江苏地区水禽源主要细菌病流行情况调查分析.pdf

江苏地区水禽源主要细菌病流行情况调查分析2023 年 第 9 期江苏地区水禽源主要细菌病流行情况调查分析顾陈怡，董洪燕，郭长明，封琦，谢军，宋海港，吴植*（江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300）摘 要：试验旨在了解江苏地区水禽细菌病的发生与流行情况，于20212022年从江苏省10个地级市的64个水禽养殖场采集768份样品，分别设计引物对大肠杆菌F1菌毛fimA基因、沙门氏菌stn基因、鸭疫里氏杆菌OmpA基因进行PCR检测，并进行细菌的分离鉴定。结果显示，大肠杆菌fimA检出率为74.21%（570/768），沙门氏菌stn检出率为5.60%（43/768），鸭疫里氏杆菌OmpA检出率为2.73%（21/768）。研究表明，江苏地区水禽细菌性疾病中大肠杆菌的发病率最高。该研究结果可为江苏地区水禽源细菌病的防控提供参考。关键词：水禽；大肠杆菌；沙门氏菌；鸭疫里氏杆菌中图分类号：S 852.65 文献标识码：A 文章编号：1672-9692（2023）09-0061-04Investigation and analysis on the prevalence of major bacterial diseases of waterfowl in Jiangsu ProvinceGu Chenyi,Dong Hongyan,Guo Changming,Feng Qi,Xie Jun,Song Haigang,Wu Zhi*(Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College,Jiangsu Taizhou 225300)Abstract:The aim of the experiment was to understand the occurrence and prevalence of waterfowl bacterial diseases in Jiangsu Province.A total of 768 samples were collected from 64 waterfowl farms in ten prefecture-level cities in Jiangsu Province from 2021 to 2022,synthesis of primers based on Escherichia coli F1 fimbriae subunit A(fimA),the gene of outer membrane protein(ompA)in Riemerella anatipestifer and the enterotoxin gene of Salmonella(stn).Three important pathogens of waterfowl including pathogenic E.coli,Riemerella anatipestifer and Salmonella were identified by PCR.The results showed that the average detection rate of fimA,ompA,stn in waterfowl samples was 74.21%(570/768),2.73%(21/768)and 5.60%(43/768),respectively.The study indicates that the incidence of E.coli in watery and poultry bacterial diseases in Jiangsu Province is the highest.All these data is expected to provide reference for prevention and control of waterborne bacterial diseases.Key words:Waterfowl;Escherichia coli;Salmonella;Riemerella anatipestifer中国是水禽生产大国，饲养量占世界总量的70%，肉鸭、蛋鸭及肉鹅产业的产值均呈稳定增加态势1-2。但随着饲养规模化程度不断提高，饲养密度不断增大，水禽养殖中许多疫病不断发生，尤其是细菌感染已成为制约水禽产业快速发展的重要影响因素。大肠杆菌病、沙门氏菌病和鸭疫里氏杆菌病是当前危害水禽养殖业的主要细菌疾病。