冷藏大黄鱼腐败希瓦氏菌的鉴定与抑菌剂筛选.pdf

第36卷第2期2023年6月Vol.36 No.2Jun.2023闽南师范大学学报（自然科学版）Journal of Minnan Normal University（Natural Science）冷藏大黄鱼腐败希瓦氏菌的鉴定与抑菌剂筛选林娇芬1,林旭吟1,卓泽晟1,关燕云1,陈洪彬2,叶丽珠1*（1.厦门海洋职业技术学院海洋生物学院,福建 厦门 361012；2.泉州师范学院海洋与食品学院,福建 泉州 363000）摘要：以福建宁德三都澳海域养殖的大黄鱼为试验材料，对在4 冷藏15 d后的大黄鱼肉中冷藏终期的优势腐败菌希瓦氏菌进行分离、纯化和鉴定；采用牛津杯法、打孔法研究聚赖氨酸、壳聚糖、紫菜多酚等抑菌剂对DHY-1腐败希瓦氏菌的抑菌效果.结果表明，用选择性培养基可以分离出冷藏腐败大黄鱼中的腐败希瓦氏菌.紫菜多酚、聚赖氨酸、壳聚糖均对DHY-1腐败希瓦氏菌都有抑菌效果.聚赖氨酸对DHY-1希瓦氏菌的最小抑菌浓度为0.5 mg/mL.关键词：大黄鱼；腐败希瓦氏菌；分离；鉴定；抑菌剂中图分类号：TS2 文献标志码：A 文章编号：2095-7122（2023）02-0110-10The identification and bacteriostat screening of the Shewanella putrefaciens in refrigerated Larimichthys croceaLIN Jiaofen1,LIN Xuyin1,ZHUO Zesheng1,GUAN Yanyun1,CHEN Hongbin2,YE Lizhu1*(1.Department of Biotechnology,Xiamen Ocean Vocation College,Xiamen,Fujian 361000,China;2.College of Oceanology and Food Science,Quanzhou Normal University,Quanzhou,Fujian 362000,China)Abstract:For the separation,purification,and identification of dominant bacteria Shewanella putrefaciens DHY-1 in the refrigerated Larimichthys crocea,it was collected from Sandu Bay in Ningde,Fujian province,and refrigerated at 4 C for 15 days.The antibacterial effect of polylysine,Chitosan,and laver polyphenols on S.putrefaciens DHY-1 was evaluated by the Oxford cup method and the hole-drilling method.The results showed that S.putrefaciens DHY-1 in the refrigerated Larimichthys crocea could be separated by a selective medium.Poly lysine,Chitosan,and laver polyphenols exhibited antibacterial activities against S.putrefaciens DHY-1.In addition,the minimum inhibitory concentration of Poly lysine on S.putrefaciens DHY-1 was 0.5 mg/mL.Key words:Larimichthys crocea;Shewanella putrefacens;separation;identification;bacteriostat大黄鱼（Larimichthys crocea），又称黄花鱼、黄瓜鱼、黄鱼等，属石首鱼科（Sciaenidae）黄鱼属1-2，为暖温性近海中下层集群洄游鱼类.