归芍运脾汤对肝郁脾虚型乳腺增生大鼠的性激素水平及血管生成因子的影响.pdf

甘肃医药 2023 年 42 卷第 8 期Gansu Medical Journal，2023，Vol.42，No.8乳腺增生症是乳腺良性增生性疾病中的一种，发病率居女性乳腺疾病的首位。常由乳腺正常发育和退化过程失常导致，其根本原因是乳腺主质和间质不同程度地增生及复旧不全所致的乳腺正常结构紊乱1-2。临床表现以乳房疼痛或结节及肿块为主，严重者可影响患者的正常生活和工作，对患者生活质量和身心健康造成损害3。乳腺增生多与各种原因导致内分泌失调有关4-5，雌孕激素比例失调导致乳腺过度增生及修复不良，或泌乳素升高影响乳腺生长发育及泌乳功能是其致病机理。由于血管也是乳腺组织的营养来源，增生的乳腺组织常可能伴有血管增生。因此调节血管生成的因子也参与乳腺增生发生发展过程。乳腺增生属中医“乳癖”范畴，名老中医王自立认为本病多与情绪刺激引发肝气不舒，木郁克土，痰湿内生，阻滞乳络所致。因此本病应从肝、脾而论，并将自己多年的临床经验创立的“柔肝”法、“运脾”法用治本病。王自立教授提出，“治肝必柔肝，柔肝先养肝”“健脾先运脾，运脾必调气”等观点，在乳腺增生的诊治过程中王自立教授自创经验方归芍运脾汤6以养肝健脾，疏肝运脾。方中当归、白芍养血柔肝之阴，佛手、枳壳、炒麦芽疏达肝用之阳；并以四君子大补脾气以坐镇中州，共奏养肝健脾，疏肝运脾之效，用之屡获成效。然而该方治疗乳腺增生的作用机制尚不清楚。因此本研究通过观察归芍运脾汤对乳腺增生大鼠血清中性激素E2、P、PRL 及体现乳腺血供的血清碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和血管内皮生长因子（VEGF）的影响，探讨名老中医经验方的作用机制。1材料与方法1.1实验动物选取 12 周龄 SPF 级 SD 大鼠 60 只雌性，体重（180依20）g。由甘肃中医药大学动物实验室提供（动物合格证号：SCXK 甘 2015-0009；伦理审查编号：2021-173）。1.2试药造模用药：苯甲酸雌二醇（宁波第二激素厂，批号 200806），黄体酮（浙江仙琚制药股份有限公司，批号 EB2160）。阳性对照药物：枸橼酸他莫昔芬（上海复旦复华药业有限公司，批号：200905）。归芍运脾汤：当归 10 g、白芍 10 g、佛手 10 g、炒麦芽 10 g、枳壳10 g、党参 10 g、白术 10 g、茯苓 10 g、炙甘草 6 g，实验所需中药由甘肃省中医院中药房提供。将上述诸药 2 L清水浸泡 1 h，煎煮 2 次，每次 3040 min，每次取药液200 mL，将两次煎得药液混合并浓缩至每毫升含生药1 g，冷却后放入 4 益冰箱中冷藏备用。1.3实验仪器酶标仪：美国 BIO-RAD 公司；包埋机：武汉俊杰电子有限公司；病理切片机：上海徕卡仪器归芍运脾汤对肝郁脾虚型乳腺增生大鼠的性激素水平及血管生成因子的影响屈红郑君王煜吕永鑫甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050【摘要】目的：探讨归芍运汤对肝郁脾虚型乳腺增生大鼠的性激素水平及血管生成因子的影响。方法：选取 12 周龄 SPF 级 SD 大鼠 60 只，随机分为归芍运脾颗粒低、中、高倍组、空白组、模型组、他莫昔芬组，除空白组不予干预外，其余各组均采用饥饱失常法+夹尾刺激法+苯甲酸雌二醇+黄体酮等综合方法慢性刺激 30 天，构建肝郁脾虚型乳腺增生模型，确认造模成功后，归芍运脾汤低、中、高剂量组分别给予相应剂量归芍运脾汤灌胃，空白组和模型组予蒸馏水灌胃，阳性对照组予他莫昔芬灌胃，干预 30 天后观察大鼠一般状况及行为改变，观察大鼠旷场实验阳性反应，并用 ELISA 法检测各组大鼠血清中雌二醇（E2）、磷（P）、催乳素（PRL）、血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的含量。