兰茂牛肝菌酶解液的制备工艺优化及滋味评价.pdf

现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.9 72 兰茂牛肝菌酶解液的制备工艺优化及滋味评价 张沙沙1，杨宁2，张微思1，罗晓莉1，周锫1，曹晶晶1，孙达锋1*（1.中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南昆明 650221）（2.云南省食用菌产业发展研究院，云南昆明 650221）摘要：为了提高兰茂牛肝菌利用率和附加值，以氨基酸态氮含量为指标，在单因素试验基础上采用正交试验优化中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶酶解条件和复配配比，采用全自动氨基酸分析仪和高效液相色谱技术对酶解液中游离氨基酸、有机酸、呈味核苷酸等滋味成分进行分析，结合味觉活性值（Taste Activity Value，TAV）和等效鲜味浓度（Equivalent Umami Concentration，EUC）评价。结果表明，最优酶解工艺为：料液比1:20（m/m），pH 值为7.0，温度为50，时间为1.5 h，中性蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶添加量分别为 0.60%、0.90%、4.70%（以兰茂牛肝菌粉计，m/m），此条件下获得的兰茂牛肝菌酶解液的氨基酸态氮为 124.01 mg/100 mL、游离氨基酸总量为12.33 mg/g、呈味核苷酸总量为96.48 g/g、有机酸总量为4 511.59 g/g，EUC值为2.46 g MSG/100 g。因此，兰茂牛肝菌经最优工艺酶解后得到的酶解液味道鲜美，营养丰富，满足人们的需求，为兰茂牛肝菌的精深加工提供了理论基础。关键词：兰茂牛肝菌；蛋白酶；酶解液；滋味 文章编号：1673-9078(2023)09-72-80 DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2023.9.1113 Preparation Process Optimization and Taste Evaluation of Lanmaoa asiatica Enzymatic Hydrolysate ZHANG Shasha1,YANG Ning2,ZHANG Weisi1,LUO Xiaoli1,ZHOU Pei1,CAO Jingjing1,SUN Dafeng1*(1.Kunming Edible Fungi Institute of All China Federation of Supply and Marketing Cooperatives,Kunming 650221,China)(2.Yunnan Academy of Edible Fungi Industry Development,Kunming 650221,China)Abstract:In order to improve the utilization rate and added value of Lanmaoa asiatica,the enzymatic hydrolysis conditions and compound ratio of neutral protease,papain and flavor protease were optimized by using amino acid nitrogen as the indicator and by the orthogonal test on the basis of single factor experiments.Then,amino acid automatic analyzer and high performance liquid chromatography were used to analyze the tasting subtances such as free amino acids,organic acids and flavor-active nucleotides in the the hydrolysate,in comabination with the evaluation of taste activity value(TAV)and equivalent umami concentration(EUC).The results showed that the optimal enzymatic hydrolysis process was:material-liquid ratio,1:20(m/m);pH,7.0;temperature,50;time,1.5 h;addition amounts of neutral protease,flavor protease and papain(by weight ratio),0.60%,0.90%and 4.70%,respectively.Under such conditions,the amino acid nitrogen of the enzymatic