大黄鱼原为我国海洋四大主捕对象之一，是我国最大养殖规模的海水鱼3.由于其肉质鲜美、营养丰富以及吸引人的金黄色外表而备受中国消费者的喜爱4.福建是大黄鱼的主要养殖区域，其中宁德市是福建省大黄鱼重要养殖区域5-6.腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）为革兰氏阴性杆菌，是水产品的典型腐败菌之一7-9.希瓦氏菌形成的生物被膜可导致鱼表面发黏，该菌利用鱼及其他水产品体内的营养物、水分等物质进行生长和繁衍，最终使水产品表现出色泽改变、气味腥臭、口感粘腻发苦等感官可察的腐败现象.研究证明腐败希瓦收稿日期：2022-07-17基金项目：福建省教育厅中青年教师教育科研项目(JAT210805)作者简介：林娇芬(1980),女,福建华安人,博士,副教授.*通信作者.E-mail：林娇芬，等：冷藏大黄鱼腐败希瓦氏菌的鉴定与抑菌剂筛选第2期氏菌也是冷藏终期大黄鱼的优势腐败菌10-12.大黄鱼肉质鲜嫩，富含人体所需的氨基酸和多不饱和脂肪酸，食用价值高.但养殖的大黄鱼脂肪含量比较高，特别是不饱和脂肪酸容易氧化酸败.加上其在养殖过程中污染的微生物和内源酶的作用，离水死亡后易腐败变质13-15.目前大黄鱼主要以冰鲜、冻品进行市场流通，但低温无法使微生物生长和酶的活性完全丧失.因此，冰鲜冷藏等货架期较短，而货架期较长的冻结冷藏因干耗、汁液流失等易造成营养损失.为了更好保持大黄鱼养殖产业的可持续发展，许多学者针对大黄鱼腐败变质16和大黄鱼的保鲜技术如气调保鲜17、超高压保鲜18、电离辐射保鲜19、生物保鲜剂保鲜20-28等进行了广泛的研究.生物保鲜剂因对人体安全无毒，天然且具有较好的保鲜效果而受到人们的青睐.针对不同抑菌剂对冷藏大黄鱼的抑菌作用进行研究，筛选出适合的抑菌剂及使用剂量，也为生物保鲜剂的保鲜在水产品保鲜上的应用寻找新途径.1 材料与方法1.1 材料大黄鱼（采自宁德三都澳海湾一养殖场）.1.2 主要仪器与试剂1.2.1 主要仪器主要仪器见表1.1.2.2 试剂营养肉汤，营养琼脂培养基，假单胞菌CFC选择性培养基，平板计数培养基，铁琼脂培养基，2216E液体培养基等购自杭州微生物试剂有限公司；聚赖氨酸，壳聚糖，紫菜多酚等购自国药集团化学试剂有限公司.1.3 试验方法1.3.1 冷藏大黄鱼希瓦氏菌的分离纯化在无菌操作环境下，取4 下冷藏15 d后的腐败大黄鱼鱼肉样品10 g，加入90 mL无菌生理盐水，用高速组织分散器制成匀浆.取1 mL匀浆液，进行10倍梯度稀释，选择3个合适的稀释梯度分别倾注PCA培养基、IA培养基、CFC培养基上，30 下培养48 h后进行观察菌落形态并进行菌落计数.将得到的典型菌进行多次平板划线分离，获得单菌落.根据其形态特征，进行初步分类计数.表1 仪器设备表Tab.1 The Instrument list序号仪器名称BXM-30R型立式压力蒸汽灭菌器HH-4A型数显恒温水浴锅隔水式培养箱SW-CJ-2D型净化工作台DHG-9246A型电热恒温鼓风干燥箱全自动菌落计数联用仪凝胶成像系统PCR扩增仪生产单位上海博讯医疗生物仪器股份有限公司国华电器有限公司上海一恒科学仪器有限公司苏州净化设备有限公司上海精宏实验设备有限公司杭州大微生物技术有限公司佳鼎分析仪器有限公司Eppendorf公司1112023年闽南师范大学学报（自然科学版）1.3.2 16S rDNA PCR纯化和鉴定1）细菌DNA的提取挑取目标单菌落接入5 mL 2216E液体培养基中，28 下200 r/min摇培约1216 h，至培养物达饱和状态.使用MOBIO PowerSoil DNA提取试剂盒进行希瓦氏菌DNA的提取，具体操作步骤参照内附操作说明书进行.2）PCR反应PCR反应体系见表2所示.16S rDNA基因PCR扩增见表3所示.3）DNA凝胶电泳配置DNA凝胶体系如下表4所示.TAE（50）电泳缓冲液体系如下表5所示.