effect of PZA on neurons.Method The in-vitro neuron model were constructed,which were incubated with different concentrations of PZA for 6h.Optimal concentration of PZA was selected.Based on optimal concentration,the neurons were then incubated with PZA(10mol/L)for 12h(10-PZA-12h),and the neurons were incubated with PZA(10mol/L)for 6h and then replaced with normal medium for another 6h(10-PZA-normal-6h).We observed the structure and morphology of neurons and detected the ATP content,survival rate,expression of Na+/K+-ATPase 1 subunit(ATP1A1),electrophysiologyresting potential(RP)and action potential(AP)in neurons.Result After the neurons were incubated in PZA(10mol/L)for 6h,the neuronal structure,morphology and survival rate were not significantly changed,but the ATP content,the expression of ATP1A1 and amplitude of AP were decreased.Inversely,the RP was increased.In 10-PZA-12h group,the morphology and structure of neurons were changed;the ATP content,neuronal survival rate,the expression of ATP1A1 and amplitude of AP were significantly decreased;the RP was increased.In 10-PZA-normal-6h group，the neuronal morphology and structure,ATP content,survival rate,the expression of ATP1A1 and amplitude of AP and RP were not significantly changed.Conclusion PZA inhibits the activity of neurons.With the 13 新发传染病电子杂志 2023年6月第 8 卷第 3 期 Electronic Journal of Emerging Infectious Diseases,June 2023,Vol.8,No.3extension of drug action time,the neurons appear damage，and timely removal of inducement can save neurons.【Key words】Antituberculosis drugs;Pyrazinamide;Neuron;Adenosine triphosphate;Electrophysiology 结核病是由结核分枝杆菌感染引起的疾病，全球发病率为10%50%1。当结核分枝杆菌侵犯神经系统，可引起结核性脑膜炎（tubercular meningitis，TBM）；目前有1%5%的结核病患者会进一步发展成TBM2-3。TBM对患者中枢神经系统（central nervous system，CNS）造成不可逆的损伤，具有较高的病死率和致残率，给患者家庭和社会带来了沉重负担4-6。虽然随着抗结核药物的广泛应用，TBM患者的预后得到改善，但仍会遗留神经功能缺损及焦虑抑郁等症状7-8。这种情况可能是结核分枝杆菌损伤神经元所致9，也可能是抗结核药物引起CNS的异常10。吡嗪酰胺（pyrazinamide，PZA）是常见的抗结核药物，有研究发现PZA可以影响大脑的多巴胺神经元以及多种神经发育相关的基因11。但是目前尚不明确该药物对患者的CNS产生不良影响的具体作用机制。由于PZA是治疗TBM的常规用药，因此，深入探索药物的神经毒副作用对于患者预后十分重要。神经元通过利用三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）作为能量来发挥其基本的生理功能12。能量代谢与神经元的活性密切相关，其中钠-钾-ATP酶（Na+/K+-ATPase，NKA）扮演了重要的角色13。