hydrolysate was 124.01 mg/100 mL,the total amount of free amino acids was 12.33 mg/g,total amount of flavor-active nucleotides was 96.48 g/g,total amount of organic acids was 4 511.59 g/g,and EUC value was 2.46 g MSG/100 g.Therefore,the Lanmaoa asiatica enzymatic hydrolysate prepared through the optimal process was delicious and nutritious,which meets peoples needs.This study provides a theoretical basis for the further processing of Lanmaoa asiatica.Key words:Lanmaoa asiatica;protease;enzymatic hydrolysate;taste 引文格式：张沙沙,杨宁,张微思,等.兰茂牛肝菌酶解液的制备工艺优化及滋味评价J.现代食品科技,2023,39(9):72-80 ZHANG Shasha,YANG Ning,ZHANG Weisi,et al.Preparation process optimization and taste evaluation of Lanmaoa asiatica enzymatic hydrolysate J.Modern Food Science and Technology,2023,39(9):72-80 收稿日期：2022-09-05 基金项目：云南省科技厅创新引导与科技型企业培育计划项目（202104AR040011）；云南省重大科技专项计划项目（202002AE320003；202002AE320003-04）作者简介：张沙沙（1985-），女，硕士，副研究员，研究方向：食用菌加工与贮藏，E-mail： 通讯作者：孙达锋（1977-），男，博士，研究员，研究方向：食用菌，E-mail： 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.9 73 兰茂牛肝菌（Lanmaoa asiatica），隶属于牛肝菌 科（Boletaceae）、兰茂牛肝菌属（Lanmaoa），盛产于云南、贵州等地，俗称“红葱”1。兰茂牛肝菌营养丰富，其子实体粗蛋白含量为 56%、粗纤维 17%、氨基酸总量为33.40%、矿物质元素为 3 820 mg/kg、粗多糖 7.20%2。兰茂牛肝菌滋味鲜爽，具有独特而浓郁的香气，深受当地人喜爱，目前以鲜食为主，其组织脆嫩，易腐烂变质，保藏困难3。但是兰茂牛肝菌有微毒性，烹饪不当可能导致恶心、呕吐、产生幻觉等症状，经适当加热处理后毒性减弱或消失4-6，因此对兰茂牛肝菌进行深加工，提取其滋味成分制作调味品，为广大消费者提供方便快捷、安全的兰茂牛肝菌制品。人们为有效提高牛肝菌呈味物质释放率，增加呈味作用较为明显的小分子物质含量，在产品加工中会采用超声、酶解等多种提取方法7,8。其中，酶解法是较为常用的生物提取法，具有污染小、耗能低、反应可控等优点9。刘佳等10利用白牛肝菌边角料，采用正交试验优化白牛肝菌边角料酶解工艺，其蛋白质水解度为 20.16%。黄典等11以美味牛肝菌为试验材料，通过响应面法优化酶解工艺，制得的酶解液水解度为34.12%，DPPH清除率为 55.91%。本团队在新鲜兰茂牛肝菌呈味物质研究中，发现兰茂牛肝菌含有丰富的氨基酸、呈味核苷酸、有机酸等可溶性呈味物质，是一种较好的鲜味物质来源12。但尚不清楚兰茂牛肝菌酶解液的滋味成分。本文以兰茂牛肝菌为试验材料，以氨基酸态氮含量为指标，研究中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶酶解兰茂牛肝菌的最适条件和添加量，分析酶解产物的游离氨基酸、呈味核苷酸、有机酸等非挥发性风味物质组成及含量，为满足人们的需求，丰富兰茂牛肝菌精深加工产品类型，提高产品附加值提供重要理论基础。1 材料与方法 1.1 原料与试剂 兰茂牛肝菌鲜品，统货，购于昆明木水花野生菌交易市场。50 000 U/g 中性蛋白酶、30 000 U/g 木瓜蛋白酶，南宁庞博生物工程有限公司；50 000 U/g 风味蛋白酶，沧州夏盛酶生物技术有限公司。氢氧化钠容量分析用标准溶液，坛墨质检科技股份有限公司；甲醛溶液，西陇科学股份有限公司；HPLC 级甲醇溶液、HPLC级乙腈溶液，上海百灵威化学技术有限公司；呈味核苷酸标准品、酒石酸等 8 种有机酸标准品，上海源叶生物科技有限公司；盐酸（体积分数36%），优级纯，重庆川东化工（集团）有限公司；氮气（纯度 99.9%），昆明石头人气体产品有限公司；缓冲溶液，英国biochrom 公司；氢氧化钠（优级纯），西陇化工试剂有限公司；苯酚（优级纯）、氨基酸标准品溶液（纯度99.9%），默克化工技术（上海）有限公司。