表2 PCR反应体系Tab.2 The PCR reaction system序号试剂名称DNA模板正向引物反向引物Taq DNA聚合酶2.5 mmolL-1 dNTPs10PCR缓冲液二次蒸馏水用量2 L10 pmol10 pmol4 U5 L5 L补充至50 L表3 PCR扩增步骤Tab.3 The PCR amplification steps序号温度/9595957272时间/min31.51.51.510备注步骤循环30次表4 DNA凝胶体系Tab.4 The DNA gel system序号试剂名称琼脂糖Gelred核酸染料用量/%1.00.01(v/v)备注由单蒸水配置表5 TAE电泳缓冲液体系Tab.5 The TAE electrophoretic buffer system序号试剂名称Tris-HAcEDTA用量(molL-1)250 备注由单蒸水配制,使用时稀释50倍112林娇芬，等：冷藏大黄鱼腐败希瓦氏菌的鉴定与抑菌剂筛选第2期将样品放置在凝胶电泳成像系统后，在110 V电压下运行30 min左右.紫外光照射下，可观察到清晰且分离的条带.后续送至上海美吉生物医药科技有限公司测序.1.3.3 腐败希瓦氏菌抑菌剂的筛选选取壳聚糖、聚赖氨酸、紫菜多酚、龙须菜多酚、红毛藻多酚、茶多酚等6种抑菌剂对DHY-1希瓦氏菌进行抑菌实验.采用牛津杯法、打孔法评价抑菌剂的抑菌效果.采用牛津杯法29：在超净操作台上，将配置好的NA倒入灭过菌的平板中，每平板中倒入15 mL的NA培养基，待培养基凝固后，再用移液枪吸取200 L配好的抑菌剂悬液.每个平板中放置5或7个牛津杯（中间1个阴性对照，周围几个为不同浓度的抑菌剂），各自打入200 L的配置好的抑菌剂悬液，并标记记录，后放置于30 的恒温培养箱培养.24 h后观察有无拮抗现象，有无抑菌圈.采用打孔法评价抑菌效果：用灭完菌的打孔器，在已经凝固的培养基上，各打直径为8 mm的周围打4个孔.再用无菌镊子把孔中的培养基夹出来（每夹1个培养皿镊子要在酒精灯上稍微烘烤），就形成4个圆形的小孔.然后用移液枪吸取200 L的材料药液打入孔中，做好标记，置30 恒温箱中培养24 h30.在超净工作台中，用移液枪吸取200 L的蒸馏水加入到培养基的第一个的小孔中，再用移液枪吸取200 L不同紫菜多酚，加入到培养基上的三个小孔中，置30 恒温培养箱中培养24 h，观察小孔周围病原菌的生长情况，并用全自动菌落计数联用仪记录抑菌圈的直径.2 实验结果与分析2.1 DHY-1希瓦氏菌菌落的分离鉴定根据伯杰氏系统细菌学手册31，DHY-1希瓦氏菌在IA培养基上菌落形态（图1）为短杆状，卵圆形，表面光滑凸起，呈粘液状、黑色半透明.2.2 PCR检测将目标菌株的DNA进行16S rDNA扩增，电泳后获得特异性DNA片段，其大小为1 500 bp（图2）.纯化、测通PCR扩增的产物，使用Blast软件（美国国家生物技术信息中心）比较序列相似性.比对结果显示，DHY-1菌株为腐败希瓦氏菌，同源性均为99%以上.因此，经IA选择性培养基纯化后的DHY-1为腐败希瓦氏菌.图1 DHY-1腐败希瓦氏菌菌落Fig.1 Spoilage Shewanell colonies1132023年闽南师范大学学报（自然科学版）冷藏大黄鱼中分离的DHY-1菌株16S rDNA测序结果见图3.比对结果如下：通过测序结果和同源性分析图可知：冷藏大黄鱼中用IA培养基分离得到的DHY-1菌株与Shewanella putrefaciens（KF263653.1）、Shewanella sp.（KJ922527.1）等16S rDNA序列的同源相似性为99%（表6）.图2 冷藏大黄鱼中分离菌株的16S rDNA的PCR扩增产物Fig.2 The 16S rDNA PCR amplified products of the isolated strain inrefrigerated L.crocea图3 DHY-1腐败希瓦氏菌的16S rDNA测序结果在NCBI上的同源性分析Fig.3 Homology analysis on NCBI of sequencing results of DHY-1 spoilage Shewanell表6 冷藏大黄鱼的细菌及同源性比较Tab.6 Comparison of bacteria and homology of the refrigerated Larimichthys crocea菌株DHY-1相似菌株Shewanella putrefaciensShewanella sp.Shewanella hafniensisShewanella sp.