利用CRISPR_Cas9基因编辑技术构建伪狂犬病病毒UL21基因缺失重组病毒.pdf

AnimalHusbandry&VeterinaryVeoicine(6)：10 1-10 7.MA Z C,LIU X,BAI J,et al.Construction of recombinant pseudorabies virus with UL21genedeletionusingtheCRISPR/Cas9gene-editingtechnologyJ101-107.马梓承，刘星，白娟，等.利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建伪狂犬病病毒UL21基因缺失重组病毒J.畜牧与兽医，2 0 2 3，55（6）：10120233年第6 期第55卷畜牧与兽医利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术构建伪狂犬病病毒UL21 基因缺失重组病毒马梓承，刘星*，白娟，高雁，姜平（南京农业大学/农业农村部动物细菌学重点实验室，江苏南京210095)摘要：旨在构建伪狂犬病病毒（PRV）U L2 1基因缺失重组病毒。采用规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白系统9（CRISPR/Cas9）基因编辑技术，设计针对UL21的单导向RNA（s g RNA），并构建UL21基因左右两侧同源臂质粒（pUC19UL21-Left-Right-CFP），将其与PRV基因组共转染HEK-293T细胞，通过蚀斑纯化获得PRV-U L2 1病毒，并通过PCR和Westernblot检测方法鉴定该毒株成功缺失了UL21基因。结果表明，CRISPR/Cas9技术可用于构建PRV基因缺失重组病毒，为PRV致病机制研究提供重要依据。关键词：伪狂犬病病毒；UL21；CRISPR/Ca s 9；基因缺失中图分类号：S852.65文献标志码：A文章编号：0 52 9-5130(2 0 2 3)0 6-0 10 1-0 7Construction of recombinant pseudorabies virus with UL21 gene deletion usingthe CRISPR/Cas9 gene-editing technologyMA Zicheng,LIU Xing*,BAI Juan,GAO Yanni,JIANG Ping(Nanjing Agriculture University/Key Laboratory of Animal Bacteriology,Ministry of Agricultureand Rural Affairs,Nanjing 210095,China)Abstract:In order to construct a UL21 gene deletion recombinant virus of PRV,the CRISPR/Cas9 genome editing technology was usedhere to design an sgRNA targeting UL21,and a Left&Right homologous arms plasmid of the UL21 gene(pUC19 UL21-left-right-GFP)were constructed.Then,the above-mentioned plasmid and the PRV genome DNA were co-transfected into HEK-293T cells.The recombi-nant PRV with UL21 gene deletion(PRV-U L2 1)w a s o b t a i n e d b y p l a q u e p u r i f i c a t i o n,w h i c h w a s a l s o c o n f i r me d b y PCR a n d W e s t e r nblot.The results indicated that the CRISPR/Cas9 technology could be used to construct recombinant pseudorabies viruses with deletions of theviral gene.This study laid an important foundation for