基于斑马鱼模型评价多肽红参饮调节气血作用.pdf

2023 年第 8 期基于斑马鱼模型评价多肽红参饮调节气血作用李开莹1，郭朝万1，陈杰2，*裴运林1，2（1.广东丸美生物技术股份有限公司，广东 广州 510000；2.广州美域医学检验有限公司，广东 广州 510000）摘要：以斑马鱼为模型研究多肽红参饮 PPHSD 调节气血作用，研究发现 292，583 滋g/mL PPHSD 能够明显提升苯肼诱导的贫血的 4 dpf 的野生型 AB 品系斑马鱼的心脏红细胞染色强度增强，与模型对照组相比增加率为 29.7%和31.34%（p0.01）；292，583，1 167 滋g/mL PPHSD 能提升正常的 4 dpf 黑色素等位基因突变型半透明 Albino 品系斑马鱼的血管血流速度，平均血管血流速度分别提升了 30.37%，34.10%，35.88%，具有显著性差异（p0.05）；72.9，146，292 滋g/mL 的 PPHSD 明显降低正常 3 dpf 野生型 AB 品系斑马鱼体内荧光微球残留数目，分别降低31.96%，32.22%，32.73%（p0.01），其增强免疫力作用明显且优于阳性对照组破壁灵芝孢子粉的作用。结果表明，PPHSD 具有改善营养性贫血、改善微循环并增强免疫力作用，表现出可以改善斑马鱼气血相关指标的作用。关键词：多肽红参饮；斑马鱼；贫血；微循环；免疫调节中图分类号：R28文献标志码：Adoi：10.16693/ki.1671-9646（X）.2023.08.035（1.Guangdong Marubi Biotechnology Co.，Ltd.，Guangzhou，Guangdong 510000，China；2.Guangzhou Marumed Resarch Co.，Ltd.，Guangzhou，Guangdong 510000，China）The Regulate Qixue effects of Polypeptide Hongshen Drink（PPHSD）was evaluated by zebrafish model.The resultsshowed that the 292 and 583 滋g/mL PPHSD obviously improved the anemia of 4 days post fertilization（dpf），wild-type ABzebrafish induced by phenylhydrazine，the rate of increase was 29.7%and 31.34%compared with the model control group（p0.01）；292，583 and 1 167 滋g/mL PPHSD increased the blood flow velocity of the normal 4 dpf melanin mutanttranslucent albino strain zebrafish by 30.37%，34.10%and 35.88%respectively，there was significant difference（p0.05）；72.9，146 and 292 滋g/mL PPHSD significantly reduced the number of fluorescent microsphere residues in 3 dpf wild type ABstrain zebrafish by 31.96%，32.22%and 32.73%respectively（p0.01），its effect on enhancing immunity was obviouslybetter than that of the positive control group.The study showed PPHSD could improve nutritional anemia，microcirculation andimmunity of zebrafish，which showed that PPHSD could improve related indexes of blood and gas.Polypeptide Hongshen Drink；zebrafish；anemic；microcirculation；immunoregulation收稿日期：2022-08-17作者简介：李开莹（1988），女，硕士，研究方向为功能性食品开发。