NKA是位于哺乳动物细胞质膜上的跨膜离子泵，利用ATP水解的能量将Na+导入细胞内，并将K+排出细胞外，所消耗的ATP占比高达70%14。NKA通过转运Na+和K+形成静息电位和动作电位14-15。NKA是一种蛋白质复合体，其中亚基尤为重要，是结合和运输Na+和K+，维持细胞活性和产生动作电位的重要亚基16。亚基有14四个异构体，由钠-钾-ATP酶蛋白A（ATPase Na+/K+transporting subunit alpha，ATP1A）14基因进行编码，其中ATP1A1是影响神经元能量代谢和电生理活动的关键因子17-18。本研究通过建立离体神经元模型，检测神经元存活率、ATP含量、ATP1A1表达以及电生理的改变，从而探索PZA对神经元的影响，为临床用药提供理论指导。1 资料与方法1.1 原代神经元培养并构建离体模型 按照我们既往的方法进行细胞培养19。为了促进神经元贴壁，我们在实验前夜先进行包被处理，具体步骤如下：往每个培养孔内滴加适当的多聚赖氨酸溶液（赛默飞，A3890401），随后将培养孔板置于37，5%CO2培养箱过夜，临用前将剩余的多聚赖氨酸吸除，三蒸水清洗3遍后于超净工作台晾干待用。配制种植培养液：88%的DMEM/F12（赛默飞，A4192001）+10%胎牛血清（赛默飞，10100147C）+1%L-谷氨酰胺（赛默飞，35050061）+1%链青霉素（赛默飞，15140-122）。配置维持培养基：96%神经元基础培养基（赛默飞，10888022）+1%谷氨酰胺（赛默飞，35050061）+1%链青霉素（赛默飞，15140-122）+2%B27神经营养因子（赛默飞，17504044）。培养：提取细胞前将多聚赖氨酸移走，用灭菌的三蒸水清洗3次。取24h内出生的SD乳鼠（由广西医科大学动物中心提供）。动物实验根据广西医科大学伦理委员会颁发的项目许可（编号202101023）进行，并遵守国家动物护理和使用指南。将SD乳鼠断头，剪开颅骨，小心取出大脑置于4 D-Hanks液中。冰上分离海马，剥离脑膜和血管后，将海马剪碎成1mm大小。转移到15ml离心管，加入45倍体积的0.125%胰蛋白酶，37消化1015min，消化期间震荡数次。加入与胰蛋白酶相等体积的种植培养基终止消化，其间使用吸管轻柔吹打30次，使组织与培养基充分接触，终止消化。1000转/min离心5min，弃上清，重新加入种植培养基，吹打重悬后将细胞原液滴加到细胞筛过筛。通过细胞计数，将细胞配成（1.52.0）105/ml的密度。以此浓度接种培养板中,置于37、含5%CO2培养箱中培养。10h后将种植培养基更换成维持培养基，以后每3天半量换液，并观察神经元形态。当神经元培养到第7天后加入PZA进行孵育。PZA在成人体内半衰期约为6h20，因此，我们将神经元PZA的孵育时间定为6h。将细胞分为对照组和PZA孵育组，对照组不添加任何药物，PZA孵育的神经元按照添加PZA的浓度分为0.01mol/L（0.01-PZA）组、0.1mol/L（0.1-PZA）组、1mol/L（1-PZA）组和10mol/L（10-PZA）组四组。最后选择感兴趣的药物浓度进一步研究：将药物作用时间延长至12h；PZA孵育6h后再更换正常培养基继续培养6h。1.2 MTT法检测神经元存活率 采用MTT试剂盒（博士德，AR1156）检测细胞存活率。96孔培养板每一孔加入10l MTT染色液，37培养4h后，每孔加入100l甲臜溶解液继续在37孵育4h。酶标仪于570nm测定吸光度。新发传染病电子杂志 2023年6月第 8 卷第 3 期 Electronic Journal of Emerging Infectious Diseases,June 2023,Vol.8,No.314 1.3 检测神经元ATP含量 采用ATP检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，BC0305）检测神经元的ATP含量。细胞收集按照以下步骤：0.125%胰蛋白酶将贴壁神经元从培养皿上消化下来，将细胞收集到离心管内，弃上清，按照细胞数量加入提取液（500万细胞加入1ml提取液），超声波破碎1min，10 000g 4离心10min；取上清液至另一EP管中，加入500l的氯仿充分震荡混匀，10 000g 4离心3min，取上清，置冰上待测。按照试剂盒步骤检测神经元的ATP含量（mol/106个细胞）。1.4 Western blot检测蛋白表达 使用蛋白提取试剂盒（英文特，SD-001/SN-002）提取总蛋白，采用总蛋白定量检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司，P0012S）检测蛋白浓度。将蛋白样品加入向SDS-PAGE胶的孔中（20g/孔），利用湿转移法将蛋白印迹转移到硝基纤维素（NC）膜，随后对NC膜进行封闭处理。NC膜与一抗ATP1A1抗体110 000（蛋白科技，14418-1-AP）在4孵育过夜，然后将NC膜与辣根过氧化物酶（HP）偶联的二抗18000 在室温下孵育1h。NC膜采用Omni-ECL超灵敏化学发光检测试剂（雅酶，SQ201）孵育12min后，最后用ChemiScope6000凝胶成像系统对蛋白印迹进行观察和拍照。