future research on the pathogenic mechanism of PRV.Keywords:pseudorabies virus;UL21;CRISPR/Cas9;gene deletionCRISPR/Cas9是继锌指核酸酶（ZFN）、转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术，具有基因编辑和基因修饰效率高、操作简便及成本低廉等优点，可用于基因敲除、基因敲入、基因抑制、基因激活、多重编辑和功能基因组筛选等，成为当今主流的基因编辑系统 1-3O收稿日期：2 0 2 3-0 2-0 8；修回日期：2 0 2 3-0 4-10基金项目：国家自然科学基金项目（32 2 7 2 98 5）；国家现代农业产业技术体系专项（CARS-35）第一作者：马梓承，男，博士研究生*通信作者：姜平，教授，主要从事动物传染病学的教学与研究工作，E-mail；j i a n g p n j a u.e d u.c n；刘星，副教授，主要从事动物病毒免疫与致病机制研究工作，E-mail：x i n g l i u n j a u.e d u.c n。伪狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）是危害我国养猪业重要病原，可引起妊娠母猪流产、死胎，公猪不育，仔猪共济失调及死亡 4-5。2 0 11 年我国PRV毒株出现基因变异，毒力增强 6-7 。我国学者利用基因编辑技术构建的gl、g E 和TK 基因缺失疫苗，具有较好免疫保护效力 8-9。本研究在发现PRVUL21基因免疫抑制功能基础上，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功拯救了UL21缺失的重组PRV，为该病毒致病机制研究奠定了重要基础。1材料与方法1.1细胞与毒株HEK-293T、PK-15、V e r o 细胞，本实验室保存；PRVZJO1毒株未（GenBank：K M 0 6 138 1.1），由102AnimalHusbandry&VeterinaryMedicineNo.6Vol.552023本实验室分离保存 7 1.2主要试剂PrimeSTAR Mix、D L2 0 0 0 D NA M a r k e r、D L50 0 0DNAMarker购自TaKaRa公司；双荧光素酶报告系统检测试剂购自Promega公司；DNA提取试剂盒购自Omega公司；LipofectamineTM3000、限制性内切酶Hind、Ba m H I、K p n I、Ec o RI、Bp i I 购自Thermo公司；Taq酶、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自Vazyme公司；低熔点琼脂糖购自BIO-RAD公司；质粒pUC19、PX335购自Addgene公司；感受态细胞购买于TransGene公司；鼠抗UL21蛋白抗体，本实验室制备；Flag抗体、HRP标记羊抗鼠IgG购自Proteintech公司。1.3主要仪器设备普通PCR仪购自Eppendorf公司，凝胶电泳成像系统和免疫印迹法成像系统均购自Tanon公司，荧光显微镜购自Zeiss公司1.4抑制干扰素-（I FN-）启动子活性的PRV毒力蛋白筛选将HEK-293T细胞接种于2 4孔板，培养至细胞密度达到7 5%，采用LipofectamineTM3000转染试剂，按说明书方法转染如下质粒或DNA：50 n g p G L3-Basic-IFN-（IFN-启动子荧光素酶报告质粒），10ngpRL-TK（海肾荧光素酶内参对照质粒），500ngpCMV-cGAS和50 ngpCMV-STING表达质粒（刺激cGAS和STING干扰素通路分子），PRV真核表达质粒（UL13、U L16、U L2 1、U L2 3、U L41、UL47、U L48、U L49、U L50、U L56、EPO、U S3克隆至pCDH）。转染2 4h后，加人细胞裂解液收集细胞，根据说明书测定荧光素酶活性。LARII用于测定荧光素酶活性，Stop&Glo?Reagent用于测定海肾荧光素酶活性，读取OD值，计算相对荧光素酶活性（目的基因启动子活性与内参荧光素酶活性的比值），比较不同转染组IFN-启动子活性差异1.5PRVUL21基因缺失重组病毒的构建1.5.1SgRNA和PCR引物设计与合成在sgRNA设计网站（https:/zlab.bio/guide-design-resources）中输人ZJ01毒株的UL21基因编码区，选择2 对sgRNA引物，在金斯瑞生物科技公司合成其正义链及反义链10 。