*通讯作者：裴运林（1972），男，本科，研究方向为应用化工。宋朝陈自明首次明确提出了“女子以血为本”的中医学理论，“今妇人之生，有余于气，不足于血，以其数脱血也”被记载于 灵枢五音五味中，提示女子以血为本的生理特点易产生“气有余而血不足”的情况1。女子的脉细、唇舌色淡、面色无华或萎黄，并伴有心悸、健忘、多梦失眠等症状是血虚的表现2。女性气血虚会导致出现一些疾病症状，如痛经3、月经过少病4、围绝经期综合征5、卵巢功能衰退6。针对以上女性问题，市面上功能性食品常用的药食同源原料有红参、阿胶和燕窝等。有研究表明，阿胶对盐酸苯肼型贫血小鼠有补血效果7，能够促进血细胞形式功能，提升人体造血能力8；燕窝具有提高细胞免疫功能和促使人体组织与细胞再生的作用9。利用现代酶解技术制备得到的相应的肽类成分，如阿胶肽10、燕窝肽和血肽等成分，因为其吸收率高及有效作用得到市场高度认可，但现有的研究报道主要集中在免疫调节和抗氧化作用11-12，在气血方面的作用无较多研究。另外，动物续血液制品将食源性活性肽作为主要成分与红参进行科学组合得到多肽红参饮（Polypeptide Hongshen Drink，PPHSD），研究此组合物在调节气血方面的作用，以验证经酶解处理后的肽类是否依旧保留原物质所具文章编号：1671-9646（2023）08b-0029-04第 8 期（总第 582 期）农产品加工No.82023 年 8 月Farm Products ProcessingAug.农产品加工2023 年第 8 期有的功效。斑马鱼是一种非常重要的模式动物，这种动物作为一种哺乳动物在遗传学范畴上与人类相似，基因同源度高达 87%13，相对于大鼠和小鼠动物试验，斑马鱼试验模型具有费用低、试验周期短的特点14。近年来，斑马鱼模型已被广泛用于功能性食品领域的功效评价，用于评价物质的调节免疫力作用15-16、改善微循环17、降血脂18、抗炎19、降血糖作用20和神经保护作用21等。该课题组采用斑马鱼模型，建立相应的试验模型，研究评价由食源性活性肽类为主要成分制备成的组合物饮品的调节气血，提高免疫力的作用。1材料与方法1.1.1试验动物选取 4 dpf 的野生型 AB 品系斑马鱼用于评价PPHSD 改善贫血作用；选取 4 dpf 黑色素等位基因突变型半透明 Albino 品系斑马鱼用于评价 PPHSD 改善微循环障碍作用；选取 3 dpf 野生型 AB 品系斑马鱼用于评价 PPHSD 改善免疫力作用。斑马鱼均饲养于28 的养鱼用水中（水质：每 1 L 反渗透水中加入200 mg 速溶海盐，硬度为 50100 mg/L CaCO3，pH值为 6.58.5，电导率为 450550 滋s/cm），试验动物使用许可证号为：SYXK（浙）2022-0004，饲养管理符合国际 AAALAC 认证（认证编号：001458）的要求。1.1.2试剂与仪器二甲基亚砜（DMSO，批号 BCCD8942，Sigma），Switzerland 公 司 提 供；邻 联 茴 香 胺（批 号 MK-BX3619V），Sigma 公 司 提 供；苯 肼（批 号YH0170509），上海依赫生物科技有限公司提供；甲基纤维素（批号 C2004046），上海阿拉丁生化科技股 份 有 限 公 司 提 供；戊 四 唑（PTZ，批 号YH0171126），上海依赫生物科技有限公司提供；Latex besads，carboxylate-modified polystyrene，fluire-scent red 荧光微球（批号 MKCB2036V），Sigma 公司提供。解剖显微镜（SZX7），OLYMPUS 公司产品；CCD 相机（VertA1）；6 孔板，Nest 公司产品；精密电子天平（CP214），OHAUS 公司产品；电动聚焦连续变倍荧光显微镜（AZ100），Nikon 公司产品；心跳血流分析系统（Zebralab3.）3 PB2084C 公司产品；显微注射仪（IM-300），Narishige 公司产品；拉针仪（PC-10），Narishige 公司产品；行为分析仪（V3.11），ViewPoint Life Sciences 公司产品。1.1.3试验药物多肽红参饮 PPHSD 由阿胶肽、燕窝肽、血肽和红参等组成。多肽类成分为相应原料经过酶解工艺制备得到，然后将多种原料按科学配比经过溶解、均质、过滤等步骤制备得到。