基于证候表征生物学的中药复方功效物质基础研究思路与方法.pdf

Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化思路与方法基于证候表征生物学的中药复方功效物质基础研究思路与方法孟硕，苗兰，林力，孙明谦，彭勍，张颖，任钧国，刘建勋（中国中医科学院西苑医院基础医学研究所，中药药理北京市重点实验室，国家中医心血管病临床医学研究中心 北京 100091）摘要：中医临床治疗疾病多以辨证论治，其用药方式多以复方为主，中药复方又多以功效来表述。因此，中药复方的功效既包括了对疾病的治疗，也涵盖了对证候的作用。目前对中药复方功效的研究多围绕治疗疾病的药理作用及发挥作用的药效成分开展研究，而对证候的作用及发挥作用的物质基础研究不足，从而严重影响了中药复方功效的深入研究和科学阐释。其原因主要是由于证候表征的生物学基础缺乏研究，影响了中药复方功效的物质基础研究。基于此，本文首次提出基于“证候表征生物学”的中药复方功效物质基础的研究思路和方法：以中医临床为依据、以病证结合为基础、以功效为导向，在尽可能全面明确中药复方功效的证候表征生物学基础后，整合网络药理学、中药化学、中药药代动力学、生物信息学等多种现代科学技术和方法，解析、确证发挥功效的化学成分及作用机理。该研究思路突出了中医临床应用复方治疗疾病的病证结合、方证相应的用药特点，期望为中医证候及中药复方功效物质基础的研究提供参考。关键词：证候 表征生物学 功效物质基础 中药复方doi:10.11842/wst.20220214002 中图分类号:R2-03 文献标识码:A中药复方是在中医药理论指导下应用的一类药物，具有多成分、多靶点、系统调节的特点。目前，中药复方的整体疗效日益受到国际的广泛关注，特别是在2020年新型冠状肺炎病毒疫情肆虐全球期间，中药复方发挥了突出作用。但是对于中药复方功效物质基础的研究一直是中医药现代研究的一个难点和瓶颈1，因此明确中药复方功效的生物学机制及作用物质基础对中药的现代化和国际化发展意义重大2-3。中药复方的功效包括了对“证”和对“病”综合治疗作用，因此，病证结合是其形成的理论基础，证候是辨证论治的主要内容，而离开对证候的评价，则功效成为无本之木、无源之水4。中药复方功效物质基础是指中药复方对中医病、证发挥疗效的化学成分，是阐明中药复方作用机制的重要研究内容，目前的研究主要针对疾病的药效成分，缺少与证候整体表征相关的中药功效物质基础研究，难以全面准确地揭示中药复方病证同治的科学本质。因此，亟需加强证候的表征生物学以及所对应的物质基础研究，再结合对疾病的药理作用及发挥作用的有效成分研究，阐释中药复方功效的科学内涵。鉴于此，研究团队提出“证候表征生物学”的概念，以期对证候进行更加科学的表征，并在此基础上开展中药复方功效的研究与评价，进而为更加全面地揭示中药复方功效地物质基础提供新的思路和方法。收稿日期：2022-02-14 修回日期：2022-07-07 国家自然科学基金委员会重点项目（82030124）：血瘀证发生与演变的血小板系统生物学机制研究，负责人：刘建勋；中国中医科学院创新工程项目（CI2021A05022）：双参宁心胶囊改善冠脉微血管疾病的靶标发现与确证，负责人：苗兰；国家中医心血管病临床医学研究中心专项科研基金（CMC2022007）：参芪补气颗粒治疗气虚证医院制剂研发，负责人：孟硕。通讯作者：刘建勋，本刊编委，博士，研究员，博士生导师，主要研究方向：中药心脑血管药理研究。835 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 1 中医证候的研究现状 中医治疗疾病采用辨证论治，所谓“有是证，用是方”，因此证候作为中医临床诊疗的基本单元和立法组方及治疗效应评价的重要依据，是中医临床诊治病证的核心要素5。中医学认为“有诸内者，必形诸外”，亦可理解为证候的外在功能表现必有其对应的内在生物学基础变化6，因而探索中医证候的现代科学内涵对中医现代化研究具有举足轻重的意义，也是近几年中医药研究的热点领域。证候是疾病发生和演变过程中某阶段所表现出的症状及体征，反映了机体在某一阶段的病因、病机及病位等整体状态的表现7。中医证候的形成是整体性和动态演变的，因而具有跨系统和随时相演变的特征，临床辨证的经验性又使中医证候的判别具有一定模糊和不确定性。因此，中医证候的现代化研究常常面临来自于认识论或方法论方面的质疑8-9，如临床诊疗过程中医生通过“四诊合参”获取患者证候表征信息，作出证候判断，具有明显的主观性和经验性，加之证候判断标准又缺乏统一性，导致对于证候的临床认定缺乏客观性和公认性10，然而以西医异常指标的上下限作为证候的判断标准，及以个别或少数指标来探究证候的实质具有明显的局限性11。