序列如表1所示。根据PRVUL21基因序列位置前后8 0 0 bp左右用于扩增UL21左侧同源臂（UL21-L）及右侧同源臂（UL21-R），参照pUC19载体的多克隆位点区，利用分子生物学软件PrimerPremier5.0设计UL21左、右同源臂特异性扩增引物（表1）。左臂上游引物酶切位点为Hind，下游引物酶切位点为BamHI；右臂上游引物酶切位点为KpnI，下游引物酶切位点为EcoRI。替换UL21基因的绿色荧光蛋白（CFP）同源臂由CFP表达质粒扩增表1sgRNA和PCR引物序列用途引物名称序列（5 3)长度/bpUL21-sgRNA1_FCACCGGGCGGTCATGATGAGCGACGUL21-sgRNA1_RAAACCGTCGCTCATCATGACCGCCCSgRNA引物UL21-sgRNA2_FCACCGCCTGGTGCACGATCGTGCTC577UL21-sgRNA2_RAAACGAGCACGATCGTGCACCAGGCPX335-sgRNA_RCCATCGCTGCACAAAATAATTAAUL21-L_FTCTAAGCTTGACGGCGGTCCGGCGGCGTTTCGGC838UL21-L_RTATGGATCCACAAATCACACGTCCGTTCTCCCGTUL21-R_FTATGGTACCGGCGGCGGACACACGCGGCGCGGCA840UL21-R_RTATGAATTCAGGTGCCGAGCAGCGCGTCGAACTCUL21-GFP_FGAACGGACGTGTGATTTGTGGATCCGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGPCR引物1300UL21-GFP_RGCCGCGTGTGTCCGCCGCCGGTACCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTUL21-FATGGAGTTTGAGTACCAGAGC1 599UL21-RTTAACGGTTTTTATTGAGGACGATGGAGATgB-FCCCCCACGACCACCTTGCCGAC723gB-RCACCTACGACCACATCCAGGCG1032023年畜牧与兽医第6 期第55卷1.5.2CRISPR/Cas9-SgRNA质粒的构建及验证将靶向UL21基因2 组sgRNA引物（UL21-sgRNA1、U L2 1-s g RNA 2）（表1）分别退火成双链，反应体系：上下游引物各10 mol/L，10 T 4Li g a s eBuffer（NEB）2 L，T 4 PNK（NEB）0.5 L,ddH,0补足2 0 L。退火条件：37 30 min，955min，每分钟降5直至10 质粒构建与鉴定：50 L体系中加人2 gpX335空载体，2 LBpiI酶，10 xBuffer5L，其余用水补足，37 酶切1h。将酶切后的载体和目的基因24连接2 h，最后将连接产物转化到DH5感受态细胞中，涂布氨苄抗性平板，37 培养12 h。挑取平板单克隆菌落，利用PCR检测阳性菌液。以PX335UL21-sgRNA1重组质粒为例，PCR反应体系25L：加人12.5LTaq酶，9.5LddH,0，1LUL21-sgRNA1上游特异性引物，1LPX335下游通用鉴定引物（根据载体序列设计），1L模板（引物序列见表1）。PCR反应条件：95预变性5min；9530 s，6 2 30 s，7 2 40 s，循环35次；最后7 2 延伸5min。若能成功扩增出57 7 bp条带，则证明PX335UL21-sgRNA1重组质粒构建成功。因为上游引物为sgRNA特异性序列，只有当sgRNA克隆人PX335载体后才能扩增出57 7 bp条带，而空载体中不带有sgRNA序列，故无法扩增出指定大小条带。1.5.3UL21基因同源臂重组质粒的构建扩增ZJ01毒株UL21起始密码子序列前8 38 bp，作为UL21左侧同源臂，并通过hind、Ba m H I 酶切位点将其连接到pUC19空载体上，构建pUC19UL21-L重组质粒。同理扩增UL21终止密码子后840bp，用于UL21右侧同源臂扩增，并通过KpnI、EcoRI酶切位点构建pUC19UL21-L-R重组质粒。PCR反应体系如下：12.5LPrimeSTAR，8.5LddH,O，1LDMSO，U L2 1-L上/下游引物各1L（表1），1LPRVDNA。