国产与进口两种商品化NBB培养基检测啤酒有害菌的效果比较.pdf

110 食品安全导刊 2023年8月（下）分析检测国产与进口两种商品化 NBB 培养基检测啤酒 有害菌的效果比较李艳艳1，刘小燕1，赵琳娜1，白继超1，崔生辉2，徐中清3*（1.北京奥博星生物科技有限公司，北京 100193；2.中国食品药品检定研究院，北京 100050；3.中国兽医药品监察所，北京 100080）摘要：目的：比较国产和进口 NBB 培养基对啤酒有害菌的检测效果。方法：将干酪乳杆菌、短乳杆菌、四联球菌、戊糖片球菌、乳酸乳球菌乳脂亚种、植物乳杆菌植物亚种 6 株乳酸菌接种到 NBB-B 和 NBB-A培养基中，28 厌氧培养 24 72 h，测定 OD 值，观察培养基变色、菌落生长状态等。同时，用不同浓度麦芽啤酒配制 NBB 培养基，确定配制培养基用啤酒的最适麦芽度。结果：6 株乳酸菌在国产和进口 NBB-B培养基中灵敏度和指示特征无明显差异。戊糖片球菌在国产 NBB-A 培养基培养 48 h 变色情况略差于进口NBB-A，培养 72 h 后，与进口 NBB-A 培养基无差异。通过不同麦芽度比对试验，采用 10 P 啤酒配制的NBB 培养基菌株生长情况最好。结论：国产与进口 NBB 培养基在灵敏度、指示能力、菌落生长等方面无明显差异，国产 NBB 培养基可用于国内啤酒生产企业检测啤酒有害菌。关键词：NBB 培养基；啤酒有害菌；麦芽度；乳酸菌Comparison of the Effectiveness of Domestic and Imported Commercial NBB Culture Media in Detecting Harmful Bacteria in BeerLI Yanyan1,LIU Xiaoyan1,ZHAO Linna1,BAI Jichao1,CUI Shenghui2,XU Zhongqing3*(1.Beijing Aoboxing Biotechnology Co.,Ltd.,Beijing 100193,China;2.National Institutes for Food and Drug Control,Beijing 100050,China;3.China Institute of Veterinary Drug Control,Beijing 100080,China)Abstract:Objective:To compare the detection effect of domestic and imported NBB culture media on harmful bacteria in beer.Method:Six strains of lactic acid bacteria,including Lactobacillus casei,Lactobacillus brevis,Micrococcustetragenus,Pediococcuspentosaceus,Lactococcus lactis subsp.cremoris,and Lactobacillus plantarum subsp.plantarum,were inoculated into NBB-B and NBB-A media.They were anaerobic cultured at 28 for 24 72 h,and their OD values were measured.The discoloration of the media and the growth status of the colonies were observed.At the same time,prepare NBB culture medium with different concentrations of malt beer to determine the optimal malt content of the beer used for preparing the culture medium.Result:There was no significant difference in sensitivity and indicator characteristics between the 6 strains of lactic acid bacteria in domestic and imported NBB-B culture media.After 