两株亚胺培南中介奇异变形杆菌耐药性及基因组测序分析.pdf

26Medical Laboratory Science and Clinics,2023,Vol.34,No.8医学检验与临床2 0 2 3年第34卷第8 期doi:10.3969/j.issn.1673-5013.2023.08.007两株亚胺培南中介奇异变形杆菌耐药性及基因组测序分析王芹（利津县中医院检验科，山东东营营2 57 447)摘要目的：对我院分离的两株亚胺培南中介奇异变形杆菌进行全基因组测序并分析其耐药特征。方法：选取两株亚胺培南中介奇异变形杆菌（II-PMI，Im i p e n e m-In t e r m e d i a t e Pr o t e u s m i r a b i l i s)。按照CLSI2020年公布的药敏方法和药物折点进行药敏实验，应用vitek-2compact及配套GN13（梅里埃，法国）革兰氏阴性菌药敏卡片，进行药敏检测。菌株经质谱仪鉴定后应用试剂盒提取基因组DNA，并应用Ilumina 测序平台进行测序。下机数据应用SPAdes3.9.0进行基因组拼接。抗菌药物耐药基因（ARGs）应用Abricate0.8的Card数据库预测，并以plasmidFinder数据库对细菌携带质粒类型进行预测。结果：2 0 14年-2 0 2 1年各选取一株I-PMI菌株，均来自中老年病人，病人均具有基础疾病。2 0 14年分离的II-PMI菌株对临床常用药物具有较高的耐药性，2 0 2 1年分离的菌株除亚胺培南中介外，其他药物均为敏感。2 0 14年分离的II-PMI菌株检测到19 种耐药相关基因，2 0 2 1年菌株检测到2 种耐药相关基因。两株菌均预测到了Col3M_1型质粒。结论：两株菌耐药及耐药基因携带情况有较大差异，两株菌携带的耐药基因与相应临床常用药物的药敏表型具有较高的一致性。加强耐药和分子流行病学监测与研究有利于明确细菌的耐药性机制，进而为控制细菌耐药性及院内感染传播。关键词亚胺培南；奇异变形杆菌；全基因组测序；细菌耐药Analyzing the Molecular Characteristics and Drug Susceptibility of two Imipenem-Intermediate Proteus Mirabilis by Whole Genome SequencingWANGQin(Department of Clinical Laboratory,Lijin Hospital of traditional Chinese Medicine,Shandong Dongying 257447)Abstractl Objective:To characterize the mechanism underlying imipenem nonsusceptibility of two Proteus mirabilis strains isolatedfrom our hospital by Whole genome sequencing(WGS).Method:Two strains of Imipenem-Intermediate Proteus mirabilis(II-PMI)were selected.The drug susceptibility test was carried out and susceptibility was explained by CLSI in 2020.The drug susceptibility test wasperformed using the vitek-2 compact and the supporting GN13(Merieux,France)Gram-negative bacteria drug susceptibility card.Afterthe strains were identified by mass spectrometer,the genomic DNA was extracted and sequenced by the Illumina sequencing platform.Genome assembly was performed using SPAdes 3.9.0 for sequencing data.Antimicrobial resistance genes(ARGs)were predicted using theCard database of Abricate O0.8,and the plasmid types were predicted using the Plasmid Finder database.Results:One II-PMI strain wasselected in 2014 and one in 2021,all of which were from middle-aged and elderly patients with underlying diseases.The II-PMI strainisolated in 2014 had high resistance to commonly used clinical drugs,and the strain isolated in 2021 was sensitive to other drugs exceptimipenem.Nineteen drug resistance-related genes were detected in the II-PMI strain isolated in 2014,and two drug resistance-relatedgenes were detected in the 2021 strain.Col3M_1 type plasmids were predicted for both strains.Conclusion:The drug resistance and drugresistance genes carried by the two strains were