PCR反应条件：98 预变性1s；9 8 10 s，6 2 5s，7 2 30 s，循环35次；最后7 2 延伸5min（U L2 1右臂同理）。最后利用PCR扩增GFP表达基因片段（约1300bp），通过BamHI，K p n I 酶切位点连接到pUC19 UL21-L-R，构建pUC19 UL21-L-R-GFP 重组质粒。PCR反应体系如下：12.5LPrimeSTAR，9.5LddH,0，U L2 1-CFP上/下游引物各1L（表1），1LGFP模板质粒。PCR反应条件：98 预变性1s；9 8 10 s，6 2 5s，7 2 45s，循环35次；最后7 2 延伸5min。1.5.4PRVUL21基因缺失病毒的拯救病毒基因组DNA提取：PRVZJO1毒株接种PK-15细胞，待病变达到7 5%时，加人细胞裂解液 37裂解15min，56 水浴锅孵育3h。具体提取操作方法见【12。提取成功后加入1mL双蒸水，室温溶解2 0 min，-8 0 分装保存。病毒拯救：将HEK-293T细胞接种到6 孔板中，细胞密度达到7 5%时转染如下质粒或DNA：2 ugPRV基因组DNA，PX335U L2 1s g RNA 1/2 质粒各0.5g，p U C19U L2 1-L-R-CFP质粒2 g。于DMEM混合，用LipofectamineTM3000转染试剂转染至细胞中，同时设置只转染PRV基因组DNA的阳性对照孔和空白对照组。转染48 h后，等到细胞出现30%病变后，用荧光显微镜观察；待细胞病变达到50%时收获细胞，冻融2 次，离心收取上清液，-80保存备用。病毒纯化：取上述病毒液进行10 倍倍比稀释，接种于含Vero细胞的6 孔细胞板，孵育1h后，弃掉上清液，加人终浓度为1%FBS的琼脂糖DMEM混合液，37 培养7 2 h。荧光显微镜下观察筛选绿色病毒蚀斑，挑取带有绿色荧光的单个蚀斑接种到2 4孔细胞板，37 培养7 2 h。荧光显微镜下观察筛选绿色病变的单个蚀斑，继续上述方法进行下一轮纯化，直至视野中病变均为绿色蚀斑。以此方法总计纯化5轮，获得PRV-U L2 1。1.6PRV-AUL21病毒鉴定1.6.1PCR 检测 gB 和 UL211基因根据ZJO1毒株序列，设计UL21和gB检测引物（表1），PCR反应为：12.5L Taq酶，8.5LddH,O，1LDMSO，上/下游引物各1L，1LPRVDNA。PCR反应条件：95预变性5min;95 30 s,6 2 30 s，7 2 1 m in 40 s(g B 50 s),循环35次；最后7 2 延伸5min。采用1.0%琼脂糖凝胶电泳K（12 0 V），观察特异条带1.6.2Western blot 检测 UL21 基因以感染复数（MOI）为1的病毒接种剂量将野生型PRV、PRV-U L2 1接种到含Vero细胞单层的6 孔细胞板中，同时设立未感染病毒的细胞作为阴性对照。12 h后加人裂解液收集细胞样品。蛋白转印至NC膜后，常温封闭2 h；以鼠源UL21多克隆抗体为一抗，4孵育过夜；以HRP标记羊抗鼠IgG为二抗，常温孵育1h，观察特异条带。1.7病毒生物学特性1.7.1病毒滴度测定按文献13方法，将野生型PRV、PRV-AUL21倍比稀释后接种到含PK-15细胞的96 孔细胞104No.6Vol.552023Animal Husbandry&Veterinary Medicine板中测定病毒滴度，同时设立未感染病毒的细胞作为阴性对照。1.7.2传代稳定性取PRV-U L2 1传代至F5代，使用特异性引物PCR检测UL21和gB基因（表1），判定重组病毒缺失基因遗传稳定性。1.7.3病毒蚀斑试验将PRV-U L2 1及其野生型PRV接种于Vero细胞单层的6 孔细胞板，孵育1h后弃掉病毒液。加人终浓度为1%FBS的琼脂糖DMEM混合液，培养72h。待细胞培养板中出现明显噬斑时，加人结晶紫染液，室温染色12 h，观察蚀斑形态大小。2结果与分析2.1PRVUL21显著抑制IFN-启动子活性为筛选抑制IFN-表达的PRV毒力蛋白，构建UL13、U L16、U L2 1、U L2 3、U L41、U L47、U L48、UL49、U L50、U L56、EPO、U S3真核表达质粒，利用IFN-启动子双荧光报告系统进行了检测，结果显示，UL21显著抑制cGAS-STING刺激的IFN-启动子活性生（图1）。