48 hours of cultivation on domestic NBB-A medium,the appearance of Pediococcuspentosaceus turned slightly worse than that on imported NBB-A.After 72 hours of cultivation,there was no difference compared to imported NBB-A medium.Through the comparison experiment of different malt degrees,the NBB culture medium prepared with 10P beer showed the best growth performance.Conclusion:There is no significant difference in sensitivity,indicator ability,and colony growth between domestic and imported NBB culture media.Domestic NBB culture media can be used for detecting harmful beer bacteria in domestic beer production enterprises.作者简介：李艳艳（1986），女，山西蒲县人，本科。研究方向：培养基及原材料的研究、检验、分析和开发。通信作者：徐中清（1965），男，江苏滨海人，本科，研究员。研究方向：微生物培养基研发。E-mail:zhongqingxu 。Aug.2023 CHINA FOOD SAFETY 111分析检测Keywords:NBB culture medium;harmful bacteria in beer;malt degree;lactic acid bacteria啤酒是一种以麦芽为原料，经酵母发酵酿制而成的低酒精度酿造酒。啤酒酿造是一个比较复杂的过程，在生产过程中难免会被有害菌污染。这些有害微生物在啤酒中生长繁殖，会影响啤酒的质量和风味，严重时会造成巨大的经济损失。啤酒中有害菌按照生理学分类，主要分为细菌、野生酵母和霉菌1；按照对啤酒的有害程度可分为专性啤酒有害菌、潜在啤酒有害菌、间接啤酒有害菌、指示性微生物和潜伏微生物 5 个等级，其中专性啤酒有害菌对啤酒质量稳定性的影响最大，包括乳酸杆菌、四联球菌、果胶杆菌和酿酒酵母等。啤酒厂十分重视对啤酒有害菌的检测，主要采用传统平板计数法检测，使用的培养基主要有VLB-S7、ABD、MRS 和 NBB 等，其中 NBB 培养基是一种能生长啤酒有害菌和多种野生酵母的选择性和鉴别性培养基2。成品化 NBB 培养基的主要产品有 NBB-A（NBB 固体培养基）、NBB-B（NBB 液体培养基）、NBB-C（NBB 浓缩液体培养基）3 种。NBB 培养基添加了啤酒液体，为污染微生物的生长提供了相似的生长环境，NBB 含有的半胱氨酸盐酸盐可以降低培养基的氧化还原电位，有利于乳酸菌的生长。NBB-A 和 NBB-B 中含有酸性指示剂，如果细菌产酸，培养基的颜色将由红色变成黄色；NBB-C 不含指示剂，为浓缩液体培养基，适用于已发现的所有啤酒有害菌的检测，是目前啤酒厂使用最多的培养基3。但目前 NBB 培养基依赖进口，价格较昂贵，供货周期较长，增加了啤酒生产在检测过程中的成本。目前国产商品化 NBB 培养基并不多，本研究将国产的啤酒有害细菌培养基与进口品牌 NBB-B 培养基进行比对验证，旨在为国内啤酒生产企业进行培养基选择时提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂干 酪 乳 杆 菌（Lactobacillus casei）ABX0009、短 乳 杆 菌（Lactobacillus brevis）ABX0010、四 联球 菌（Micrococcustetragenus）ABX0011、戊 糖 片球 菌（Pediococcuspentosaceus）ABX0013、乳 酸 乳球 菌 乳 脂 亚 种（Lactococcus lactis subsp.cremoris）ABX0012、植 物 乳 杆 菌 植 物 亚 种（Lactobacillus plantarum subsp.plantarum）ABX0015，由北京奥博星生物技术有限责任公司保存提供；NBB-B 培养基（批号 20210326）、琼脂粉（批号 0145）、MRS 培养基（批号 20210326），北京奥博星生物技术有限责任公司；NBB-B培养基（批号：0005399414），德国德乐；10P啤酒，燕京；12P啤酒，德国进口；14.5P啤酒，美国进口；厌氧袋，日本三菱。