在商品代水禽场，大肠杆菌、沙门氏菌和鸭疫里氏杆菌感染所导致的病理变化较相似，以“三炎”即心包炎、肝周炎和气囊炎为主。在种水禽场，大肠杆菌病导致的危害更大，常导致患病禽类关节肿大、产蛋率下降和死淘率上升。有调查指出，细菌感染严重会导致水禽发病死亡3-5。江苏是水禽养殖大省，但水禽疫病的控制形势不容乐观。当前对水禽细菌性疾病的流行情况、血清型分型、耐药基因和毒力基因的携带情况等均缺乏系统调查研究，加之部分地区药物敏感性监测尚不完善，因而造成抗生素药物的不规范使用，在生产养殖中给水禽细菌病的预防和控制带来了严峻的挑战。基于此，本研究依托江苏省现代农业（水禽）产业技术体系，对江苏全省范围内水禽源常见细菌病开展流行现状的调研与分析，以期为江苏地区水禽细菌性疾病的防控提供参考。收稿日期：2023-02-20作者简介：顾陈怡，大专，研究方向为动物医学。通讯作者：吴植，硕士，副教授，研究方向为水禽疫病防控技术。基金项目：江苏现代农业产业技术体系集成创新中心资助项目（JATS 2022 345）；江苏省农业科技自主创新资金资助项目（CX(18)1004）612023 年 第 9 期Modern Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine1材料与方法1.1样品采集20212022年共采集江苏省10个地级市64个水禽养殖场的样品768份，主要包括肛拭子和组织样品两种类型。肛拭子的采集对象为临床健康水禽，用灭菌的脱脂棉棒插入肛门24 cm处，在肛门口内轻轻旋转涂擦。组织样品采集对象为剖检具有典型腹膜炎、心包炎、肝周炎和气囊炎等病理变化的水禽，无菌采集肝脏、心脏、肺脏等组织。将棉棒或组织分别放入盛有TSB培养基（需氧增菌培养）和TSB+石蜡培养基（厌氧增菌培养）的指形管中保存，依次编号记录，带回实验室。详细记录养殖场的性质、水禽的日龄、免疫程序、发病情况和药物使用等背景资料。1.2主要试剂50TAE、细菌DNA模板提取试剂盒购自康为世纪生物科技股份有限公司；琼脂糖、DL2000 DNA Marker、PCR产物回收试剂盒购自大连宝生物公司；胎牛血清购自Gibico公司；DNA凝胶回收试剂盒购自康宁公司；布氏培养基、肉汤培养基、牛肉浸粉等购自青岛海博生物技术有限公司；优质琼脂糖购自西班牙Bio-west。1.3仪器设备SW-CJ-1F净化工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）、IS-RDS3摇床（广州深华生物技术有限公司）、TGL-16B台式冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）、9902 PCR基因扩增仪（赛默飞世尔科技中国有限公司）、DDY-6C电泳仪（北京六一仪器厂）、Tanon-2500凝胶成像系统（上海天能公司）等。1.4PCR引物设计与合成参考相关文献6-8分别合成大肠杆菌fimA、沙门氏菌stn、鸭疫里氏杆菌OmpA特异性引物用于PCR检测，引物序列由南京金斯瑞生物科技有限公司提供，引物序列信息具体见表1。1.5临床样品处理将无菌采集的肛拭子和组织样品立即放置于37、220 r/min的摇床上培养1224 h。采用煮沸法提取细菌的DNA 模板，吸取 0.81.0 mL 菌体培养液于指形管中，12 000 r/min离心35 min，弃上清；菌体沉淀重新悬浮于1 mL的ddH2O中，12 000 r/min离心35 min，再次弃上清；菌体沉淀重新悬浮于200 L的ddH2O中，用100 沸水煮沸10 min后，再0 冰浴5 min，之后12 000 r/min离心810 min，吸取的上清液即为细菌DNA，转移至新的指形管中并于-20 保存。1.6临床样品PCR检测以分别提取的DNA为模板，分别按照参考文献建立的PCR的体系和反应程序，利用设计的引物对大肠杆菌fimA、沙门氏菌stn、鸭疫里氏杆菌OmpA引物进行PCR快速检测。PCR 扩增体系（共 20 L）：细菌 DNA 模板 2 L、Primer-F 0.5 L、Primer-R 0.5 L、Premix Taq 10 L、无菌水7 L。PCR 检测扩增程序：94 预变性 5 min；94 变性30 s，56/55/58 退火 30 s，72 延伸 50 s，35 个循环；72 下延伸10 min，降温至4 保存。取 5 L PCR 产 物 进 1.2%琼 脂 糖 凝 胶 电 泳，以DL2000 为DNA Marker，Goldview染色后，在琼脂糖凝胶电泳成像系统上观察其扩增情况，出现与预期目的片段大小的计为阳性，依据阳性样品数与样品检测总数分别计算大肠杆菌fimA、沙门氏菌stn、鸭疫里氏杆菌OmpA等基因的检出率。