结果：与空白组比较，模型组大鼠暴躁易激惹，扎堆蜷卧，旷场实验阳性（大鼠运动总路程、直立次数、穿越中央场次数均减少），乳头直径、高度增加（P约0.05），E2、PRL 升高（P约0.05），P 下降（P约0.05）；与模型组相比，各给药组大鼠一般生活状态及旷场实验反应改善，乳头直径、高度下降（P约0.05），E2、PRL 下降（P约0.05），P 增加（P约0.05），血清中bFGF、VEGF 水平降低（P约0.05）。结论：归芍运脾汤能够有效改善肝郁脾虚型乳腺增生大鼠一般生存状况，其具体机制可能与归芍运脾汤调节激素内分泌及血管生成因子有关。【关键词】归芍运脾汤；肝郁脾虚型；乳腺增生；性激素；血管生成因子；大鼠中图分类号：R285文献标志码：A文章编号：1004-2725（2023）08-0673-04基金项目：甘肃省自然科学基金项目（编号：21JR1RA051）第一作者：屈红，女，主治医师，从事妇产科临床工作。E-mail：基础研究673甘肃医药 2023 年 42 卷第 8 期Gansu Medical Journal，2023，Vol.42，No.8注：淤空白组与模型组相比，P约0.05；于模型组与阳性对照组比较，P约0.05；盂模型组与归芍运脾汤低剂量组比较，P约0.05；榆模型组与中剂量组比较，P约0.05；虞模型组与高剂量组比较，P约0.05表 1各组大鼠旷场行为学测定结果比较（x-依s，n=8）注：淤空白组与模型组相比，P约0.05；于模型组与阳性对照组比较，P约0.05；盂模型组与归芍运脾汤低剂量组比较，P约0.05；榆模型组与中剂量组比较，P约0.05；虞模型组与高剂量组比较，P约0.05表 2各组大鼠乳头直径及高度测定结果比较（x-依s，n=8）有限公司；正置荧光显微镜：日本尼康；成像系统：日本尼康。1.4实验方法1.4.1造模及评价标准 7-8。造模：苯甲酸雌二醇0.5 mg/（kg d），大鼠后肢外侧肌肉注射（第 1耀25 d，每日上午 9 点）；黄体酮注射液 5 mg/（kg d）（第 26耀30 d，每日上午 9 点），同时从第一天起开始给予夹尾刺激：夹子固定在大鼠尾巴中外 1/3 处，以大鼠愤怒或撕咬为度，每次连续刺激 30 min，每日 2 次，间隔 3 h以上；并予饥饱失常刺激：大鼠单日给食，双日禁食，连续造模 30 d。复制肝郁脾虚大鼠模型。模型评价：待造模结束后，观察大鼠一般生存情况（体质量、性情、毛发光泽度）以及旷场实验评价肝郁脾虚模型；肉眼观察造模大鼠腹部各乳头情况（皮色、形状、体积），取大鼠第二对乳头制成石蜡切片，通过 HE 染色进行大鼠乳腺病理组织学检查（腺小叶数目、腺泡数目、乳腺导管形态、乳腺上皮细胞排列）评价乳腺增生模型。1.4.2动物分组及给药。12 周龄 SD 大鼠（SPF 级，雌性）60 只，随机分为归芍运脾汤低、中、高倍组、空白组、模型组、他莫昔芬组，除空白组不予干预外，其余各组按时流程造模，造模结束后，观察大鼠一般生存情况及旷场实验，评价肝郁脾虚模型。将造模成功的各组分别给予相应药物治疗。空白组和模型组每日予等量蒸馏水灌胃，归芍运脾汤低、中、高剂量组每日分别给予4.3 g/kg，8.6 g/kg，17.2 g/kg 归芍运脾汤药剂灌胃（相当于70 kg 成人剂量的 3 倍、6 倍和 12 倍剂量）；阳性对照组每日给予 4 mg/kg 他莫昔芬灌胃（相当于 70 kg 成人剂量的 6 倍），等效剂量参照人与动物体型系数计算而得9。