1.2仪器与设备DHP 培养箱，天津中环试验仪器厂；S20 pH 计、XS205DU 电子天平，瑞士梅特勒；YX-280D 手提式灭菌器，合肥华泰医疗设备有限公司；UV-1800 紫外分光光度计，岛津仪器（苏州）有限公司；SY2D 超净工作台，江苏博莱尔净化设备有限公司。1.3试验方法1.3.1菌液制备方法（1）菌种活化。将保存于-80 条件下的菌种取出，用接种环取一环接种于 MRS 培养基中，36 厌氧培养 72 h，再取单菌落划线于 MRS 培养基，36 厌氧培养 72 h，二代新鲜培养物备用。（2）菌液稀释。用无菌棉签取 MRS 平板二代新鲜培养物于无菌生理盐水中，制成菌悬液，OD 值为 1.0 1.5，再分别用生理盐水稀释至接种水平为20 200 CFU/100 L 的工作菌悬液。1.3.2培养基配制方法（1）不同麦芽度啤酒配制 NBB-B 培养基。按照进口和国产 NBB-B 培养基配方说明分别称取配制 500 mL 培养基用量干粉于 250 mL 去离子水中，加热煮沸溶解，再分别加入 250 mL 经脱气的10 P、12 P 和 14.5 P 不同麦芽度的啤酒，调整pH 值为 5.80.2，分装 10 mL/支，121 高压灭菌 15 min，备用。（2）NBB-B 培养基配制方法。按照进口和国产NBB-B 培养基配方说明分别称取配制 500 mL 培养基用量干粉于 250 mL 去离子水中，加热煮沸溶解，再加入 250 mL 经脱气的 10 P 啤酒，调整 pH 值为5.80.2，分装10 mL/支，121 高压灭菌15 min，备用。（3）NBB-A 培养基配制方法。按照进口和国产NBB-B 培养基配方说明分别称取配制 500 mL 培养基用量干粉于250 mL去离子水中，加入琼脂粉7.5 g，加热煮沸溶解，再加入 250 mL 经脱气的 10 P 啤酒，调整 pH 值为 5.80.2，121 高压灭菌 15 min，冷至50 时无菌环境下制备平板，备用。1.3.3微生物生长效果检验方法（1）不同麦芽度啤酒配制培养基微生物生长效果对比。取 100 L 工作菌悬液接种至 10 mL 10 P、12 P 和 14.5 P 不同麦芽度啤酒配制的培养基中，每112 食品安全导刊 2023年8月（下）分析检测株菌接种 2 支并取 1 支作为空白对照，28 厌氧培养 72 h，培养过程中观察菌株在培养基中的生长浊度及颜色变化。（2）国产和进口 NBB-B 培养基菌株培养效果对比实验。取 100 L 工作菌悬液接种至 10 mL NBB-B培养基中，每株菌接种 2 支并取 1 支作为空白对照，28 厌氧培养 72 h，培养过程中每 24 h 观察不同菌种在各培养基中的生长浊度及颜色变化，并检测菌液OD620值。（3）国产和进口 NBB-A 培养基菌株培养效果对比实验。取 100 L 工作菌悬液涂布于国产和进口NBB-A 培养基中，每株菌涂布 2 块并取 1 块作为空白对照，同时用 MRS 琼脂培养基进行计数。28 厌氧培养 72 h，培养过程中观察检测平板的颜色变化情况和菌落形态。2结果与分析2.1不同麦芽度啤酒对 NBB-B 培养基的影响将 6 株乳酸菌分别接种于 3 种麦芽度啤酒配制的国产和进口 NBB-B 培养基中，28 厌氧培养 72 h，观察菌液浓度和培养基颜色。由表 1 可知，6 株乳酸菌在 10 P 啤酒配制的国产和进口 NBB-B培养基中生长特征和灵敏度均无差异；短乳杆菌在12 P 啤酒配制的进口 NBB-B 培养基不变色，戊糖片球菌在 12 P 啤酒配制的国产和进口 NBB-B 培养基中均微变黄色，其他 4 株乳酸菌在 12 P 啤酒配制的国产和进口 NBB-B 培养基中生长浓度均无明显差异；但在 14.5 P 啤酒配制的国产和进口 NBB-B 培养基中除戊糖片球菌在国产培养基中微变黄色，其他菌株在培养基中生长均不变色，四联球菌在两种培养基中均不生长，短乳杆菌在进口 NBB-B 培养基中生长浊度低，乳酸乳球菌乳脂亚种在两种培养基中生长浊度低。麦芽度浓度越高培养基灵敏度越差，麦芽度浓度增高对四联球菌和乳酸乳球菌乳脂亚种菌株的生长存在抑制作用，戊糖片球菌培养基变色差。