同源性/%99999999序列长度/bp2 5902 5492 5382 573序列号KF263653.1KJ922527.1NR113967.1KJ922525.1114林娇芬，等：冷藏大黄鱼腐败希瓦氏菌的鉴定与抑菌剂筛选第2期2.3 冷藏大黄鱼DHY-1腐败希瓦氏菌系统发育树的建立使用美国国家生物技术信息中心Genbank数据库中的序列与DHY-1的16S rDNA序列进行对比分析，选取11个同源性大于99%的菌株序列，建立的系统发育树（图4）.由系统进化树可知，冷藏大黄鱼腐败鱼肉中采用腐败希瓦氏菌IA选择性培养基分离得到的 DHY-1腐败菌株与Shewanella sp.MW295479.1和Shewanella sp.OK287119.1的相似度最高，和郭全友等32对大黄鱼腐败菌的研究结果相似.2.4 不同抑菌剂对DHY-1腐败希瓦氏菌的抑制作用2.4.1 聚赖氨酸对DHY-1腐败希瓦氏菌的抑制作用由图5可知，随着聚赖氨酸质量浓度的增加，其对DHY-1腐败希瓦氏菌的抑菌圈的直径也随着增加（见表7），增幅分别为1.91、1.1、0.91 mm.统计分析表明，不同聚赖氨酸浓度抑制DHY-1腐败希瓦氏菌产生的抑菌圈直径间差异及具统计学意义（P0.01）.由此可见，聚赖氨酸的质量浓度与其抑制DHY-1腐败希瓦氏菌的效果呈明显的剂量效应关系.图4 DHY-1和相似菌株的进化树Fig.4 The evolutionary tree of DHY-1 and similar strains图5 不同聚赖氨酸浓度对DHY-1腐败希瓦氏菌的抑菌效果Fig.5 Bacteriostatic effect of different concentrations of Polylysine on DHY-1sp.sp.sp.sp.sp.sp.1152023年闽南师范大学学报（自然科学版）2.4.2 壳聚糖对DHY-1腐败希瓦氏菌的抑制作用由图6可知，随着壳聚糖质量浓度的增加，其对DHY-1腐败希瓦氏菌的抑菌圈的直径也随着增加（见表8），增幅分别为1.55、1.06、1.02 mm；壳聚糖的质量浓度与其抑制DHY-1腐败希瓦氏菌的效果呈明显的剂量效应关系.统计分析表明，不同壳聚糖浓度抑制DHY-1腐败希瓦氏菌产生的抑菌圈直径间差异达到极显著水平（P0.01）.2.4.3 紫菜多酚对DHY-1腐败希瓦氏菌的抑制作用由图7可知，随着紫菜多酚质量浓度的增加，其对DHY-1腐败希瓦氏菌的抑菌圈的直径也随着增加（见表9），增幅分别为0.24、0.27、0.47 mm；紫菜多酚的质量浓度与其抑制DHY-1腐败希瓦氏菌的效果呈明显的剂量效应关系.统计分析表明，不同壳聚糖质量浓度抑制DHY-1腐败希瓦氏菌产生的抑菌圈直径间差异达到极显著水平（P0.01）.表7 不同质量浓度聚赖氨酸抑制DHY-1腐败希瓦氏菌的抑菌圈直径Tab.7 The diameter of the inhibition zone on DHY-1 by different concentrations of Polylysine项目抑菌圈直径/mm聚赖氨酸的质量浓度/(mg/mL)2.511.100.223a513.010.127b1014.320.059c2015.230.246d图6 不同壳聚糖质量浓度对DHY-1腐败希瓦氏菌的抑菌效果Fig.6 Bacteriostatic effect of different concentrations of Chitosan on spoilage of DHY-1表8 不同质量浓度壳聚糖抑制DHY-1腐败希瓦氏菌的抑菌圈直径Tab.8 The diameter of the inhibition zone on DHY-1 by different