2结果与分析2.1样品来源（见图1）由图1可知，本调查共采集来自江苏省10个地级市64个水禽养殖场的样品768份，其中肛拭子样品510份，组织样品258份。表1引物序列信息Tab.1Primer sequence information细菌大肠杆菌沙门氏菌鸭疫里氏杆菌目的基因fimAstnOmpA引物序列F：5-AATGCCGGCTCTGTTGATCAAACCGT-3R：5-AGATACTGAACCTTGAAGGTCGCATC-3F：5-CTTTGGTCGTAAAATAAGGCG-3R：5-TGCCCAAAGCAGAGAGATTC-3F：5-GGAGCCAACTATTTGAGAC-3R：5-GACCTGGAACATTAGGACACT-3片段大小/bp420260592退火温度/56555862现代畜牧兽医2023 年 第 9 期2.2江苏地区水禽大肠杆菌 F1 菌毛基因fimA检出率（见图2）由图2可知，大肠杆菌F1菌毛基因fimA的平均检出率为74.21%（570/768），其中肛拭子样品的平均检出率为70.58%（360/510），组织样品的平均检出率为 81.40%（210/258）。泰州地区的肛拭子和组织样品F1菌毛fimA基因检出率均为最高，分别为86.05%、86.84%。2.3江苏地区水禽沙门氏菌stn基因检出率（见图3）由图3可知，沙门氏菌stn基因的平均检出率为5.60%（43/768），其 中 肛 拭 子 样 品 的 平 均 检 出 率 为 2.75%（14/510），组织样品的平均检出率11.24%（29/258）。连云港地区肛拭子和组织样品中沙门氏菌stn基因检出率均为最高，分别为5.13%（2/39）、33.33%（6/18）。2.4江苏地区水禽鸭疫里氏杆菌OmpA基因检出率（见图4）由图4可知，鸭疫里氏杆菌OmpA基因平均检出率为2.73%（21/768），其中肛拭子样品的平均检出率为9.52%（2/21），组织样品的平均检出率7.36%（19/285）。徐州地区的组织样品OmpA基因检出率最高为20.83%；而各地区肛拭子的检出率均较低，从01.64%不等。3讨论禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic E.coli）是导致水禽感染或继发感染死亡率最高的一类细菌病，可垂直传播6-8。水禽因感染禽致病性大肠杆菌死亡常见的临床特征有：大肠杆菌蜂窝织炎、传染性腹膜炎、败血症、心包炎、纤维蛋白性肝周炎、气囊炎、肠道盲肠炎、骨髓炎、关节炎、脑膜炎、大肠杆菌性肉芽肿、大肠杆菌脐炎等9-10。禽致病性大肠杆菌分离株血清型种类呈现多样化，如郭长明等11从国内20个地区的水禽中分离得到24株肠道外致病性大肠杆菌，主要的血清型有O1、O2、O18等。徐亚亚等12临床分离鉴定出120株禽致病性大肠杆菌，主要血清型包括O78、O18、O24和O88等。鸭疫里氏杆菌（Riemrella anatipestifer）主要感染 23周龄的雏鸭，以纤维素性心包炎、气囊炎、肝周炎、脑膜炎和关节炎为主要临床特征13-14。鸭疫里氏杆菌传染性强、致死率高，目前已成为危害鸭场最重要的传染病之一15。鸭疫里氏杆菌血清型众多且复杂，国际公认已分离鉴定出21个血清型，且仍有新的血清型不断被发现。目前不同血清型之间缺乏交叉保护，对鸭疫里氏杆菌的临床诊断和疫苗防控造成极大的困难16-17。沙门氏菌病又称副伤寒，是由致病性沙门氏菌感染引起的一类细菌性传染性疾病。近年来，随着鸭、鹅养殖数量和养殖规模不断提高，沙门氏菌病发病率也呈逐年升高图1样品来源Fig.1 Sample source图2江苏地区水禽大肠杆菌F1菌毛基因fimA检出率Fig.2 Detection rate of F1 fimA gene of Escherichia coli in waterfowl in Jiangsu Province图3江苏地区水禽沙门氏菌stn基因检出率Fig.3 Detection rate of stn gene of Salmonella in waterfowl in Jiangsu Province图4江苏地区水禽鸭疫里氏杆菌OmpA基因检出率Fig.4 Detection rate of OmpA gene of Riesiella pestipestii in waterfowl in Jiangsu Province632023 年 第 9 期Modern Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine趋势，对水禽养殖业造成的危害和带来经济损失也越来越大18。