在关于中医药的基础研究中，模型动物表征人临床证候的能力有限，同时证候模型的建立还处于摸索阶段，不同方法复制出的同一证候模型仍然存在异质性和不稳定性，致使与证候关联的实验室指标的变化具有不确定性，不同实验室之间数据可比性较低，能够反映证候表征的科学内涵，是当前中医证候现代化研究的一个难点。近些年来，随着系统生物学的广泛应用，发现系统生物学的系统性、整体性、空间性及时间性特点与中医的整体观、动态观及辨证观等理论体系多有契合之处12，并综合应用计算生物学、生物信息学等多学科知识及分析技术，推动了中医临床与基础研究的现代发展6,13。在此基础上，有学者提出“表型组学”的概念并进行了相关研究14。现代医学中的表型是指基因型与环境（即影响基因的外界因子）相互作用后，表现出来的性状、特征的总和，表现为多基因复杂性和动态演变的过程，与中医学中以证候概括发病过程有显著的相似之处，通过证候的表型研究，可以较好地对证候的表征提供生物学证据15（见图1）。Lin等16应用微生物组和代谢组学分析技术对脾阳虚综合征与肠道菌群之间的相关性进行研究，发现肠道菌群通过调控机体代谢变化，进而参与了脾阳虚综合征发生发展过程，并发挥了重要作用。赵超群等17应用代谢组学技术对临床乙肝肝硬化患者肝肾阴虚及肝胆湿热两种典型证候的血清样本进行差异代谢产物及其代谢通路分析，发现异证之间存在共同物质（同病），同时存在差异物质（异证），从代谢角度为中医“同证异病”提供了科学依据。刘进娜等5在中医理论指导下，通过系统生物学和数据挖掘方法针对2型糖尿病大鼠模型演变过程及中药干预前后发生变化的多系统动态指标群进行深入研究，发现中医证候演变与糖脂代谢、氧化应激、血管活性等病理过程相关，阐释了中医辨证论治体系的合理性和科学性。李静等18进行气虚证大鼠的尿液代谢组学研究，发现差异代谢产物主要涉及氨基酸类、嘧啶类、多肽类、糖类等多个层面，其差异代谢产物可能是气虚证的重要标志物。可见系统生物学的应用在促进中医特色和现代医学的科学融合，现代中医药临床与动物模型的规范化研究中确实发挥了重要作用。图1（气虚血瘀证）证候表征与表型组学之间的关系836 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化思路与方法2“证候表征生物学”研究思路与实践 通过以上研究显示，众多学者在证候的外在功能表现及其对应的内在生物学基础变化等方面来探索中医证候的现代科学内涵已经做了大量的研究工作，也取得了一些成果，但是总体上仍然存在基础实验研究与临床关联性不强，临床应用价值非常有限，同时有关研究依然缺乏系统性、整体性和可评价性。近10年来，笔者及研究团队在提出的病证结合“拟临床研究”思路与方法基础上，以心脑血管病为主，开展了对相关证候生物学基础的探索性研究。发现并认识到表征证候的生物学基础不仅仅是单个分子或单一层面，而是跨系统的多维指标群，从宏观证候体征到微观基因、蛋白以及代谢物，甚至是肠道微生物，乃至“证候表型组学”，凡是机体在证候形成发展过程中做出的生物学反应，同时可被“方证对应”的中药复方进行调节改善的生物学指标，都应作为表征证候的生物学基础。因此，首次提出“证候表征生物学”的概念：证候表征生物学是在中医理论指导下，运用现代科学技术，研究与证候相关的多维生物学指标的技术、方法、规律及其应用的一门交叉学科。证候表征生物学既适用于临床证候规范化诊断，又可用于证候及病证结合的基础研究，包括证候及病证结合动物模型的建立和客观化评价，还可用于中药复方功效的研究与评价，以期达到中医证候研究的客观性、规范性及整体性（见图2）。以气虚血瘀证的证候表征生物学及复方调节机制的研究为例，课题组首先通过临床、实验的系统研究，明确了气虚血瘀证的形成过程及生物学基础（见图3）。再应用益气活血方（补阳还五汤）对气虚血瘀证患者和模型动物临床和治疗气虚血瘀证的关键机制，主要包括：证候表观评价：益气活血方能够改善临床心衰和脑梗死气虚血瘀证患者中医症状气虚积分、血瘀积分及生活质量总积分；益气活血颗粒能够增加大鼠体重、舌色、抓力、脉搏幅度，提高腹主动脉血流速度，改善大鼠血液流变学和自主行为活动等与气虚血瘀相关的客观表现，而且在抑制心室重构、增加心输出量、改善心肌组织的病理变化等方面表现出对心力衰竭病理过程的干预作用19-20；药效学评价：益气活血方降低ADP与ATP比值（ADP/ATP），调节血糖血脂水平、改善能量代谢；调节血管内皮活性物质分泌、减少细胞黏附、抑制炎症等途径改善气虚血瘀证大鼠气虚及血瘀症状21-22；益气活血方能显著降低气虚血瘀证模型大鼠的血小板CD62p、CD63表达率，改善气虚血瘀模型大鼠血小板的聚集和血小板形态，降低气虚血瘀模型大鼠血浆PECAM-1的含量23；代谢组学研究：大鼠气虚血瘀证相关的代谢物主要是甲酸、-酮戊二酸、柠檬酸、牛磺酸、氧化三甲胺、琥珀图2中药复方功效研究与评价图3气虚血瘀证的形成过程及生物学基础837 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 酸、马尿酸等。