607nsnsnsns*40*20*0质粒eNec?UL13UL16UL48UL49UL50CGAS+STING+kDa1007055Flag403525-actin40与Vec比较，*表示P0.05，*表示P0.05图1PRV毒力蛋白对IFN-启动子活性影响2.2敲除UL21基因的CRISPR/Cas9sgRNA重组质粒构建与鉴定利用UL21-sgRNA上游特异性引物与针对PX335质粒序列设计的下游通用引物对UL21-sgRNA1和UL21-sgRNA2进行菌液PCR鉴定，并设立空载对照组。结果UL21-sgRNA113号菌液样品均扩增出约577bp特异性条带（图2 A），U L2 1-s g RNA 2 5 7 号菌液样品也均扩增出约57 7 bp特异性条带（图2 B）。AM1234BM5678bpbp200020001500150010001000750750500500250250100100M.DL2000DNA分子标准；1 3.UL21-sgRNA1菌液样品；4.空载对照；5 7.UL21-sgRNA2菌液样品；8.空载对照图2靶向UL21目的基因sgRNA1（A）和sgRNA2（B）重组质粒的构建与PCR鉴定2.3用于敲除UL21基因同源臂重组质粒的构建与鉴定以ZJO1毒株UL21左侧同源臂PCR产物（8 38 b p）克隆人pUC19，获得重组质粒pUC19UL21-L，双酶切鉴定，目的基因大小正确（图3A）。将PRVZJ01株UL21右侧同源臂PCR产物勿（8 40bp），克隆人pUC19UL21-L质粒，获得pUC19UL21-L-R重组质粒，经双酶切鉴定，目的基因大小正确（UL21左侧+右侧同源臂基因=16 7 8 bp）（图3B），表明UL21右侧同源臂基因已成功连接到pUC19UL21-L重组载体。随后，将GFP基因克隆人pUC19 UL21-L-R 获得 pUC19 UL21-L-R-GFP。双酶切鉴定结果正确（图3C）。目的基因测序证明重组质粒构建成功2.4PRV-AUL21株的拯救和鉴定将拯救的缺失病毒梯度稀释后接种Vero细胞单层，结果见图4A。挑取带有GFP荧光的蚀斑，重复上述操作纯化5次后，即获得PRV-U L2 1。PCR检测UL21及gB基因，结果见图4B。PRV-U L2 1的UL21基因阴性，野生型PRVUL21基因阳性，PRV-U L2 1及其野生性PRVgB基因均阳性。Westernblot结果证明UL21抗体仅与野生型PRV发生特异性反应立（图4C）。105.20233年畜牧与兽医第6 期第55卷ApUC19UL21-LBpUC19UL21-L-RCpUC19UL21-L-R-GFPM112M234M156M278M1910M21112bpbpbpbpbpbp2.00050002.00050002.00050001500300015003000150030002.00020002.000100015001000150010001500750750750100010001000500750500750500750500250500250500250250100250100250100100100100M1.DL2000DNA分子标准；M2.DL5000DNA分子标准；1.UL21-LPCR扩增；2.空白对照；3.pUC19UL21-L双酶切；4.pUC19UL21-L；5.UL21-RPCR扩增；6.空白对照；7.pUC19UL21-L-R双酶切；8.pUC19UL21-L-R；9.CFPPCR扩增；10.空白对照；11.pUC19UL21-L-R-GFP双酶切;12.pUC19 UL21-L-R-CFP图3UL21同源臂重组质粒的构建与双酶切鉴定A正常视野B荧光视野CUL21gBDMockAUL21MockbpbpMockWTAUL21kDa2000-702.000UL21150015001000gB1000-100750750-actin40500500250250100100A.UL21缺失病毒正常视野；B.UL21缺失病毒荧光视野；C.PCR鉴定：M.DL2000DNA分子标准；AUL21.UL21缺失病毒；WT.野生型PRV；Mock.阴性对照；D.WesternBlot鉴定：M.蛋白分子标准；WT.野生型PRV；A U L2 1.U L2 1缺失病毒；Mock.空白对照图4PRV-AUL21病毒的拯救和鉴定2.5PRV-AUL21生物学特性为进一步研究PRV-U L2 1病毒生物学特性，测定了PRV-U L2 1病毒滴度，发现PRV缺失UL21后病毒滴度降低天（图5A）；PCR检测PRV-U L2 1F1F5代UL21及gB基因（图5B），表明缺失毒遗传稳定。