由于沙门氏菌的感染途径多样化，若养殖管理不当，会造成沙门氏菌在整个养殖领域快速传播，进而导致群体净化处理耗时延长。大肠杆菌、沙门氏菌和鸭疫里氏杆菌感染是危害水禽养殖业的主要细菌病。本试验在PCR快速检测的过程中，均选取了参考菌株作为对照，保证了检测结果的特异性和准确性。大肠杆菌F1菌毛fimA基因的平均检出率分为74.21%（570/768）；沙门氏菌stn基因平均检出率为5.60%（43/768）；鸭疫里氏杆菌OmpA基因平均检出率为2.73%（21/768），表明江苏地区水禽细菌性疾病中大肠杆菌的检出率最高。在商品代水禽养殖场，这3种细菌病引起的临床症状和病理变化较相似，需进一步通过细菌的分离鉴定及PCR检测进行鉴别诊断。在种鸭场、种鹅场，大肠杆菌的发病率更高，通常可引起卵黄性腹膜炎、关节炎和脚蹼炎症等，这与本试验中PCR检测的结果相符。本研究结果，由于水禽养殖规模化程度不断地提高，大肠杆菌、沙门氏菌及鸭疫里氏杆菌感染无明显的季节性。4结论近年来，水禽疫病呈现多种病原混合感染或继发感染的现象，使大肠杆菌、沙门氏菌及鸭疫里氏杆菌感染等细菌病的情况更加复杂。本研究初步分析了江苏地区水禽源细菌病主要流行情况，可为今后水禽细菌病的综合防控提供参考。参考文献1 侯水生,刘灵芝.2021年水禽产业现状、未来发展趋势与建议J.中国畜牧杂志,2022,58(3):227-231,238.2 季芸萱,季佩东.江苏水禽产业绿色发展路径J.中国畜牧业,2021(2):36-37.3 顾小雪,刘洋,马苏,等.我国水禽疫病的流行情况及防控对策J.中国家禽,2015,37(16):1-5.4 黄淑坚.当前水禽新发疫病流行特点及防控策略J.养禽与禽病防治,2020(2):26-27.5 刘月焕.加快推进我国水禽疫病防控技术的研究J.中国农业科学,2019,52(23):4386-4389.6 朱善元,陆辉,王健.禽源大肠杆菌的分离及其毒力因子的检测J.微生物学报,2007,47(5):795-799.8 刘凯迪,罗华东,王琳琳,等.东南沿海地区水禽源大肠杆菌耐药表型及耐药基因型的调查J.中国畜牧兽医,2021,48(12):4690-4701.9 胡紫萌,王卓昊,吴坤,等.苏北及周边地区水禽致病性大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析J.中国预防兽医学报,2020,42(5):439-444.10 张济培,韦庆兰,谭华龙,等.水禽源大肠杆菌耐药性及-内酰胺类和喹诺酮类耐药基因检测分析J.中国预防兽医学报,2016,38(9):751-754.11 郭长明,陈怀君,袁橙,等.江苏省部分地区水禽肠道外致病性大肠杆菌的分离鉴定及生物学特性研究J/OL.中国动物传染病学报:1-122023-03-23.http:/ 徐亚亚,袁华根,孙晨明,等.江苏部分地区禽致病性大肠杆菌分离株的生物学特征及耐药性研究J.畜牧与兽医,2021,53(11):74-79.13 万明,曹中赞,于堃,等.鸭疫里默氏菌病疫苗的应用现状与展望J.动物医学进展,2021,42(5):114-118.14 Shousha A,Awad A,Younis G.Molecular characterization,virulence and antimicrobial susceptibility testing of Riemerella anatipestifer isolated from ducklingsJ.Biocontrol Science,2021,26(3):181-186.15 刘传辉,韩楠.鸭疫里默氏杆菌商丘流行株的分离鉴定及耐药性分析J.中国兽医杂志,2022,58(8):64-68.16 冯雅婷,朱敏,刘丹,等.鸭疫里默氏杆菌流行菌株的分离鉴定及生物学特性J.微生物学通报,2022,49(11):4778-4785.17 张燕,董洪燕,于圣青,等.34株鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及部分耐药基因调查分析J/OL.中国动物传染病学报:1-122023-03-23.DOI:10.19958/31-2031/s.20220128.010.18 张济培,刘敏芳,骆艳婷,等.水禽源沙门菌的分离鉴定与PFGE分子分型J.中国兽医学报,2019,39(10):1994-2000.64