益气活血方可以通过调节磷脂酰胆碱、脂肪酸、组氨酸与精氨酸代谢途径发挥治疗作用；转录组学研究：益气活血方能明显调节气虚血瘀大鼠模型miR-344a、miR-92b、miR-129-1水平，其靶基因主要聚焦于血小板聚集、血小板活化等；蛋白质组学研究：益气活血方影响的差异蛋白主要聚焦在能量代谢、血液凝集、血小板活化、神经营养通路、炎性反应等生物学途径。综上，在经典药理学的基础上，临床研究与基础研究相结合，综合运用系统生物学的技术与手段，从证候评价、药效指标、组学信息（基因组、蛋白组和代谢组等）、微生物谱等方面分析确证证候相关的分子标志物群，是深入进行证候表征生物学研究的重要方法。在此基础上采用生物信息学技术，研究证候与药效学、证候与化学成分、证候与组学之间的关系，对于中医证候的研究与评价以及科学内涵的阐释具有重要的作用。3 基于“证候表征生物学”的中药复方功效物质基础研究中药复方是中医治病的主要形式，是根据患者证候表征或疾病特点按一定的组方原则，选择适宜的药味及剂量配伍而成。中药复方功效代表了复方的整体效应，该效应是多种特定化学成分在特定病理条件下对机体发生作用，对证候表征及疾病的病理生理变化进行调整和整合后的生物效应表达，而这些化学成分就是中药复方功效的物质基础。针对中药功效物质基础研究，由于证候表征生物学的研究滞后，目前主要采用与疾病相关的药效学指标进行中药复方有效性评价。研究方法主要包括体内活性追踪法、中药谱效关联研究法、成分敲除/敲入法、中药质量标志物（Q-Marker）、体外细胞膜色谱法、化学生物学技术、点击化学技术与分子对接技术以及网络药理学方法等24-28。随着中药复方的临床深入研究发现，单纯进行中药复方药效成分或有效成分的分离分析鉴定、采用药理学或药效指标进行有效性评价，难以体现中医临床辨证论治、病证结合、方证相应的用药特点和疗效29-30。因此，开展中药复方功效的证候表征相关物质基础研究是中药复方研究亟待解决的关键科学问题。随着证候表征生物学的建立和发展以及中药化学成分分离、鉴定等新技术的应用，中药复方功效物质基础研究将从基于活性追踪分离的单一药效成分发现模式到基于整体观的多药效成分发现模式。因此课题组所在团队提出源于中医临床的中药复方功效研究思路与方法，即是采用拟临床的研究思路制备符合中医临床病证特征的动物模型，建立动物模型的中医证候评价技术与方法；开展基于证候表征生物学的中药复方整体、细胞、分子等跨系统多维指标群的评 价 方 法，进 而 开 展 中 药 复 方 功 效 及 物 质 基 础研究31-35。针对目前中药复方功效物质基础研究中存在的问题，在已建立的基于证候表征生物学的的基础上，提出基于病证结合的中药复方功效物质基础研究新的思路：以中医临床为依据、以病证结合为基础、以功效为导向，在明确中药复方功效的药效学及证候表征后，整合中药化学、中药药代动力学、网络药理学、生物信息学等多种现代科学技术和方法，解析、确证发挥功效的化学成分及作用机理。突出了中医临床应用复方治疗疾病的病证结合、方证相应的用药特点，科学地阐释中药复方功效的物质基础及中药复方功效的科学内涵（见图4）。中药复方功效物质基础是与病证相关的能用现代分析技术可指征的化学成分。项目应用先进的质谱检测技术，构建了生物样本多成分共提取、在线柱切换萃取富集、多靶位生物样本微透析采集、促电离率流动相优化分离、体外增强型产物离子扫描（EPI）-体内 EPI结合多反应检测（MRM）等中药复方化学成分体内快速、准确、精密的液质联用定性、定量分析技术。应用病证结合模型，检测了血府逐瘀汤、补阳还五汤等8个复方的体内化学成分及其代谢物。通过对进入血浆、脑脊液、尿液中化学成分群与类药成分的比对分析，确证了补阳还五汤、血府逐瘀汤等8个复方功效相关的入血成分84种，入脑成分23种，发现同一复方在同一种疾病不同证型及在同一证型不同疾病其功效成分均发生不同变化，证明中药复方功效物质基础必须与相关病证结合。图4基于“证候表征生物学”的中药复方功效物质基础研究838 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化思路与方法中药复方功效物质基础不是其所组成药味化学成分的简单相加，与中药复方的配伍、应用环境有密切的关系。