quite different.The drug resistance genes carried by the two strains were highly consistentwith the drug susceptibility phenotypes of the corresponding commonly used clinical drugs.Strengthening drug resistance and molecularepidemiological monitoring and research is conducive to clarify the mechanism of bacterial drug resistance,thereby controlling bacterialdrug resistance and the spread of nosocomial infections.Key words Imipenem;Proteus mirabilis;Whole genome sequencing,Bacterial resistanceA通讯作者：王芹，E-mail：w a n g q i n 2 7 30 16 3.c o m。医学检验与临床2 0 2 3年第34卷第8 期奇异变形杆菌是肠杆菌科、变形杆菌属细菌，可分布于自然环境，动物微生态环境，是人类肠道的正常菌群，为机会致病菌，可引起，泌尿道，生殖道，皮肤，导管相关性感染等。奇异变形杆菌对包括替加环素、多黏菌素等在内的多种抗菌药物天然耐药2,同时对氟喹诺酮，氨基糖苷类，大环内酯类，头孢类耐药性也不断增加。近年来由碳青霉烯类耐药奇异变形杆菌引起的严重院内感染暴发的案例屡见不鲜13-5。奇异变形杆菌产生碳青霉烯类耐药的机制主要包括外膜渗透性降低和产碳青霉烯酶，后者主要是临床常检测到的blakpc，b l a ND M，b l a v IM，b l a i M p，b l a o x A等碳青霉烯酶，其中以blanDM较为多见6-8 。2019年美国CDC将耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌列为紧急威胁9，说明碳青霉烯类耐药肠杆菌对人类健康的威胁极为巨大。因此，本实验对我院分离的两株亚胺培南中介奇异变形杆菌进行全基因组测序，对其所含有的耐药基因及药敏进行分析研究，为临床治疗提供理论依据，为控制该类细菌院内感染提供思路11-13。1资料与方法1.1菌株收集选取2 0 14年-2 0 2 1年各一株亚胺培南中介奇异变形杆菌，以质谱仪（梅里埃，法国）鉴定菌种，药敏质控菌株Eco：A T CC2 59 2 2。1.2药敏确定按照2 0 2 0 年CLSI公布的药敏方法进行药敏实验，应用vitek-2compact及配套GN13(梅里埃，法国)革兰氏阴性菌药敏卡片，进行药敏检测，检测药物包括：庆大霉素（GEN）、头孢替坦（CTT）、头孢曲松(CRO）、妥布霉素（TOB）、阿米卡星（AMK）、头孢他啶（CAZ）、头孢吡（FEP）、氨苄西林（AMP）、哌拉西林（PIP）、氨苄西林舒巴坦（SAM)、哌拉西林他唑巴坦（TZP）、复方新诺明（SXT)、环丙沙星(CIP)、左氧氟沙星（LVX）和氨曲南（ATM），同时将GN13卡片不包含的药敏应用K-B（O x o id,英国）方法进行药敏实验。纸片法药敏包含的药物有：亚胺培南（IPM）、美罗培南（MEM）、厄他培南（ETP)、头孢噻（CTX）、头孢唑啉（CZO）、头孢呋辛菌株编号性别WQ63男WQ124女Medical Laboratory Science and Clinics,2023,Vol.34,No.81.4基因测序、组装与基因预测应用Ilumina平台进行二代测序(Ilumina,美国)。测序后下机数据应用SPAdes3.9.0进行基因组拼接。抗菌药物耐药基因（ARGs）应用Abricate0.8(https:/ Card 数据库预测，并根据比对目的基因的鉴定值和覆盖度判断基因比对结果，以plasmidFinder数据库预测细菌含有的质粒类型4。2结果2.1菌株分离结果及特点选取菌库中2 0 14年（WQ63号accession:GCA_025660585.1）和2 0 2 1年（WQ124号accession:GCA_025660635.1）各一株II-PMI，W Q 6 3号分离自痰标本，WQ124号分离自血标本。标本分别为重症医学科和神经内科。菌株1株来自男性患者，1株来自女性患者，2 位病人年龄均大于50 岁，2 位病人均具有基础疾病，病人病历特征见表1。2.2菌株药敏结果在选取的临床常用的2 3种抗菌药物中WQ63号菌对除外AMK，A T M，CA Z，CSL，CT T，ET P，FEPMEM，T ZP的药物表现不敏感。WQ124号菌则只对亚胺培南表现出了中介，其他药物均为敏感。两株菌对MEN和ETP均表现为敏感。具体耐药情况见表2。2.3菌株基因特点两株II-PMI菌株组装后大小分别为：4，156，9 34b p，3，8 8 5，2 7 5b p。其中WQ124号菌检测到两种与耐相关的基因tet（J）、C RP，主要表现为四环素、复喹诺酮、大环内酯类抗菌药物耐药；WQ63号菌检测出19 种与耐药相关的基因，这些耐表12 株 I-PMI分离株临床病例特征年龄(岁)住院科室51神经内科55重症医学科27(CXM）、头孢西丁（FOX）和头孢哌酮钠舒巴坦钠(CSL），结果按照CLSI公布的标准判读。1.3基因组提取将保藏菌株接种在哥伦比亚血平板（安图生物，郑州，中国）上，经质谱仪鉴定。鉴定后的菌种接种在LB肉汤培养基（Oxoid，英国）中过夜培养。将菌液转移至EP管中12 0 0 0 r/m离心两分钟弃去上清液，之后按照试剂说明进行基因组提取，提取后基因组-20保存。