连续灌胃 30 d。1.5标本采集药物干预 30 d 后，各组大鼠禁食 1 天（不禁水）。麻醉：1%戊巴比妥钠按 1 mL/kg 腹腔注射麻醉，脱毛膏将大鼠第二对乳房脱毛，心脏取血，留取大鼠血清标本备查。按标本处理流程留取乳腺组织以备其他实验数据使用。1.6观察指标观察大鼠一般生存情况及旷场行为改变。给药 30 d 后，观察各组大鼠一般生存状况（体质量、性情、毛发等）、大鼠乳头形态及色泽等；测定大鼠乳头直径和高度。观察前先将大鼠放入暗箱适应 30min，再正式实验，采用跟踪记录系统跟踪 15 min，记录大鼠活动轨迹、直立以及穿越中央场的次数。用 ELISA 法测定各组大鼠血清中 E2、P、PRL 及 bFGF、VEGF 的含量。操作步骤严格按照 ELISA 试剂盒操作说明进行。1.7统计学方法数据分析采用 SPSS 24.0 软件进行统计。计量资料采用均数依标准差（x依s）表示，组间比较采用方差分析，方差齐时采用 LSD 法检验，方差不齐时采用 Tamhanes T2 法检验，P约0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1各组大鼠一般状态情况及旷场反应测定结果造模结束后观察空白组大鼠状态保持良好，毛发光泽，体重稳定增长，乳头色淡红，隐约可见；模型组大鼠生存状态不佳，出现不同程度的喜扎堆、反应迟缓，易受激惹，脾气暴躁，体重增加减缓等，毛发脱落明显，乳头颜色加深，明显肿胀，高于皮肤；与模型组相比，各给药组生存状态得到改善，乳头肿胀得到缓解。与空白组相比，模型组大鼠运动总路程、直立次数、穿越中央场次数均减少（P约0.05）；与模型组相比较，各给药组大鼠运动总路程、直立次数、穿越中央场次数均增加（P约0.05），尤以中高剂量组最为显著（P约0.05）。见表 1。2.2各组大鼠乳头直径及高度测定结果比较模型组大鼠乳头直径及高度较空白组增加（P约0.05）；说明模型组乳腺肿胀明显，而各给药组与模型组相比，大鼠乳头直径及高度均下降（P约0.05），尤以归芍运脾汤中高剂量组下降最为明显（P约0.05）。见表 2。组别剂量（g/kg）运动总路程（cm）直立次数（次）穿越中央场次数（次）空白组-1298.97依172.269.88依2.593.75依1.28模型组-556.63依123.19淤4.25依1.04淤0.88依0.83淤阳性对照组0.004804.04依148.53于6.38依1.77于1.25依1.04于归芍运脾汤低剂量组4.3625.26依148.09盂4.63依1.77盂1.00依1.07盂归芍运脾汤中剂量组8.6823.12依151.52榆6.50依1.77榆1.63依1.06榆归芍运脾汤高剂量组17.21042.02依144.84虞8.13依1.81虞2.00依0.76虞组别剂量（g/kg）乳头直径（mm）乳头高度（mm）空白组-0.72依0.130.61依0.18模型组-1.40依0.19淤2.01依0.15淤阳性对照组0.0041.05依0.24于1.52依0.17于归芍运脾汤低剂量组4.31.23依0.11盂1.72依0.10盂归芍运脾汤中剂量组8.61.01依0.13榆1.61依0.13榆归芍运脾汤高剂量组17.20.93依0.19虞0.98依1.11虞674甘肃医药 2023 年 42 卷第 8 期Gansu Medical