1.2 主要仪器设备 5HG-0.3CK 果蔬烘干机，云南种业集团有限责任公司；EasyPlusTitrator ET18自动电位滴定仪、FiveEasy Plus FE28 pH 计，梅特勒-托利多仪器有限公司；HH-6恒温水浴锅，上海立辰科技有限公司；HR/T20MM 离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；TYM-30L 超微粉碎机，济南天宇专用设备有限公司；RIGOL L-3000高效液相色谱仪，北京普源精仪科技有限责任公司；HT190R 高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；MIX-25 旋涡混合器，杭州佑宁仪器有限公司；Biochrom 30+全自动氨基酸分析仪，英国biochrom 公司。1.3 试验方法 1.3.1 酶解液制备 新鲜兰茂牛肝菌干燥后，采用超微粉碎机粉碎 20 min，按料液比 1:20（m/m）加水溶解，选取中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶用于兰茂牛肝菌的酶解，酶添加量（以兰茂牛肝菌粉计，m/m）、pH 值、酶解温度、酶解时间见表 16，酶解结束后 100 灭酶 5 min，离心（4 000 r/min、60、15 min）取上清液备用，酶解液制备重复 3 次。1.3.2 酶解液制备单因素试验 表 1 单因素试验因素水平表 Table 1 Factor level design table of single factor test 酶种类 酶添加量/%pH 值 酶解温度/酶解时间/h 中性蛋白酶 0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 6.0、6.5、7.0、7.5、8.045、50、55、60、65 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0风味蛋白酶 0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 5.0、5.5、6.0、6.5、7.045、50、55、60、65 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0木瓜蛋白酶 3.10、3.40、3.70、4.00、4.30 5.0、5.5、6.0、6.5、7.045、50、55、60、65 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.9 74 1.3.3 酶解液制备正交试验设计 在单因素试验基础上，中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶分别选取 pH 值、时间、酶添加量、温度四个因素设计 L9（34）正交试验，以氨基酸态氮含量为指标分别确定最佳酶解条件（见表 2表 4）。表 2 中性蛋白酶正交试验因素水平表 Table 2 Factor levels of orthogonal test of neutral protease 水平 因素 酶添加量/%pH 值温度/时间/h1 0.70 7.0 45 2.5 2 0.80 7.5 50 3.0 3 0.90 8.0 55 3.5 表 3 风味蛋白酶正交试验因素水平表 Table 3 Factor levels of orthogonal test of flavoring protease 水平 因素 酶添加量/%pH 值温度/时间/h1 0.70 6.0 48 2.5 2 0.80 6.5 50 3.0 3 0.90 7.0 52 3.5 表 4 木瓜蛋白酶正交试验因素水平表 Table 4 Factor levels of orthogonal test of papain 水平 因素 酶添加量/%pH 值温度/时间/h1 3.40 6.0 50 1.0 2 3.70 6.5 55 1.5 3 4.00 7.0 60 2.0 1.3.4 三种酶复配条件的确定 1.3.4.1 复合酶复配酶解条件优化 基于三种酶的正交试验结果，选取中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶添加量（m/m）分别为0.70%、0.90%、3.70%，以氨基酸态氮为指标，采用L9（34）正交试验将三种蛋白酶酶解条件进行复配（见表 5）。表 5 复合酶解条件正交试验因素水平表 Table 5 Factor levels of orthogonal test of complex enzyme 水平 因素 pH 值 温度/时间/h 1 6.5 45 1.5 2 7.0 50 2.5 3 7.5 55 3.5 1.3.4.2 复合酶添加比例优化 在 pH 值 7.0、温度 50、时间 1.5 h 的条件下，以中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶三种酶添加量（m/m）为因子，氨基酸态氮为指标，采用 L9（34）正交试验将三种蛋白酶进行复配（见表 6）。