结果显示采用麦芽度为 10 P 啤酒配制培养基效果较好。2.2国产和进口 NBB-B 培养基菌株生长对比实验结果6株乳酸菌接种至国产和进口NBB-B培养基中，28 厌氧培养 24 h，均可见菌株微弱生长，但培养基颜色均未发生变色；培养36 h，培养基均明显浑浊，肉汤均由红色变微黄色；培养至 48 h，菌株均生长良好，培养基均变黄色。根据 6 株乳酸菌在国产和进口 NBB-B 培养基中不同生长时间菌液 OD620值绘制曲线，图 1 结果显示，在培养 24 h、36 h、48 h 后，短乳杆菌和乳酸乳球菌乳脂亚种在国产培养基中 OD620值均高于进口培养基，其他 4 株菌无明显差异。2.3国产和进口 NBB-A 培养基菌株生长对比实验结果6 株乳酸菌接种至国产和进口 NBB-A 培养基中，28 厌氧培养 48 h，戊糖片球菌在国产和进口培养基中菌落生长数量无差异，在国产 NBB-A 平板中菌落周围培养基变黄，平板上有少量红色区域；在进口培养基中菌落周围培养基变黄，平板上红色区域多。其他 5 株乳酸菌在国产和进口培养基中菌落圆润、生长丰满，均为乳白色菌落，培养基全部表 1不同麦芽度啤酒配制国产和进口培养基乳酸菌生长结果菌株名称10 P NBB-B12 P NBB-B14.5 P NBB-BMRS 培养基/CFU国产进口国产进口国产进口干酪乳杆菌+变黄色+变黄色+变黄色+变黄色+不变色+不变色88短乳杆菌+变黄色+变黄色+变黄色+不变色+不变色+不变色56四联球菌+变黄色+变黄色+变黄色+变黄色/不变色/不变色76戊糖片球菌+变黄色+变黄色+微变黄色+微变黄色+微变黄色+不变色54乳酸乳球菌乳脂亚种+变黄色+变黄色+变黄色+变黄色+不变色+不变色98植物乳杆菌植物亚种+变黄色+变黄色+变黄色+变黄色+不变色+不变色65注：“+”表示灵敏度生长浊度；“/”表示未生长。Aug.2023 CHINA FOOD SAFETY 113分析检测变黄，详见图 2。培养 72 h，6 株乳酸菌在国产和进口 NBB-A 培养基中菌落生长数量和形态均无明显差异，培养基全部变黄，菌落计数结果详见表 2。3讨论啤酒生产过程中微生物污染会严重影响产品质量，造成产品变质4。啤酒中有害菌会影响啤酒质量稳定性，其中乳酸杆菌、四联球菌对啤酒的危害最大，能使啤酒产生浑浊和异味，它们能耐受啤酒中特殊的条件，在低 pH 值、厌氧、含有一定量的酒精、缺乏一定量营养物质和低温的环境下仍能在啤酒中很好地生长5。研究发现，啤酒中必然有害菌中短乳杆菌出现概率约为 40%，干酪乳杆菌出现概率约为 3%，片球菌出现概率约为 17%6；有研究从工艺啤酒中分离出 23 株啤酒腐败菌，经鉴定为 15 株短乳杆菌、2400.5OD620值1.01.52.02.536培养时间/h48进口国产 2400.5OD620值1.01.536培养时间/h48国产进口（a）短乳杆菌（b）干酪乳杆菌 2400.5OD620值1.01.536培养时间/h48国产进口 2401OD620值2336培养时间/h48国产进口（c）乳酸乳球菌乳脂亚种（d）四联球菌24012OD620值36培养时间/h48国产进口240123OD620值36培养时间/h48国产进口（e）戊糖片球菌（f）植物乳糖杆菌植物亚种图 16 株乳酸菌在国产和进口 NBB-B 培养基中培养不同时间的 OD620结果3 株植物乳杆菌、1 株副布氏乳杆菌、2 株副干酪乳杆菌和 2 株达氏片球菌7-8。本研究使用干酪乳杆菌、短乳杆菌、四联球菌、戊糖片球菌、乳酸乳球菌乳脂亚种和植物乳杆菌植物亚种 6 种啤酒中必然有害菌对国产和进口 NBB 进行验证，结果显示 6 种乳酸菌在国产和进口 NBB 培养基中均能生长良好。NBB 配制说明中使用水和啤酒按照 1 1 比例配制 NBB-B 培养基。有研究发现啤酒浓度越高，对啤酒有害菌的抑制能力越强9。本次验证实验采用10 P、12 P、14.5 P 3 种麦芽度啤酒配制 NBB-B培养基，结果显示 6 株乳酸菌在 10 P 麦芽啤酒配制的国产和进口 NBB-B 培养基中生长灵敏度和特征无明显差异；戊糖片球菌在 12 P 麦芽啤酒配制的国产和进口培养基中变色均差，生长浓度无差异；短乳杆菌在 12 P 麦芽啤酒配制的国产培养基中变黄色，在114 食品安全导刊 2023年8月（下）分析检测进口培养基中不变色，生长浓度无差异；在 14.5 P麦芽啤酒配制的国产和进口 NBB-B 培养基中除戊糖片球菌在国产培养基中微变黄色，其他菌株在培养基中生长均不变色，四联球菌在两种培养基中均不生长，短乳杆菌在进口NBB-B培养基中生长浊度低，乳酸乳球菌乳脂亚种在两种培养基中生长浊度低。