配方采用食品级原料组成，以保证长期服用无毒性。瑞克R生血宁片，以下简称生血宁片，黑绿色片剂，批号为 20211003，武汉联合药业有限责任公司提供，阴凉干燥贮存，用超纯水配制成 50.0 mg/mL母液，现配现用；毛蕊异黄酮，白色粉末，批号211218044，华中海威（北京）基因科技有限公司提供，冷藏干燥贮存。用 DMSO 配制成 3.41 mg/mL 母液，现配现用；破壁灵芝孢子粉，褐色粉末，批号为 2112001，金日制药（中国）有限公司提供，阴凉、干燥贮存，用超纯水配制成 50.0 mg/mL 母液，现配现用。1.2.1PPHSD 最大可用浓度考查（MTC）在进行功效评价之前先考查 3 种斑马鱼模型对不同质量浓度 PPHSD 的耐受情况，使用质量浓度分别为 72.9，146，292，583，1 167 滋g/mL 的 PPHSD 对3 种模式斑马鱼进行毒性作用考查。随机选取对应模式斑马鱼于 6 孔板中，30 尾/孔/试验组，分别水溶给予不同质量浓度的 PPHSD 水溶液，同时设置正常对照组（标准稀释水）和模型对照组，每孔容量为3 mL。在试验过程中，观察记录斑马鱼的死亡情况并移除死亡的斑马鱼，确定不同质量浓度 PPHSD 对不同模式斑马鱼的毒性作用。1.2.2研究 PPHSD 的改善贫血作用随机选取 4 dpf 野生型 AB 品系斑马鱼于 6 孔板中，30 尾/孔。受试组分别水溶给予多肽红参饮PPHSD，阳性对照组给予生血宁片 250 滋g/mL，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为 3 mL。28 条件下处理 6 h 后，除正常对照组外，其余各试验组均水溶给予苯肼建立斑马鱼营养性贫血模型。28 条件下继续处理 18 h 后，用邻联茴香胺染色，染色结束后每个试验组随机选取 10 尾斑马鱼置于解剖显微镜下拍照，用 NIS-Elements D 3.20 高级图像处理软件采集数据，分析统计斑马鱼心脏红细胞染色强度，以心脏红细胞染色强度的统计学意义评价多肽红参饮 PPHSD 对营养性贫血改善作用。1.2.3研究 PPHSD 的改善微循环作用随机选取 4 dpf 黑色素等位基因突变型半透明Albino 品系斑马鱼于 6 孔板中，每孔均处理 30 尾斑马鱼。分别水溶给予 PPHSD，阳性毛蕊异黄酮4.26 滋g/mL 质量浓度，同时设置正常对照组，每孔容量为 3 mL。28 处理 1d 后，每个试验组随机选取10 尾斑马鱼置于斑马鱼心跳血液分析系统中录制视频并采集数据，分析节间血管血流速度，以该指标的统计学分析结果评价 PPHSD 改善微循环功效。302023 年第 8 期表 3多肽红参饮对斑马鱼吞噬荧光微球作用（n=10）1.2.4研究 PPHSD 的增强免疫力作用随机选取 3 dpf 野生型 AB 品系斑马鱼于 6 孔板中，30 尾/孔。受试组分别水溶给予 PPHSD，阳性对照组给予破壁灵芝孢子粉 2 000 滋g/mL，同时设置正常对照组，每孔容量为 3 mL。于 28 条件下处理 4 d 后，每个试验组随机选取 10 尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照，用 Image J 软件分析并采集数据，分析斑马鱼荧光微球残留数目，以该指标的统计学分析结果评价 PPHSD 增强免疫力功效。上述 1.2.11.2.4 的研究结果均用 meanSE 表示，方差分析和 Dunnetts T-检验对结果进行统计学分析，p0.05 表明具有显著性差异。2结果与分析试验研究中所涉及的 3 种斑马鱼模型的试验终点，PPHSD 在 72.91 167 滋g/mL 的所有浓度组中斑马鱼无死亡现象，也无明显形态和行为异常。在功效评价试验中，PPHSD 选取适宜浓度进行分组试验。多肽红参饮改善营养性贫血功效试验结果（n=10）见表 1。由表 1 可知，正常对照组斑马鱼心脏红细胞染色强度与模型对照组比较有显著性差异（p0.001），而阳性对照药生血宁组斑马鱼心脏红细胞染色强度与模型对照组比较显著上升（p0.001），表明模型建立成功。PPHSD 中、高浓度组 292 和 583 滋g/mL 斑马鱼心脏红细胞染色平均强度分别为 4 729 和 4 789，与模型对照组比较显著增加，增加率为 29.7%和31.34%，差异均显著（p0.01)。结果表明，在该试验浓度条件下，PPHSD 对苯肼诱导的斑马鱼贫血具有明显的改善作用。