诊断脑梗后遗症泌尿道感染标本种类痰血日期2014-082021-0928药涵盖大多数临床常用抗菌药物种类，不仅有以往常用的氨基糖苷类、磺胺类、氯霉素及磷霉素等，同时还含有临床级别较高抗菌药物头孢菌素、复喹诺AMKAMPATM CAZWQ63=32=4=64=64 WQ124 166=22=110.55=0.25=1=4 20=1 1=2=1 4=4 3222 1842230262824表3II-PMI 菌株携带各类抗菌药物耐药基因及质粒情况菌株基因WQ124Col3M_1tet0)CRPcatA4WQ63Col13M_1catA4CRPCMY-59AAC(3)-IVAPH(4)-Iasul2tet0)sul3qacHANT(3)-IIacmlA1dfrA17aadA5sul1floRFosA3CTX-M-14QnrD1dfrA12Medical Laboratory Science and Clinics,2023,Vol.34,No.8CIPCRO CTT CZO FEP LVX SAM SXT TOB TZP=32=168 氟喹诺酮类、大环内酯、青霉素氯霉素氯霉素氟喹诺酮类、大环内酯、青霉素头霉素氨基糖苷类氨基糖苷类磺胺类四环素素外排蛋白。磺胺类大肠杆菌质粒DNA中。氟喹诺酮类氨基糖苷类氯霉素二氨基嘧啶氨基糖苷类苷酸转移酶基因。磺胺类其他抗性基因有关。氯霉素磷霉素头孢菌素氟喹诺酮类二氨基嘧啶PIPETPCSL四环素医学检验与临床2 0 2 3年第34卷第8 期3讨论奇异变形杆菌，作为人类肠道正常菌群，近年来逐渐成了重要的医院感染致病菌，因该类菌对多种药物存在固有耐药，且易整合新的耐药基因而获得新的耐药表型，在抗菌药物广泛应用的今天，其在抗菌药物的选择压力下，不断有多重耐药菌导致的严重院内感染报道8 15.16，为病人带来极大的痛苦和经济压力，同时为临床治疗带来了极大挑战17-18，因此本实验选取两株本院临床病人的亚胺培南中介奇异变形杆菌进行了测序并对其基因组特征分析。本实验收集2 0 14年-2 0 2 1年各1株II-PMI菌株，从病例特点看，该菌主要的感染人群为中老年人群，且一般具有基础疾病或者免疫力低下，免疫屏障破坏的患者，这一感染特点与前期研究者报道的奇异变形杆菌感染特点基本一致19-2 0 。本实验选取的2 3种临床常用的抗菌药物，WQ63号菌株对除外AMK、A T M、CA Z、CSL、CT T、ETP、FEP、M EM 和TZP的药物表现不敏感，可见此II-PMI菌株呈现多重耐，而WQ124号菌株对氨基糖苷类，氟喹诺酮类等常用抗菌药物均为敏感，两菌株药敏差异较大可能选菌所属的克隆不同及其所携带的质粒不同等原因有关。本实验用Abricate软件对I-PMI菌株全基因组测序组装数据预测抗菌药物耐药基因，2 株菌所含耐药基因数量有较大差异，这一差异与两株菌药敏表型的差异具有一致性，WQ63号菌含有的药物耐药基因涵盖了临床常用抗菌药物种的较多种类，尤其含有CTX-M-14、Q n r D 1等对头孢菌素类、喹诺酮类药物具有耐药作用叫，使得这类感染菌的用药受到了极大限制。WQ124所含耐药基因较少，主要为外排泵蛋白基因，但是CRP耐药基因对氟喹诺酮类、大环内酯、青霉素等药物具有明显的耐药作用，其耐药谱广，依然需要临床慎重制定用药方案8 12 17。WQ124菌仅对IPM表现出了中介，且预测到的耐药基因tet(J）和catA4一般不引起碳青霉烯类药物耐药，因此两株菌同时携带的CRP基因可能是导致两株细菌的亚胺培南中介原因，该猜想在后续研究中将进一步研究验证。两株II-PMI菌株均携带Col3M_1型质粒，该质粒携带的具体基因和其功能，需要进一步分析质粒基因结构。综上，I-PMI菌株可引起老年等免疫低下人群的多系统感染。两株菌耐药及耐药基因携带情况有较大差异，一株II-PMI菌株对临床大多数常用抗菌Medical Laboratory Science and Clinics,2023,Vol.34,No.829药物具有较高耐药性，另一株情况相对较好。两株菌在携带的耐药基因都对临床常用药物具有明显的耐药作用，因此必须采取措施抑制该类菌的传播，耐药菌的表型和基因型检测是监测细菌耐药性具有重要手段，需要加强耐药和分子流行病学研究，从而控制细菌耐药传播及感染。参考文献1 Girlich D,Bonnin RA,Dortet L,Naas T.Genetics of Ac-quired Antibiotic Resistance Genes in Proteus spp J.Frontiers in microbiology,2020,11:256.2 Zheng XR,Sun YH,Zhu JH,et al.Two novel bla-NDM-1-harbouring transposons on pPrY2001-likeplasmids coexisting with a novel cfr-encoding plas-mid in food animal source EnterobacteriaceaelJournalof global antimicrobial resistance,2021,26:222-6.3石晓路,扈庆华,林一曼,等.致腹泻奇异变形杆菌病原学及其分子特征研究.中华流行病学杂志,2 0 14,35(06):724-728.4李鑫,杨继勇.碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌分布与流行特征研究进展.中华微生物学和免疫学杂志，2019,39(4):306-310.5肖伟强,沈勇,许青霞.尿液分离的奇异变形杆菌的耐药性及其产超广谱-酰胺酶的检测分析.中国实用医刊,2 0 18,45(12):10-13.6 Selmi R,Tayh G,Srairi S,et al.Prevalence,risk factorsand emergence of extended-spectrum beta-lactamaseproducing-,carbapenem-and colistin-resistant En-terobacterales isolated from wild boar(Sus scrofa)inTunisiaJ.Microb Pathog,2022,163:105385.7 Said 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