病毒蚀斑形态见图5C，PRV-A U L2 1蚀斑明显小于野生型PRV，说明PRV缺失UL21基因后在细胞间传播能力下降。106No.6Vol.55Animal Husbandry&Veterinary Medicine2023ABUL21gB10-*MF1F2F3F4F5+MF1F2F3F4F5+bpbp820002000150015006-100010007507504-5005002502502-1001000WTAUL21CZJO1WTZJ01U L2 1A.缺失病毒滴度测定；B.缺失病毒传代稳定性测定；C.蚀斑试验*表示P0.01图5PRV-AUL21病毒生物学特性鉴定3讨论CRISPR是在细菌和古生菌中发现的一类重要外源基因，Cas蛋白家族共同构成细菌自身适应性免疫系统的重要部分，用以抵御外来质粒或噬菌体的入侵。CRISPR系统最早于2 0 世纪90 年代发现，日本科学家在研究细菌DNA结构时发现大肠杆菌DNA中会存在一段重复序列，研究表明这是细菌及古细菌在演化过程中形成的一种适应性免疫防御，用于抵抗外来人侵的病毒及外源DNAL14-16。目前，CRISPR/Cas9技术已经成功用于很多病毒基因编辑，包括人类免疫缺陷病毒（HIV）、单纯疱疹病毒（HSV）和PRV 等 17-19与ZFN和TALEN技术相比，CRISPR/Cas9系统具有便捷、高效和多功能的基因编辑优势，逐渐成为当前分子生物学家常用的基因组编辑系统，并一直更新进步。CRISPR/Cas9系统发挥作用的核心元件为Cas9蛋白和针对目的基因的sgRNA。设计的sgRNA通过识别目的基因组序列，引导Cas9核酸酶切割DNA双链，在DNA断裂修复的过程中将基因敲除或将外源基因敲入，最终达到对基因组DNA编辑的目的。直接将断裂的DNA双链进行连接，从而导致被切割的基因丢失，此为基因的敲除。在基因切割的同时，通过外源手段将某种基因插人到基因组中，此为基因的插人 2 0-2 1。CRISPR/Cas9 的切割靶点特异性主要由sgRNA决定，但是由于细胞及病毒基因组庞大，排列复杂，经常出现与sgRNA互补的基因组位置处切割引起的脱靶效应，这种脱靶效应严重影响了基因编辑效率 2 。本研究利用网站设计针对UL21基因的sgRNA，因为上游引物为sgRNA特异性序列，所以仅当sgRNA克隆人PX335载体后才能扩增出指定大小条带，而空载体中不带有sgRNA序列，故无法扩增出指定大小条带。将上述验证成功的UL21-sgRNA，带有CFP的UL21基因同源臂和PRV基因组同时转染HEK-293T细胞，拯救获得PRVUL21基因缺失毒株，为该病毒致病机制研究奠定了重要基础。PRV属于疱疹病毒科，疱疹病毒属，与HSV-1相似，成熟的病毒颗粒由4层结构组成，包括病毒核心双股DNA、衣壳、被膜和囊膜莫 2 2-2 4。被膜连接衣壳和囊膜，与衣壳形成复合体，将病毒基因运输至细胞核，调控宿主细胞蛋白表达，参与病毒粒子成熟等 2 5-2 6 。UL21是疱疹病毒中一种保守的被膜蛋白 2 7 ，可募集宿主的动力蛋白或驱动蛋白-1，从而影响HSV-1和PRV病毒衣壳的成熟及病毒粒子的释放 2 8-2 9。UL21与Roadblock-1的相互作用，有助于PRV感染过程中轴突的运输从而利于神经侵袭 30 UL21可以利用蛋白磷酸酶，调节特定细胞和病毒蛋白的磷酸化，从而促进HSV-1的复制 31。本研究构建的PRV-U L2 1相较于其亲本病毒滴度降低，蚀斑形态减小，为UL21基因功能研究提供了基础材料。10720233年畜牧与兽医第6 期第55卷参考文献：1HANSEN K,COUSSENS M J,SAGO J,et al.Genome editing withcompozr custom zinc finger nucleases（ZFNs)J.J Vis Exp,2012(64):e3304.2RAN F A,HSU P D,WRICHT J,et al.Genome engineering usingthe CRISPR-Cas9 system J.Nat Protoc,2013,8(11):2281-2308.3GUILINGER J P,PATTANAYAK V,REYON D,et al.Broad spe-cificity profiling of TALENs results in engineered nucleases with im-proved DNA-cleavage specificity J.Nat 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