多肽红参饮处理后斑马鱼心脏红细胞染色强度典型图见图 1。由图 1 可知，模型组的心脏红细胞染色程度明显比正常对照组少，多肽红参饮（PPHSD）组心脏红细胞染色程度明显比模型组高，其结果与上述描述的一致。多肽红参饮改善微循环功效试验结果（n=10）见表 2。由表 2 可知，阳性对照组毛蕊异黄酮的血管血流速度与正常对照组相比，显著上升（p0.001）。PPHSD 的低中高 292，583，1 167 滋g/mL 这 3 个剂量组斑马鱼平均血管血流速度分别为 646，665，674 滋m/s，与正常对照组比较显著上升，分别提升了 30.37%，34.10%，35.88%（p0.05）。试验结果表明，PPHSD 可以促进正常斑马鱼的血液流动，改善斑马鱼微循环。多肽红参饮对斑马鱼吞噬荧光微球作用（n=10）见表 3。由表 3 可知，阳性对照组破壁灵芝孢子粉（2 000 滋g/mL）的斑马鱼体内荧光微球残留数目与正常对照组相比，降低率为 21.39%，具有显著性（p0.05）。PPHSD 的低中高 72.9，146，292 滋g/mL 这3 个剂量组斑马鱼体内荧光微球残留数目与正常对照组相比，分别降低 31.96%，32.22%，32.73%，具有显著差异（p0.01）。红参多肽饮处理后斑马鱼荧光微球残留数目典型图见图 2。表 1多肽红参饮改善营养性贫血功效试验结果（n=10）组别质量浓度/滋g mL-1心脏红细胞染色强度（像素）正常对照组模型对照组生血宁片PPHSD-25014629258327 663583*3 64617927 390570*4 1632134 729211*4 789233*注：与模型对照组比较，*p0.01，*p0.001。图 1多肽红参饮处理后斑马鱼心脏红细胞染色强度典型图正常对照组模型对照组生血宁 250 滋/mg多肽红参饮 146 滋g/mL 多肽红参饮 292 滋g/mL 多肽红参饮 583 滋g/mL表 2多肽红参饮改善微循环功效试验结果（n=10）组别质量浓度/滋g mL-1节间血管血流速度/滋m s-1正常对照组毛蕊异黄酮PPHSD-4.262925831 16749628.368128.5*64650.0*66543.4*67432.0*注：与正常对照组比较，*p0.05，*p0.001。组别质量浓度/滋g mL-1荧光微球残留数目/个正常对照组破壁灵芝孢子粉PPHSD-2 00072.914629238.82.6930.52.09*26.42.07*26.32.70*26.11.14*注：与正常对照组比较，*p0.05，*p0.01。李开莹，等：基于斑马鱼模型评价多肽红参饮调节气血作用31农产品加工2023 年第 8 期图 2红参多肽饮处理后斑马鱼荧光微球残留数目典型图由图 2 可知，多肽红参饮组（PPHSD）红色荧光数明显少于正常对照组。当荧光微球在体内残留量少，说明斑马鱼体内巨噬细胞对外来异物的吞噬能力强。结果表明，PPHSD 具有增强免疫力作用。3结论采用现代模式生物模型斑马鱼模型研究组合物在气血调节方面的作用及作用机理。试验结果表明，72.91 167 滋g/mL 质量浓度范围的 PPHSD 对斑马鱼无毒性；292 和 583 滋g/mL PPHSD 组能够明显提升苯肼诱导的贫血斑马鱼的心脏红细胞染色强度增强，与模型对照组相比增加率为 29.7%和31.34%，差异均显著（p0.01）；给予 PPHSD 的斑马鱼组的血管血流速度明显强于正常对照组，292，583，1 167 滋g/mL 的 PPHSD 对斑马鱼平均血管血流速度分别提升了 30.37%，34.10%，35.88%，具有显著性差异（p0.05）；72.9，146，292 滋g/mL 的 PPHSD明显降低斑马鱼体内荧光微球残留数目，与正常对照组相比分别降低 31.96%，32.22%，32.73%，差异均显著（p0.01），其增强免疫力作用明显且优于阳性对照破壁灵芝孢子粉。综上所述，食源性多肽为主的组合物具有增强免疫力、改善贫血及改善微循环作用，可改善斑马鱼的总体气血状况。试验结果与已有的原料功效认知相一致，具有综合调节机体免疫功能，共同改善机体贫血并增强免疫力的作用。不仅为此类活性多肽成分的功效提供试验佐证，而且也为具有评价此类功效提供了新的试验模型。参考文献：边智伟，吴承玉.“女子以血为本”理论源流探析 J.中医药导报，2010，16（12）：8-10.刘竞男，张会永，于莉，等.基于文献分析的血虚证诊断标准比较研究 J.