concentrations of Chitosan项目抑菌圈直径/mm壳聚糖的质量浓度/(mg/mL)19.670.160a211.220.564b412.280.182c813.300.330d116林娇芬，等：冷藏大黄鱼腐败希瓦氏菌的鉴定与抑菌剂筛选第2期图7 不同紫菜多酚质量浓度对DHY-1腐败希瓦氏菌的抑菌效果Fig.7 Bacteriostatic effect of different concentrations of laver polyphenols on spoilage of DHY-1图8 不同聚赖氨酸质量浓度对DHY-1腐败希瓦氏菌的抑菌效果Fig.8 Bacteriostatic effect of different concentrations of l Polylysine on spoilage of DHY-12.4.4 聚赖氨酸对DHY-1希瓦氏菌的最小抑菌质量浓度由图8可知，0.062 5、0.125、0.25 mg/mL聚赖氨酸对DHY-1腐败希瓦氏菌没有抑菌效果.当聚赖氨酸的质量浓度达到0.5 mg/mL时，开始出现抑菌圈，对DHY-1腐败希瓦氏菌的抑菌圈分别为(8.890.127)、(10.18 0.104)、(11.440.074)mm（见表10）.因此，聚赖氨酸对DHY-1腐败希瓦氏菌的最小抑菌质量浓度为0.5 mg/mL.表9 不同质量浓度紫菜多酚抑制DHY-1腐败希瓦氏菌的抑菌圈直径Tab.9 The diameter of the inhibition zone on DHY-1 by different concentrations of laver polyphenols项目抑菌圈直径/mm紫菜多酚的质量浓度/(mg/mL)57.180.046a107.420.127b157.690.194b208.160.252c1172023年闽南师范大学学报（自然科学版）3 总结1）冷藏大黄鱼腐败鱼肉中，经腐败希瓦氏菌IA选择性培养基分离纯化后得到的DHY-1菌株，通过16S rDNA鉴定为腐败希瓦氏菌.2）采用牛津杯法，打孔法评价抑菌剂对DHY-1的抑菌效果，发现聚赖氨酸、壳聚糖和紫菜多酚均对DHY-1 腐败希瓦氏菌有抑菌效果.3）通过测定不同聚赖氨酸浓度对DHY-1腐败希瓦氏菌的抑菌效果，得到聚赖氨酸对DHY-1腐败希瓦氏菌的最小抑菌质量浓度为0.5 mg/mL.4 讨论腐败希瓦氏菌是水产品的典型腐败菌之一7-9.研究表明，腐败希瓦氏菌会加速冷藏鱼肉蛋白质的氧化过程，改变鱼肉蛋白质的三级结构，降低水分含量，具有较强的致腐能力33.本文通过IA选择性培养基从冷藏大黄鱼腐败鱼肉中分离纯化得到一菌株DHY-1菌株，综合菌落形态及16S rDNA序列分析，最终鉴定为腐败希瓦氏菌.郭全友等11研究也证实养殖大黄鱼0 冷藏货架期终点优势腐败菌为腐败希瓦氏菌.为保持冷藏大黄鱼原有风味和品质，延缓腐败变质，开发有效的保鲜技术，本研究通过筛选得到三种可明显抑制腐败希瓦氏菌生长的抑菌剂分别为聚赖氨酸、壳聚糖和紫菜多酚，并且这三种抑制剂的抑菌效果与抑制剂的浓度呈明显的剂量效应关系.这与已报道的一些研究结果类似，如-聚赖氨酸可完全抑制草鱼鱼肉中分离出的希瓦氏菌的生长34.此外，本研究对不同浓度聚赖氨酸的抑菌效果进行考察后发现，聚赖氨酸作为有效抑菌剂的最低添加质量浓度为0.5 mg/mL.聚赖氨酸有望作为一种天然食品防腐剂开发应用于水产品的保鲜.为大黄鱼贮藏过程中新型保鲜剂的开发提供了理论基础和参考依据.参考文献：1 郭全友,张秀洁,姜朝军,等.大黄鱼成鱼养殖阶段滋味物质分析J.现代食品科技,2019,35(4):222-229.2 李旭君,岳冬冬.我国大黄鱼的出口贸易结构和国际竞争力J.海洋开发与管理,2019(4):50-54.3 杨卫,王春苗.我国大黄鱼养殖产业发展研究J.海洋开发与管理,2020(5):72-75.4 WEI Y T,SHEN H H,XU W Q,et al.Replacement of dietary 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