采用Image J软件对蛋白印迹的条带强度进行定量，通过与内参蛋白GAPDH灰度值进行归一化来量化蛋白水平。1.5 免疫荧光检测神经元中的蛋白表达 用磷酸盐缓冲溶液浸洗细胞爬片3次，每次3min；4%的多聚甲醛常温下固定爬片20min；0.2%的TritonX-100常温下穿透细胞5min。按照四色多重荧光免疫组化染色试剂盒（爱必信，abs50012）的步骤进行操作，一抗分别为ATP1A1抗体1100（蛋白科技，14418-1-AP）、抗神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）抗体（博士德，BM4495）1100对神经元孵育。徕卡激光共聚焦显微镜（Leica SP8）观察结果，并采用Image J软件统计神经元上ATP1A1的累积光密度。1.6 膜片钳记录细胞电生理 采用膜片钳设备（Digidata 1550B），在全细胞模式下，记录神经元的静息电位和动作电位。电极外液配制如下：122mol/L NaCl，2mol/L KCl，25mol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，2mol/L CaCl2，4mol/L MgCl2，10mol/L葡萄糖；pH7.4。使用的玻璃电极电阻为36M，电极内液配制如下：110mmol/L KCl 1mmol/L NaCl，2mmol/L 乙二醇双，25mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，4mmol/L Mg-ATP，0.3mmol/L Na2-GTP，10mmol/L磷酸肌酸；pH7.3。所有记录均在25下进行，采用全细胞模式进行记录。在I=0的模式下记录静息电位。钳制电压维持在-70mV，电流钳模式下记录动作电位。利用Clampfit 11.0.3软件分析结果。1.7 统计分析 采用SPSS 25.0进行数据处理与统计学分析，计量资料符合正态分布的以均数标准差表示，组间比较均采用单因素分析。以P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 PZA对神经元形态、存活率以及ATP含量的影响与对照组相比，PZA孵育的各组神经元在形态学上并无显著差异，神经元胞体饱满，网络结构清晰，未发现明显的细胞水肿、破裂等现象（图1a）。与对照组相比，被PZA孵育的神经元存活率无显著差异（图1b）。10-PZA组的神经元ATP含量显著降低（每组5个孔的细胞样本，P0.01，图1c）。我们继续采用10mol/L这个浓度的PZA对神经元进行下一步处理。我们将神经元分为三个组：对照组、10-PZA连续作用12h组（10-PZA-12h组）以及10-PZA恢复正常培养6h组（10-PZA-normal-6h组）。继续观察这三组神经元的形态，检测细胞存活率和ATP含量。结果显示10-PZA-12h组的神经元出现细胞形态模糊，细胞碎片增多，神经元网络结构紊乱等现象（图1d），同时还出现细胞存活率下降（每组5个孔的细胞样本，图1e）、ATP的含量降低（每组5个孔的细胞样本，图1f）（均P 0.01）。相反，10-PZA-normal-6h组的神经元的细胞形态（图1d）、细胞存活率（每组5个孔的细胞样本，图1e）和ATP含量均无显著改变（每组5个孔的细胞样本，图1f）（均P0.05）。2.2 PZA对ATP1A1表达的影响 Western blot的结果显示，10-PZA组神经元的ATP1A1表达量下降（每组5个孔的细胞样本，P0.01，图2a），其余各组改变不明显。NSE是神经元的特异性蛋白，在免疫荧光检测中表现为绿色荧光。免疫荧光检测中ATP1A1为红色荧光。可以在同一细胞上观察到这两种荧光，提示ATP1A1和NSE有共定位关系，证实ATP1A1表达于神经元（图2b、d）。在10-PZA组的神经元上，ATP1A1的累积光密度降低（每组5个孔的细胞样本，P0.01，图2b）。10-PZA-12h组神经元的ATP1A1仍处于下调状态（每组5个孔的细胞样本，P0.01，图2c），但10-PZA-normal-6h已经恢复正常水平（每组5个孔的细胞样本，P0.05，图2c）。而免疫荧光的检测结15 新发传染病电子杂志 2023年6月第 8 卷第 3 期 Electronic Journal of Emerging Infectious Diseases,June 2023,Vol.8,No.3图1 PZA对神经元结构形态、存活率及ATP含量的影响。