表 6 复合酶添加比例正交试验因素水平表 Table 6 Factor levels of orthogonal test of complex enzyme addition ratio 水平因素 中性蛋白酶/%风味蛋白酶/%木瓜蛋白酶/%1 0.60 0.80 2.70 2 0.70 0.90 3.70 3 0.80 1.00 4.70 1.3.5 氨基酸态氮含量测定 参照 GB 5009.235-2016食品中氨基酸态氮的测定，采用自动电位滴定仪测定。1.3.6 氨基酸测定 参照 GB 5009.124-2016食品中氨基酸的测定，采用全自动氨基酸分析仪测定。1.3.7 呈味核苷酸、有机酸含量测定 参照孙达锋等12的方法。1.3.8 滋味贡献评价 采用味觉活性值（TAV）法评价呈味物质对兰茂牛肝菌酶解液滋味的贡献，TAV 指样品中各呈味物质的测定值与该物质味道阈值之比13，计算见公式（1）。12CVC=（1）式中：C1滋味化合物的含量，mg/g;C2为滋味阈值浓度，mg/g。1.3.9 等效鲜味浓度分析 Yamaguchi 等14,15提出用等效鲜味浓度（EUC）来评价食品的呈鲜味作用。EUC 值越大，表示食品鲜味越强。计算公式见公式（2）。=+1218()()i ii ijjEUCababa b （2）式中：EUC等效鲜味浓度，g MSG/100 g；ai呈鲜氨基酸（谷氨酸或天冬氨酸）的质量，g/100 g；aj呈味核苷酸（5-AMP、5-IMP、5-GMP）的质量，g/100 g；bi呈鲜氨基酸相对谷氨酸的值（谷氨酸=1.00、天冬氨酸=0.077）；bj呈味核苷酸相对 5-IMP 的值（5-IMP=1.00、5-AMP=0.18、5-GMP=2.30）；1 218协同作用常数。1.4 数据分析 试验数据采用Excel处理，GraphPad prism5做差异性分析及作图。现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.9 75 2 结果与分析 2.1 单因素试验结果 2.1.1 酶添加量对三种蛋白酶酶解效果的影响 酶添加量过少会导致底物酶解不彻底，氨基酸态氮含量过低，但酶添加过多又会导致底物过度酶解，部分以氮形式存在的氨基酸也有可能被进一步分解，导致氨基酸态氮含量的降低。由图1可知，三种蛋白酶酶解液的氨基酸态氮含量均随着酶添加量的增加呈先上升后下降的趋势，所以选取中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶最适添加量（m/m）分别为0.80%、0.80%、3.70%。图 1 酶添加量对三种蛋白酶酶解液氨基酸态氮含量的影响 Fig.1 Effects of enzyme dosage on amino acid nitrogen content of enzymatic hydrolysate 2.1.2 pH 值对三种蛋白酶酶解效果的影响 不同的蛋白酶其最适pH值不同，对于不同的酶解底物，其所需pH值也会略有改变。由图2可知，三种蛋白酶酶解液的氨基酸态氮含量随着pH值的升高呈先升高后下降的趋势。因此中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶最适pH值分别为：7.5、6.5、6.5。图 2 pH 值对三种蛋白酶酶解液的氨基酸态氮含量的影响 Fig.2 Effects of pH values on amino acid nitrogen content of enzymatic hydrolysate 2.1.3 酶解温度对三种蛋白酶酶解效果的影响 酶解温度影响酶的活性及酶催化反应的进程。由图3可知，三种蛋白酶酶解液的氨基酸态氮含量均随着温度的升高呈先上升后降低的趋势。因此，中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶最适温度分别为：50、50、55。图 3 酶解温度对三种酶酶解液氨基酸态氮含量的影响 Fig.3 Effects of temperature on amino acid nitrogen content of enzymatic hydrolysate 2.1.4 酶解时间对三种蛋白酶酶解效果的影响 由图4可知，酶解液中氨基酸态氮的含量随着酶解时间的延长而增加，但到达一定值时，氨基酸态氮含量则随着时间的延长开始减少，这可能是因为酶对底物的酶解是逐渐进行的，需要经过一定时间，但酶解时间过长，会使部分以氮形式存在的氨基酸被水解，导致氨基酸态氮含量进一步降低。因此，中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶选取的最适酶解时间分别为：3.0、3.0、1.5 h。图 4 酶解时间对三种蛋白酶酶解液的氨基酸态氮含量的影响 Fig.4 Effects of time on amino acid nitrogen contentof enzymatic hydrolysate 2.2 正交试验结果与分析 2.2.1 单一蛋白酶正交试验优化 由表7可知，中性蛋白酶酶添加量、pH值、温度、时间四个因素对氨基酸态氮含量的影响顺序为时间温度pH值酶添加量，最佳工艺组合为A1B2C2D1，即酶添加量0.70%、pH值7.5、温度50、酶解时间2.5 h。