由此可见，麦芽度浓度越高培养基灵敏度越差，浓度增高对四联球菌和乳酸乳球菌乳脂亚种菌株的生长存在抑制作用，戊糖片球菌培养基变色差。本研究采用麦芽度为10P的啤酒配制的培养基效果较好。啤酒工厂用于啤酒有害菌检测的培养基主要有R-R 培养基、NBB 系列培养基以及 MRS 培养基10。R-R 培养基主要选择性检测乳酸菌和片球菌，对巨球菌不能检出11；MRS 培养基主要选择性检测乳酸菌和片球菌；NBB 系列培养基检测范围较广，基本可以检测所有啤酒有害菌12。国内学者比较了乳酸短杆菌、四联球菌、醋化醋酸杆菌在 NBB、MRS、Raka-Ray、VLB-S7、番茄汁培养基、自配培养基 A和自配培养基 UBA 上的生长情况，结果显示 NBB对乳酸杆菌的检测效果最好13-14。本研究选用国产NBB 与进口 NBB 进行了比较，结果显示 6 株乳酸菌在国产 NBB 培养基中生长 72 h 灵敏度和菌落特征与（a）干酪乳杆菌（b）短乳杆菌（c）四联球菌（d）乳酸乳球菌乳脂亚种（e）戊糖片球菌（f）植物乳杆菌植物亚种图 26 株乳酸菌分别在国产和进口 NBB-A 培养基中 28厌氧培养 48h 生长情况表 26 株乳酸菌在国产和进口 NBB-A 培养基中 28厌氧培养 72h 菌落计数结果菌株进口 NBB-A 培养基/CFU国产 NBB-A 培养基/CFUMRS 培养基/CFU1212干酪乳杆菌119125137110127短乳杆菌6263587553四联球菌7981698565戊糖片球菌6870677268乳酸乳球菌乳脂亚种132142132155135植物乳杆菌植物亚种7968636956进口 NBB 培养基无明显差异。4结论通过不同麦芽度比对试验，采用 10 P 啤酒配制的 NBB 培养基菌株生长情况最好。6 株乳酸菌在国产和进口 NBB-B 培养基中生长灵敏度和指示特征无明显差异，在国产 NBB-A 培养基与进口 NBB-A 培养基培养 72 h 菌落生长特征无明显差异。目前 NBB培养基依赖进口，价格较昂贵，供货周期较长，国产NBB培养基可供于国内啤酒生产企业，降低检测成本。参考文献1倪守仟,江欢.啤酒生产常见微生物的鉴别研究J.中外酒业啤酒科技,2020(5):40-44.2 叶青,孙培龙.啤酒有害菌检测培养基的比较 J.食品与发酵工业,2005,31(1):27-30.3 郭秀青.厌氧菌检测中 NBB 使用情况汇总 J.啤酒科技,2008(3):6.4杨祥根.啤酒有害菌的预防与控制 J.啤酒科技,2012(6):55.5 张俊川,戚芬,刘继声.啤酒有害菌检测及 NBB（下转第 118 页）118 食品安全导刊 2023年8月（下）分析检测参考文献1 国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品添加剂使用标准:GB 27602014S.北京:中国标准出版社,2014.2 邵铁峰,李雪珉,陈勤伟,等.高效液相色谱法测定酒中的甜蜜素 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3环己基氨基磺酸钠的回收实验结果样品名称加标量/（mgkg-1）测定值/（mgkg-1）相对标准偏差/%回收率/%123456平均爆米花0.2000.1700.1650.1760.1610.1720.1670.1683.284.00.5000.4950.4810.4830.4880.4900.4840.4871.197.4虾条0.2000.1780.1820.1770.1860.1880.1790.1822.591.00.5000.4910.4800.4850.4920.4790.4880.4861.197.2薯片0.2000.1790.1730.1830.1920.1880.1860.1843.792.00.5000.4810.4780.4880.4930.4860.4940.4871.397.4仙贝0.2000.1680.1720.1780.1860.1910.1810.1794.889.50.5000.4750.4820.4930.4730.4780.4860.4811.696.2干脆面0.2000.1880.1960.1820.1870.1920.1940.1902.795.00.5000.5010.4920.4980.5050.4930.4900.4961.299.2