a：各组神经元胞体饱满，网络结构清晰，未发现细胞水肿、破裂等现象，各组间细胞形态结构无显著差异（P0.05）；b：各组暴露在PZA 6h后神经元存活率无显著差异（P0.05）；c：与对照组相比，10-PZA组神经元的ATP含量显著降低(#，P0.01)，其余各组间无显著差异（P0.05）；d：与对照组相比，持续暴露在PZA 12h的神经元细胞形态模糊，细胞碎片增多，网络结构零乱；转为正常培养基继续培养6h的神经元胞体饱满，网络结构清晰，未发现细胞水肿、破裂等现象，与对照组相比无显著差异（P0.05）；e：与对照组相比，持续暴露在PZA 12h的神经元存活率显著下降(#，P0.01)，转为正常培养基继续培养6h的神经元存活率无明显改变（P0.05）；f：与对照组相比，持续暴露在PZA 12h的ATP含量显著下降(#，P0.01)，转为正常培养基继续培养6h的神经元ATP含量无明显改变（P0.05）（注：0.01mol/L PZA=0.01-PZA；0.1mol/L PZA=0.1-PZA,1mol/L PZA=1-PZA和10mol/L PZA=10-PZA；10mol/L PAZ持续孵育12h=10-PZA-12h；10mol/L PZA孵育6h后更换正常培养基继续培养6h=10-PZA-normal-6h）。果也显示10-PZA-12h组神经元的ATP1A1光密度降低（每组5个孔的细胞样本，P0.01，图2d），但10-PZA-normal-6h的ATP1A1光密度基本恢复（每组5个孔的细胞样本，P0.05，图2d）。2.3 PZA对神经元电生理的影响 为了进一步检测PZA对神经元活性的影响，我们通过膜片钳技术记录了各组神经元的静息电位和动作电位。10-PZA组神经元的静息电位出现显著升高（每组5个细胞，P0.01，图3a）。10-PZA组神经元动作电位的振幅显著降低 （P0.01，图3b）。10-PZA-12h组神经元的静息电位值升高（每组5个细胞，P0.01，图3c），动作电位振幅降低（每组5个细胞，P0.01，图3d），但10-PZA-normal-6h的静息电位值和动作电位振幅变化并不明显（每组5个细胞，P0.05，图3c、d）。abcdef500m500m500m500m500m500m500m500m新发传染病电子杂志 2023年6月第 8 卷第 3 期 Electronic Journal of Emerging Infectious Diseases,June 2023,Vol.8,No.316 图2 PZA对神经元ATP1A1表达量的影响。a：暴露在PZA 6h的神经元ATP1A1的相关灰度值。与对照组相比，10-PZA组神经元的ATP1A1相关灰度值显著降低(#，P0.01)，其余各组间无显著差异（P0.05）；b：暴露在PZA 6h的神经元ATP1A1的平均光密度(200)。NSE表现为绿色荧光，而ATP1A1表现为红色荧光，两者共定位于神经元上。与对照组相比，10-PZA组神经元的ATP1A1光密度降低(#,P0.01)(200)；c：暴露12h的神经元ATP1A1的相关灰度值。与对照组相比，持续暴露在PZA 12h的神经元ATP1A1相关灰度值显著降低(#，P0.01)，其余各组间无显著差异（P0.05）；d：暴露12h的神经元ATP1A1的光密度(200)。与对照组相比，持续暴露在PZA 12h的神经元ATP1A1光密度显著降低(#，P0.01)，其余各组间无显著差异（P0.05）。图3 PZA对神经元电生理的影响。a：暴露于PZA 6h的神经元RP。与对照组相比，10-PZA组神经元的RP值显著增高(n=5，#，P0.01)，其余各组间差异无统计学意义（P0.05）；b：暴露于PZA 6h的神经元AP。与对照组相比，10-PZA组神经元的AP振幅显著降低(n=5，#，P0.01)，其余各组间差异无统计学意义（P0.05）；c：暴露12h的神经元RP。与对照组相比，持续暴露在PZA 12h的神经元的RP值显著增高(n=5，#，P0.01)，其余各组间差异无统计学意义（P0.05）；d：暴露12h的神经元AP。与对照组相比，持续暴露在PZA 12h的神经元的AP振幅显著降低(n=5，#，P0.01)，其余各组间差异无统计学意义（P0.05）。abcdNSEATP1A1DAPIMERGENSEATP1A1DAPIMERGEabcd17 新发传染病电子杂志 2023年6月第 8 卷第 3 期 Electronic Journal of Emerging Infectious Diseases,June 2023,Vol.8,No.33 讨论PZA具有良好的穿透血脑屏障的作用，是治疗TBM的重要药物21，但来自实验室的数据提示PZA可能会对神经系统造成损害11。PZA在成人体内半衰期约为6h20，所以我们将PZA孵育神经元的时间定为6h。我们首先通过光学显微镜观察了不同浓度的PZA对神经元形态的影响，结果显示PZA并不影响神经元的形态结构。在此基础上我们进一步检测了神经元的存活率，MTT结果显示神经元的存活率无显著变化。虽然PZA孵育6h并不影响神经元的形态结构和存活率，但可能会出现细胞的能量代谢障碍，因为在CNS损伤的早期大多有能量代谢的障碍22。为了验证PZA是否会影响CNS的能量代谢，我们针对神经元的能量代谢进行了下一步研究。ATP是神经元的主要能量来源，也是评估细胞能量代谢常用的指标23。在摄取乳酸、葡萄糖等能量代谢底物后，神经元通过三羧酸循环将这些底物转换为ATP12。本次我们通过检测ATP的变化来研究PZA对神经元能量代谢的影响。通过对ATP的检测，我们发现在10-PZA组的神经元中，ATP含量显著降低，可以认为高浓度的PZA干扰了神经元的能量代谢。