在该条件下进行验证试验，酶解液氨基酸态氮含现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.9 76 量为113.72 mg/100 mL。风味蛋白酶四个因素对氨基酸态氮的影响顺序为pH值时间温度酶添加量，最佳工艺组合为A3B3C1D3，即酶添加量0.90%、pH值7.0、温度48、时间3.5 h，在该条件下进行验证试验，兰茂牛肝菌酶解液氨基酸态氮含量为115.65 mg/100 mL。木瓜蛋白酶四个因素对氨基酸态氮的影响顺序为pH值温度酶添加量时间，最佳工艺A2B3C2D2，即酶添加量3.70%、pH值7.0、温度55、时间1.5 h，在该条件下进行木瓜蛋白酶酶解验证试验，兰茂牛肝菌酶解液氨基酸态氮含量为110.48 mg/100 mL。表 7 单一蛋白酶正交试验结果 Table 7 Results of single protease orthogonal test 试验号 A(酶添加量/%)B(pH 值)C(温度/)D(时间/h)氨基酸态氮含量/(mg/100 mL)中性蛋白酶风味蛋白酶 木瓜蛋白酶1 1 1 1 1 112.21 100.87 94.30 2 1 2 2 2 111.38 111.00 101.75 3 1 3 3 3 107.42 110.79 97.79 4 2 1 2 3 110.50 103.49 99.21 5 2 2 3 1 111.27 107.31 98.91 6 2 3 1 2 109.12 111.09 102.59 7 3 1 3 2 107.46 101.94 94.64 8 3 2 1 3 109.20 115.65 101.28 9 3 3 2 1 110.87 111.04 101.74 中性 蛋白酶 K1 110.34 110.06 110.18 111.45 A1B2C2D1 K2 110.30 110.62 110.92 109.32 K3 109.18 109.14 108.72 109.04 R 1.16 1.48 2.20 2.41 风味 蛋白酶 K1 107.55 102.10 109.20 106.41 A3B3C1D3 K2 107.30 110.32 108.51 108.01 K3 109.54 110.97 106.68 109.98 R 2.25 9.22 2.52 3.57 木瓜 蛋白酶 K1 94.95 96.05 99.39 98.32 A2B3C2D2 K2 100.24 100.65 100.90 99.66 K3 99.22 100.71 97.11 99.43 R 2.29 4.66 3.79 1.34 2.2.2 三种酶复配酶解条件优化 由表8可知，pH值、温度、时间三因素对三种复合酶酶解液氨基酸态氮的影响顺序为时间温度pH值。其最佳工艺组合为A2B2C1，即pH值7.0，温度50，时间1.5 h。在该条件下进行三种酶复配酶解条件的验证试验，兰茂牛肝菌酶解液氨基酸态氮含量为122.24 mg/100 mL。2.2.3 三种酶复配配比正交试验结果 由表9可知，三种酶添加量对氨基酸态氮的影响顺序为中性蛋白酶添加量木瓜蛋白酶添加量风味蛋白酶添加量。其最佳工艺组合为A1B2C3，即中性蛋白酶添、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶加量（m/m）分别为0.60%、0.90%、4.70%。在该条件下进行三种酶复配酶解条件的验证试验，兰茂牛肝菌酶解液氨基酸态氮含量为124.01 mg/100 mL。2.3 酶解液滋味分析 2.3.1 酶解液氨基酸分析 游离氨基酸不仅是营养成分，还可以改变食品的风味，是食品的滋味成分16，呈现出鲜味、甜味、苦味等。五种酶解液中游离氨基酸组成及含量如表10所示。兰茂牛肝菌酶解液中共检出17种游离氨基酸，鲜味氨基酸含量和游离氨基酸总量均高于郝志林等17检测的鸡胸肉样品的游离氨基酸含量，所以兰茂牛肝菌酶解液适合做调味料。且五种酶解液的游离氨基酸中均是谷氨酸含量最高，单一蛋白酶中风味蛋白酶酶解液的总游离氨基酸含量最高（11.50 mg/g），蛋白酶复配后酶解液中总游离氨基酸含量显著高于单一蛋白酶（P0.01），因此蛋白酶复配后酶解有利于游离氨基酸的释放。现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.9 77 表 8 三种酶复配条件正交试验结果 Table 8 Results of three enzyme compositeconditions orthogonal test 试验号 A pH 值 B 温度/C 时间/h 氨基酸态氮 含量/(mg/100 mL)1 1 1 1 116.42 2 1 2 2 115.97 3 1 3 3 112.61 4 2 1 2 120.86 5 2 2 3 116.64 6 2 3 1 116.93 7 3 1 3 115.36 8 3 2 1 121.24 9 3 3 2 114.35 K1 115.00 117.55 118.20 K2 118.14 117.95 117.06 K3 116.98 114.63 114.87 R 3.14 3.32 3.33 表 9 三种蛋白酶复配配比正交试验结果 