通过对8个复方84个与功效相关成分的进一步分析研究，建立了中药复方功效-药效-成分三位一体关联的中药复方功效物质基础研究新模式（见图5）。发现中药复方功效物质基础具有5大特征：同类异证、异类同证：治疗气滞血瘀证的血府逐瘀汤与治疗气虚血瘀证的补阳还五汤均含有来源于川芎、赤芍的功效成分洋川芎内酯I、正丁基苯酞、阿魏酸、芍药苷、芍药内酯苷等；治疗气虚血瘀证的补阳还五汤和益气通络颗粒均含有川芎，但川芎体现的与复方功效相关的成分有区别，两个复方均有阿魏酸、藁本内酯、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H，益气通络颗粒则没有正丁基苯酞、丁烯基苯酞。可变性：即某些复方成分在体内发生了明显的代谢转化，伴随着生物活性变化，其功效也发生了改变。丹参酚酸类成分在肝脏内主要发生甲基化代谢，其抗氧化活性降低，活血作用也发生了改变36-39。动态性：即中药复方功效成分的药代动力学特征不同，随着时间的变化，不同成分的浓度、作用也在改变，相应的功效发生了变化。双参通冠方中的延胡索生物碱类成分的 Tmax为 0.5-0.8 h，丹参酚酸类成分0.5-2.5 h，人参皂苷类成分6-8 h，体现了3类成分发挥活血、止痛、益气功效的动态变化40-44。网络性：黄芪甲苷既具有益气的作用，也有通络的作用；丹参酚酸既具有活血、化瘀功效，也有通络的作用，复方功效与成分之间形成复杂的网络关系38-39,45。综合性：即中药复方功效成分是所有中药化学成分协同、拮抗的综合结果。双参通冠方的拆方研究发现，单味药的人参皂苷成分 Re、Rb1、Rd、Rc、Rb2/3、Rf与心肌梗死程度关联性较低，但在整方中则成为主要的功效成分，主要是双参通冠的配伍能明显降低人参皂苷类成分清除率，提高体内暴露水平46-50。上述研究阐明了双参通冠方等复方组方配伍、方证相应、病证同治的物质基础及作用机理，为中药新药的质量控制标准的制定与提升提供了新的思路与方法，也为中药复方的临床应用提供了科学依据。另外，正如图5所示，中药复方中的化学成分往往对多个靶标通路具有调节作用，这种多靶点的作用一方面可能是中药发挥作用的特点和优势，但是，另一方面也可能会引起off-target效应，引起副作用。针对中药体外、体内成分的认识还很有限，在强调中药成分多靶标特色的同时，也应该警惕这些作用是否会引起副作用，这一点往往被忽视。在今后的中药复方功效研究中，力争能够为中药复方中多种化学成分的功效权重提供更多的证据，用数据证明特定化学成分发挥功效的关键靶标，次要靶标等信息。4 讨论与小结 中医治疗疾病是根据疾病不同证候类型选择具图5中药复方（血府逐瘀汤）功效-药效-成分关联模式图839 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 有相应功效的中药复方进行辨证施治。中药复方功效代表复方的整体效应，而该效应是多种特定化学成分在特定病理条件下对机体发生作用后的生物效应表达，这些化学成分就是中药复方功效的物质基础。目前制约中药复方功效物质基础研究的主要因素是证候生物学表征的基础研究不足。基于此，笔者提出基于证候表征生物学开展中药复方功效物质基础研究的总体思路和方法，其创新性在于：“证候表征生物学”概念，明确了证候生物学表征研究内容，既包含证候的宏观表现，也关注证候的多层次微观分子的变化，以中医临床为基础，整合药理学/分子生物学/系统生物学及肠道微生物谱等多种方法与技术，探讨中医证候表征生物学研究的思路与方法，以期尽可能的还原中医证候的科学本质。基于证候表征生物学评价中药复方功效物质基础，阐释中药复方“功效”、“方证相应”的科学内涵。然而，本研究团队虽在证候表征生物学及中药复方功效的物质基础研究做了初步的探索和研究，但还亟需围绕几个亟需解决的关键问题进一步开展工作：构建与中医临床病证接近的证候及病证结合动物模型。具体思路和方法（见图6）：将中药复方所治疗的疾病进行回顾性与前瞻性相结合的临床研究；将疾病的证候表征和实验室指标模拟到动物，建立病证结合动物模型；争取建立的动物模型与中医临床密切相关，用于中药复方的功效评价，凸显中医临床对动物模型建立的指导作用31。证候表征生物学指标体系的建立：在建立证候及病证结合模型的基础上，通过动物证候表征组、证候表型组及生物指标群组建立证候表征生物学指标体系。中药复方功效物质基础研究与分析方法的建立：在证候表征生物学指标体系的建立的基础上，采用功效-药效-成分三位一体关联的中药复方功效物质基础研究模式（见图5），建立或完善相关的药理、药效成分，功效组分分析与验证方法。