ATP的代谢障碍可以引起一系列严重后果，如细胞活性降低24、细胞损伤25，甚至是细胞凋亡和坏死26。10mol/L的PZA孵育6h可导致神经元ATP含量降低，但并不影响神经元的存活率。研究证实，细胞内ATP的长期维持在一个较低的浓度，细胞会逐渐出现结构性的损伤，且这种损伤是不可逆的25。我们接下来的实验也证实了这一点：10mol/L的PZA持续孵育12h，神经元会出现细胞水肿、细胞破裂和神经网络结构改变等。我们还观察到神经元存活率降低，ATP代谢紊乱。相反，神经元在PZA孵育6h后更换正常培养基，细胞形态、细胞存活率和ATP含量无明显改变。临床上对CNS损伤的诊断主要是以神经系统体格检查和影像检查为诊断依据，但如果出现神经系统检查阳性体征或者影像检查的改变则意味着CNS已经出现了结构上的改变，属于不可逆的损伤27。在细胞出现结构性的损伤之前，本研究观察到神经元ATP代谢发生紊乱。ATP代谢紊乱最先产生的不良后果就是体内元素离子的分布异常，尤其是以Na+、K+最为明显28。NKA是Na+、K+转运的重要蛋白，其中亚基发挥了主要作用29。亚基在神经元中主要以1亚基（ATP1A1）为主，是影响神经元能量代谢和AP的重要因素18。本研究发现10mol/L的PZA孵育神经元6h，可引起ATP1A1表达量降低，可能是由于PZA抑制了神经元的ATP成，从而导致ATP1A1表达降低；也可能由于PZA直接作用于ATP1A1，导致蛋白表达降低。PZA持续作用于神经元后，ATP1A1仍处于低表达状态，当及时恢复正常培养，ATP1A1可以恢复正常水平。为了进一步验证PZA对神经元活性的影响，有研究通过膜片钳技术检测了神经元的RP和AP两个反映细胞活性的基础指标30-31。Lamas等32认为RP数值升高的神经元兴奋阈值也随之升高，细胞需要接收更强的刺激才能产生动作电位，提示了神经元活性降低。本研究发现10-PZA组神经元的RP数值显著升高，提示了神经元活性受到抑制。本研究的蛋白印迹和神经电生理的结果提示，PZA能够抑制ATP的合成以及ATP1A1的表达以及影响细胞的活性；在被PZA孵育6h后更换正常培养基，神经元的细胞形态、细胞存活率、ATP水平、ATP1A1表达量、RP和AP与对照组相比无明显差别，这也提示了及时祛除诱因可以有效地保护神经元。综上，本次研究提示了PZA虽然可影响神经元的能量代谢，但这种影响是可逆的。因此，我们需要规范使用PZA，同时监控血药浓度，避免用药过量造成神经元不可逆的损伤。参考文献1 RUIZ-TORNERO AM,SNCHEZ-RECIO R.Tuberculosis and socioeconomic factors in spanish population:a systematic review J.Rev Esp Salud Publica,2022,96:e202212089.2 DONOVAN J,THWAITES GE,HUYNH J.Tuberculous meningitis:where to from here?J.Curr Opin Infect Dis,2020,33(3):259-266.3 LI L,LV Y,SU L,et al.Epidemiology of extrapulmonary tuberculosis in central Guangxi from 2016 to 2021J.Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2023,42(2):129-140.4 WILKINSON R J,ROHLWINK U,MISRA U K,et al.Tuberculous meningitis J.Nat Rev Neurol,2017,13(10):581-598.5 MA XP,LI JM,ZHOU D,et al.Direct economic burden of patients with tuberculous meningitis in western China J.Acta Neurol Scand,2021,144(5):535-545.6 冯俊,颜兴艳,文江雄,等.95例成人结核性脑膜炎临床分析 J/CD.新发传染病电子杂志,2018,3(1):12-14,20.7 WAIT JW,SCHOEMAN JF.Behaviour profiles after tuberculous meningitis J.J Trop Pediatr,2010,56(3):166-171.8 LEONARD JM.Central Nervous System Tuberculosis J.Microbiol Spectr,2017,5(2):1-10.9 MANJEESE W,MVUBU NE,STEYN AJC,et al.Mycobacterium tuberculosis causes a leaky blood-brain barrier and neuroinflammation in the prefrontal cortex and