Table 9 Results of three protease compounding ratios orthogonal test 试验号A 中性蛋白酶/%B 风味 蛋白酶/%C 木瓜 蛋白酶/%氨基酸态氮 含量/(mg/100 mL)1 1 1 1 122.44 2 1 2 2 125.93 3 1 3 3 124.16 4 2 1 2 120.60 5 2 2 3 121.98 6 2 3 1 121.76 7 3 1 3 123.22 8 3 2 1 121.15 9 3 3 2 121.20 K1 124.18 122.09 121.78 K2 121.45 123.02 122.58 K3 121.86 122.37 123.12 R 2.73 0.93 1.38 表 10 酶解液游离氨基酸的组成及含量 Table 10 Composition and content of amino acids of enzymatic hydrolysate 呈味特性 氨基酸 游离氨基酸含量/(mg/g)中性蛋白酶 风味蛋白酶 木瓜蛋白酶 复配条件正交 复配配比正交 鲜味 天冬氨酸(Asp)0.640.01b 0.810.05a 0.370.01c 0.860.07a 0.870.06a 谷氨酸(Glu)1.690.12b 2.050.07a 1.420.10c 2.570.11a 3.200.42a 总量 2.330.06c 2.860.06b 1.790.05d 3.020.09a 3.070.24a 甜味 甘氨酸(Gly)0.330.02b 0.400.02a 0.170.01c 0.420.02a 0.430.02a 丙氨酸(Ala)0.660.03b 0.730.02a 0.410.01c 0.770.03a 0.780.05a 苏氨酸(Thr)0.440.01b 0.510.02a 0.250.01c 0.540.02a 0.550.02a 丝氨酸(Ser)0.810.03a 0.940.11b 1.050.13b 0.990.10b 1.010.05b 总量 2.240.04b 2.580.08a 1.880.08c 2.730.09a 2.770.07a 苦味 异亮氨酸(Ile)0.260.01b 0.320.01a 0.100.01c 0.340.01a 0.340.01a 亮氨酸(Leu)0.790.03b 0.950.04a 0.310.02c 1.000.15a 1.020.04a 蛋氨酸(Met)0.060.00b 0.100.01a 0.120.01a 0.110.01a 0.110.01a 苯丙氨酸(Phe)0.680.05a 0.730.04a 0.680.03a 0.770.02a 0.780.03a 组氨酸(His)0.190.01a 0.210.01a 0.130.01b 0.220.01a 0.230.01a 缬氨酸(Val)1.060.11b 1.310.32a 0.810.04c 1.380.14a 1.400.21a 精氨酸(Arg)0.570.03b 0.680.04a 0.300.01c 0.720.03a 0.730.02a 酪氨酸(Tyr)0.240.01b 0.430.02a 0.190.01b 0.450.02a 0.460.01a 总量 3.850.14c 4.730.25b 2.640.07d 5.000.20a 5.070.17a 无味 赖氨酸(Lys)0.310.00b 0.420.01a 0.150.01c 0.440.02a 0.450.00a 脯氨酸(Pro)0.470.02b 0.630.03a 0.440.02b 0.670.03a 0.680.02a 胱氨酸(Cys)0.270.01a 0.280.00a 0.290.01a 0.300.00a 0.300.01a 总量 1.050.02b 1.330.02a 0.880.02c 1.410.03a 1.430.02a 氨基酸总量 9.470.13c 11.500.21b 7.190.11d 12.160.12a 12.330.25a 注：同行不同上标小写字母表示组间差异显著（P0.05）。表11、12 同。现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.9 78 表 11 酶解液呈味核苷酸组成及含量 Table 11 Composition and content of flavor nucleotides of enzymatic hydrolysate 呈味核苷酸 含量/(g/g)中性蛋白酶 风味蛋白酶 木瓜蛋白酶 复配条件正交 复配配比正交 5-CMP 28.140.06c 24.970.05d 161.100.44a 23.870.07e 38.030.03b 5-UMP 11.690.15b 11.390.05b 25.720.17a 11.590.07b 10.880.15b 5-GMP 22.870.25c 19.440.13d 43.840.20a 25.510.13b 22.970.17c 5-IMP 0.480.00b 0.640.01b 1.960.02a 0.580.03b 0.530.02b 