Journal，2023，Vol.42，No.8注：淤空白组与模型组相比，P约0.05；于模型组与阳性对照组比较，P约0.05；盂模型组与归芍运脾汤低剂量组比较，P约0.05；榆模型组与中剂量组比较，P约0.05；虞模型组与高剂量组比较；P约0.05注：淤空白组与模型组相比，P约0.05；于模型组与阳性对照组比较，P约0.05；盂模型组与归芍运脾汤低剂量组比较，P约0.05；榆模型组与中剂量组比较，P约0.05；虞模型组与高剂量组比较，P约0.05表 3各组大鼠血清中 E2、P、PRL 含量（x-依s，n=8）2.3各组大鼠乳腺组织病理学改变如图 1 所示，空白组大鼠乳腺腺体少，乳腺清晰，导管及管腔无明显扩张，无明显分泌物；模型组大鼠乳腺腺体增多，导管明显扩张，腺泡腔面积增大，可见较多分泌物，说明造模成功；与模型组比较，各给药组大鼠乳腺病理改变不同程度缓解，腺体数目减少，导管扩张减轻、管腔分泌物减少，并与汤剂剂量存在量效关系，高剂量组减轻程度更高。2.4各组大鼠血清中 E2、P、PRL 含量与空白组相比，模型组大鼠血清中 E2、PRL 含量升高、P 含量降低（P约0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠血清中 E2、PRL含量降低、P含量升高（P约0.05）。见表 3。2.5各组大鼠血清中 VEGF、bFGF 含量与空白组比较，模型组大鼠血清中 VEGF、bFGF 含量增加（P约0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠血清中 VEGF、bFGF 含量不同程度降低（P约0.05）。与阳性对照组相比，各给药组大鼠血清中 VEGF、bFGF 差异无统计学意义（P跃0.05）。见表 4。3讨论HMG 是女性乳腺疾病中最常见的一种非炎症非肿瘤性良性疾患，虽然其发展为乳腺癌的概率并不高，但由乳腺增生所产生的症状仍会严重影响患者的生活质量10。西医治疗多予激素抑制剂及外科手术治疗，但激素抑制剂多有明显的副作用，而局部手术切除难以解决弥漫性病变的根本问题11。中医中药治疗本病有一定的优势，主要通过多靶点、多方位的作用机制而发挥作用12-14。中医认为：“乳头属肝，乳房属胃”，而女子以肝为先天。若情志不遂，肝失疏泄，气机不畅，乳络受阻，久则气结血瘀；加之肝气郁滞，木郁土克，运化失司，水湿内生，聚而成痰；痰湿、气滞、瘀血互结，阻滞乳络发为本病而见疼痛、成块。疡科心得集15曰：“乳癖，良由肝气不舒郁结而成”。高氏疡科心得集16记载：“肝气有所停，胃见木之郁，唯恐来克，伏而不扬，气不敢舒，肝气不舒，而肿硬之形成”。外科正宗17所载：“思虑伤脾，忧郁伤肝致经络痞涩，聚结成核。”均说明 HMG组别剂量（g/kg）E2（pg/mL）P（pg/mL）PRL（ng/mL）空白组-1416.44依302.85246.35依22.9712.64依2.37模型组-3202.43依406.04淤137.22依20.38淤19.31依3.45淤阳性对照组0.0041902.21依281.62于151.52依31.14于15.29依2.53于芍运脾汤低剂归量组4.32534.28依365.63盂160.75依23.09盂16.77依1.98盂归芍运脾汤中剂量组8.61855.21依343.16榆176.92依25.64榆15.12依3.26榆归芍运脾汤高剂量组17.21675.27依392.27虞189.32依24.27虞14.58依2.74虞组别剂量（g/kg）VEGF（pg/mL）bFGF（pg/mL）空白组-13.35依3.73257.36依68.05模型组-20.08依4.46淤485.29依71.13淤阳性对照组0.00415.69依3.94于347.61依67.24于归芍运脾汤低剂量组4.316.33依4.12盂396.25依70.22盂归芍运脾汤中剂量组8.615.27依4.35榆337.82依64.47榆归芍运脾汤高剂量组17.214.38依3.27虞306.65依56.34虞表 