cerebellum regions of infected mice offspringJ.Int J Dev Neurosci,2021,81(5):428-437.10 CARROLL MW,LEE M,CAI Y,et al.Frequency of adverse 新发传染病电子杂志 2023年6月第 8 卷第 3 期 Electronic Journal of Emerging Infectious Diseases,June 2023,Vol.8,No.318【收稿日期】2022-11-18reactions to first-and second-line anti-tuberculosis chemotherapy in a Korean cohort J.Int J Tuberc Lung Dis,2012,16(7):961-966.11 WANG X,WU F,ZOU H,et al.Neurodevelopmental toxicity of pyrazinamide to larval zebrafish and the restoration after intoxication withdrawal J.J Appl Toxicol,2022,42(7):1276-1286.12 BIGBEE JW.Cells of the Central Nervous System:An Overview of Their Structure and Function J.Adv Neurobiol,2023,29:41-64.13 HOLM TH,LYKKE-HARTMANN K.Insights into the Pathology of the alpha3 Na(+)/K(+)-ATPase Ion Pump in Neurological Disorders;Lessons from Animal Models J.Front Physiol,2016,7:209.14 HOWARTH C,GLEESON P,ATTWELL D.Updated Energy Budgets for Neural Computation in the Neocortex and Cerebellum J.J Cereb Blood Flow Metab,2012,32(7):1222-1232.15 YI G,WANG J,WEI X,et al.Energy Cost of Action Potential Generation and Propagation in Thalamocortical Relay Neurons During Deep Brain Stimulation J.IEEE Trans Biomed Eng,2019,66(12):3457-3471.16 KEY J,MUELLER AK,GISPERT S,et al.Ubiquitylome profiling of Parkin-null brain reveals dysregulation of calcium homeostasis factors ATP1A2,Hippocalcin and GNA11,reflected by altered firing of noradrenergic neurons J.Neurobiol Dis,2019,127:114-1130.17 SHAMRAJ OI,LINGREL JB.A putative fourth Na+,K(+)-ATPase alpha-subunit gene is expressed in testis J.Proc Natl Acad Sci U S A,1994,91(26):12952-12956.18 BERRET E,NEHME B,HENRY M,et al.Regulation of central Na+detection requires the cooperative action of the NaX channel and alpha1 Isoform of Na+/K+-ATPase in the Na+-sensor neuronal population J.J Neurosci,2013,33(7):3067-3078.19 LI S,HUANG H,WEI X,et al.The recycling of AMPA receptors/GABAa receptors is related to neuronal excitation/inhibition imbalance and may be regulated by KIF5A J.Ann Transl Med,2022,10(20):1103.20 ZHU M,STARKE JR,BURMAN WJ,et al.Population pharmacokinetic modeling of pyrazinamide in children and adults with tuberculosis J.Pharmacotherapy,2002,22(