5-AMP 24.220.10c 18.410.09d 43.310.38a 26.610.19b 23.080.22c 总量 87.400.11c 74.850.07d 275.930.24a 90.150.10c 96.480.12b 表 12 酶解液有机酸组成及含量 Table 12 Composition and content of organic acids in of enzymatic hydrolysate 有机酸 含量/(g/g)中性蛋白酶 风味蛋白酶 木瓜蛋白酶 复配条件正交 复配配比正交 草酸 59.970.66d 167.631.64c 30.640.92e 177.180.91b 181.761.38a 酒石酸 142.480.35e 220.650.07d 498.771.29a 233.221.23c 236.601.12b 甲酸 280.591.37c 484.943.81b 235.275.15d 512.572.20a 519.990.09a 苹果酸 829.036.59d 1 073.839.65c 716.733.28e 1 135.029.36b 1 151.451.67a 乙酸 618.745.47d 1 058.0423.83c 162.634.56e 1 118.330.17b 1 134.521.78a 柠檬酸 190.080.66a 171.971.41d 137.381.88e 181.771.74c 184.402.57b 富马酸 746.9411.46d 1 014.769.01c 623.761.23e 1 072.586.01b 1 088.195.34a 琥珀酸 17.000.51b 13.680.13c 25.030.61a 14.460.99c 14.670.40c 总量 2 884.833.32d 4 205.506.19c 2 430.212.36e 4 445.142.83b 4 511.591.80a 表 13 酶解液游离氨基酸、呈味核苷酸、有机酸 TAV 分析 Table 13 TAV analysis of free amino acids,flavoring nucleotides and organic acids in of enzymatic hydrolysate 成分 特征滋味23 呈味阈值/(mg/g)24,25TAV/(mg/g)中性蛋白酶 风味蛋白酶 木瓜蛋白酶 复配条件正交 复配配比正交氨基酸 天冬氨酸(Asp)鲜/甜（+）1.00 0.64 0.81 0.37 0.86 0.87 谷氨酸(Glu)鲜（+）0.30 5.63 6.83 4.73 8.57 10.67 甘氨酸(Gly)甜（+）1.30 0.25 0.31 0.13 0.32 0.33 丙氨酸(Ala)甜（+）0.60 1.10 1.22 0.68 1.28 1.30 苏氨酸(Thr)甜（+）2.60 0.17 0.20 0.10 0.21 0.21 丝氨酸(Ser)甜（+）1.50 0.54 0.63 0.70 0.66 0.67 异亮氨酸(Ile)苦（-）0.90 0.29 0.36 0.11 0.38 0.38 亮氨酸(Leu)苦（-）1.90 0.42 0.50 0.16 0.52 0.53 蛋氨酸(Met)苦/甜/硫（-）0.30 0.20 0.33 0.40 0.37 0.37 苯丙氨酸(Phe)苦（-）0.90 0.76 0.81 0.76 0.86 0.87 组氨酸(His)苦（-）0.20 0.95 1.05 0.65 1.10 1.15 缬氨酸(Val)甜/苦（+）0.40 2.65 3.28 2.03 3.45 3.50 精氨酸(Arg)苦/甜（+）0.50 1.14 1.36 0.60 1.44 1.46 酪氨酸(Tyr)苦（-）2.60 0.09 0.17 0.07 0.17 0.18 赖氨酸(Lys)苦/甜（-）0.50 0.62 0.84 0.30 0.88 0.90 脯氨酸(Pro)甜/苦（+）3.00 0.16 0.21 0.15 0.22 0.23 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.9 79 续表 13 成分 特征滋味23 呈味阈值/(mg/g)24,25 TAV/(mg/g)中性蛋白酶 风味蛋白酶 木瓜蛋白酶 复配条件正交 复配配比正交呈味 核苷酸 5-GMP 鲜（+）0.125 0.18 0.16 0.35 0.20 0.18 5-IMP 鲜（+）0.25 0.00 0.00 0.01 0.00 0.00 5-AMP 鲜（+）0.5 0.05 0.04 0.09 0.05 0.05 有机酸 酒石酸 酸/刺激（+）0.015 9.50 14.71 33.25 15.55 15.77 苹果酸 酸/苦（+）0.50 1.66 2.15 1.43 2.27 2.30 乙酸 酸/刺激（+）0.106 5.84 9.98 1.53 10.55 10.70 柠檬酸 酸/温和（+）0.45 0.42 0.38 0.31 0.40 0.41 琥珀酸 酸/鲜味（+）0.106 0.16 0.13 0.24 0.14 0.14 注：+表示对滋