总之，研究团队提出开展基于证候表征生物学的中药复方功效物质基础研究思路和方法，不仅强调了在中医药整体观念和辨证论治理论的指导下，同时突出了中医临床对中药物质基础的导向作用，结合基础实验研究，解析中医治疗疾病的病证结合、辨证论治的生物学基础以及中药复方功效的科学本质，对于中医药的现代化及国际化具有重大意义。参考文献 21王恒和,王苗森,吕双宏,等.基于“证治代谢组学”假说探讨中药(单体/复方)药效物质基础的研究思路与实践.世界科学技术-中医药现代化,2021,23(1):7-12.2Chen R 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ischemia/reperfusion injury by preserving of mitochondrial function.Evid Based Complement Alternat Me,2014,2014:180965.Research Ideas and Methods of Functional Substance Basis of Traditional Chinese Medicine Based on Syndrome Representation BiologyMeng Shuo，Miao Lan，Lin Li，Sun Mingqian，Peng Qing，Zhang Ying，Ren Junguo，Liu Jianxun(Institute of Basic Medical Sciences of Xiyuan Hospital,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing Key Laboratory of Pharmacology of Traditional Chinese Medicine,National Clinical Research Center for Chinese Medicine Cardiology,Beijing 100091,China)Abstract:Syndrome differentiation is often adopted in the clinical treatment of diseases in traditional Chinese medicine(TCM),and the drug use is mainly compound prescription.The efficacy of traditional Chinese medicine compound prescription is often described.Therefore,the efficacy of Chinese medicine compound prescription covers not only the treatment of diseases,but also the effects on syndromes.At present,studies on the efficacy of compound traditional Chinese medicines mostly focus on the pharmacological effects of diseases treatment and the active pharmacodynamic components,and there is insufficient research on the effects of syndromes and the material basis for their effects,which has seriously affected the in-depth research and scientific interpretation of the efficacy of compound traditional Chinese medicines.The reason for this is mainly due to the lack of research on the biological basis of syndrome characterization,which affected the material basis research on the efficacy of Chinese herbal compound.On account of this,this paper proposed a