4各组大鼠血清中 VEGF、bFGF 含量（x-依s，n=8）注：K 为空白组；M 为模型组；Y 为阳性对照组；D 为归芍运脾汤低剂量组；Z 为归芍运脾汤中剂量组；G 为归芍运脾汤高剂量组图 1各组大鼠乳腺组织病理学改变（100伊）MKYGZD675甘肃医药 2023 年 42 卷第 8 期Gansu Medical Journal，2023，Vol.42，No.8与肝脾关系密切。名老中医王自立在临床诊治过程中自创经验方归芍运脾汤疗效显著。本研究结果也表明，归芍运脾汤能够改善乳腺增生大鼠乳头的高度与直径，增加大鼠运动总路程、直立次数、穿越中央场次数，病理切片观察归芍运脾汤能改善乳腺增生大鼠的病理状态，使腺体数目减少，导管扩张减轻、管腔分泌物减少，进一步说明归芍运脾汤治疗乳腺增生的治疗作用。内分泌失调、性激素水平紊乱是 HMG 的主要发病机理。尤其是 E2、P、PRL 水平的失衡关系最为密切。其中各种原因导致 E2 在体内相对或绝对增多，而 P 相对或绝对不足，雌孕激素比例失调，导致乳腺腺泡、导管增生过度且修复不良导致乳腺增生的发生18-19。PRL 可直接促进乳腺发育及增生，亦可通过抑制黄体期 P 的释放并刺激 E2 的合成，使 E2/P 失调，对乳腺组织产生不良影响20。本研究结果显示，归芍运脾汤组血清内分泌激素 E2、PRL 水平均较模型组不同程度的降低，P 水平高于对照组，且存在一定的量效关系，中高剂量组改善更加明显。提示了归芍运脾汤的治疗作用可能是通过改善体内激素水平，从而达到治疗目的。异常的血管增生是乳腺增生病变中重要的病理表现之一。研究表明21乳腺组织内的某些血管因子可能被激活，直接或间接引起部分乳腺组织内血管的增生，从而促进乳腺细胞的生长，当乳腺细胞不断生长，组织内新生血管数量增多，VEGF 增高，从而影响乳腺增生的发生。VEGF 与特异性受体结合，作用于血管内皮细胞，促进血管生成22。研究指出，bFGF23-24可促进表皮细胞及内皮细胞再生，诱导管状结构形成，并可促进血管细胞的有丝分裂及增殖分化。从以上论述可以看出bFGF 与 VEGF 具有一定协同作用。本实验结果显示，与空白组相比，模型组大鼠血清中 VEGF、bFGF 的含量明显增高，在一定程度上说明乳腺增生模型大鼠中存在着新生的血管，从而导致血管增生及微循环障碍。与模型组比较，归芍运脾汤组大鼠血清中 VEGF、bFGF 水平降低。说明归芍运脾汤可通过降低血清中 VEGF、bFGF 水平，下调血管生成因子，以减少血管生成，改善微循环，从而改善乳腺增生的病理状态。与阳性对照组相比与无统计学意义，说明归芍运脾汤与他莫昔芬的治疗作用相当，但本方为中药制剂，无明显不良反应，安全性高。综上所述，归芍运脾汤能够改善乳腺增生大鼠的生存状态，缓解乳腺增生症状。其作用机理可能是通过改善内分泌紊乱，调节性激素水平（降低 E2、PRL，升高 P 水平）及降低血清中 VEGF、bFGF 水平，抑制乳腺增生的血管生成而发挥作用。参考文献1 林岳岱.临床体检、钼靶、超声对妇女乳腺增生筛查结果的探究 J.中国医药指南，2019，17（15）：165.2 马薇，金泉秀，吴云飞，等.乳腺增生症诊治专家共识 J.中国实用外科杂志，2016，36（7）：759-762.3 于慧会，朱博，关磊，等.城市健康体检人群乳腺增生患病情况及影响因素的研究 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