世界科学技术中医药现代化，2020，22（6）：2 050-2 055.马思佳，魏增嵘，关林峰.浅谈关于传统中医理论中对痛经的探析 J.实用妇科内分泌杂志，2017，26（4）：10-12.邢玉，刘艳霞.月经过少病古代文献研究 J.北京中医药，2015，34（4）：291-293.方瑜，卢永屹.从气血理论探讨女性围绝经期的生理病理 J.湖南中医杂志，2019，35（6）：110.谢艳，巫喜燕，钟向阳，等.补气养血膏辅助治疗卵巢功能衰退临床观察 J.实用中医药杂志，2021，37（4）：629-631.宋怡敏，毛跟年，黄晓双，等.阿胶泡腾颗粒对小鼠造血功能及抗疲劳作用的影响 J.动物医学进展，2011，32（10）：83-86.Hongzhong Wu，Chunyan Ren，Fang Yang，et al.Extrac原tion and identification of collagen-derived peptides withhematopoietic activity from Colla corii asini J.Journal ofEthnopharmacology，2016（182）：129-136.杨琳，张朝绅.中药阿胶临床应用分析及药理作用 J.中国实用医药，2020，24（15）：192-194.Dai Yuwei，Cao Jie，Wang Yuye，et al.A comprehensivereview of edible birds nest J.Food Research Interna原tional，2020（140）：109 875.梁荣，樊琛，李燕，等.小分子阿胶肽的免疫调节作用J.食品工业科技，2019，40（22）：306-310.文偲璇.燕碎蛋白肽与多糖的分离制备及抗氧化活性D.厦门：集美大学，2016.Gore A V，Pillay L M，Venero Galantrnik M，et al.Thezebrafish：A fintastic model for hematopoietic developmentand disease J.WIREs Dev Biol，2018，7（3）：312.田丽莉，朱国福援 斑马鱼在中药研究中的应用 J.中国中药杂志，2015，40（5）：822.史珅，李昊虬，王龙，等.三种乳制品对低免疫力模型斑马鱼免疫功能的影响 J.食品科学，2021，43（11）：113-120.王涛，戴明珠，李延川，等.复方中药提取物增强免疫力作用及初步机制研究 J.中国实验动物学报，2022（2）：198-207.强巴，郭胜亚，陈伦举，等.二十五味肺病丸改善斑马鱼微血管功能障碍及机制的探究 J.天津中医药大学学报，2021，40（6）：758-762.Ma Wanjun，Shi Yali，Yang Gaozhong，et al.Hypolipi原daemic and antioxidant effects of various Chinese dark teaextracts obtained from the same raw material and their mainchemical components J.Food Chemistry，2021（375）：131 877.付式杰，李爱民，吴晓磊，等.蔓越莓制品对斑马鱼抗感染及炎症的抑制作用 J.现代食品科技，2022，38（4）：28-33，170.刘均，李强，谭蓉，等.基于斑马鱼生物模型评价青钱柳的降糖作用 J.现代食品科技，2022，38（5）：1-7，164.Pradhan Lilesh Kumar，Sahoo Pradyumna Kumar，AparnaSai，et al.Suppression of bisphenol A-induced oxidativestress by taurine promotes neuroprotection and restores al原tered neurobehavioral response in zebrafish（Daniorerio）J.Environmental Toxicology，2021，36（11）：2 342-2 353.殷多肽红参饮 292 滋g/mL多肽红参饮 72.9 滋g/mL正常对照组多肽红参饮 146 滋g/mL破壁灵芝孢子粉 2 000 滋g/mL12345678910111213141516171819202132