基于ISSR分子标记的红豆草资源遗传多样性分析.pdf

第 41 卷 第 4 期2023 年 8 月四川农业大学学报Journal of Sichuan Agricultural UniversityVol.41 No.4Aug.2023基于ISSR分子标记的红豆草资源遗传多样性分析马彪，魏少萍，苗佳敏，南丽丽*，梁鹏飞，李景峰（甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室，兰州 730070）摘要：【目的】分析评价红豆草（Onobrychis viciaefolia）种质资源间亲缘关系的远近，为红豆草的良种选育提供了科学依据。【方法】利用ISSR分子标记技术对国内外22份红豆草种质资源进行遗传多样性分析。【结果】用13条引物扩增共获得101条谱带，其中多态性条带98条，多态性比率为97.12%，平均每条引物扩增出7.8个条带，平均多态性条带为7.5条，平均等位基因数（Na）、平均有效等位基因数（Ne）、Neis基因多样性指数（H）和香农多样性指数（I）均值分别为1.97、1.49、0.30和0.46。【结论】遗传相似性系数聚类分析表明，22份红豆草种质资源在遗传系数0.69处可聚为4大类群，其中2668号和1号单独聚为一类，与其他材料遗传差异较大。关键词：红豆草；ISSR；遗传多样性；亲缘关系中图分类号：S541+4 文献标志码：A 文章编号：1000-2650（2023）04-0619-07Genetic Diversity Analysis of Sainfoin Resources Based on ISSR Molecular MarkersMA Biao，WEI Shaoping，MIAO Jiamin，NAN Lili*，LIANG Pengfei，LI Jingfeng（College of Pratacultural Science，Gansu Agricultural University/Key Laboratory of Grassland Ecosystem，Ministry of Education，Lanzhou 730070，China）Abstract:【Objective】This study aim to analyze and evaluate the genetic relationships among the germplasm resources of Onobrychis viciaefolia，and finally to provide a scientific basis for the breeding of better varieties of Onobrychis viciaefolia.【Method】Genetic diversity of 22 germplasm resources of red bean grass at home and abroad was analyzed using ISSR molecular markers.【Result】A total of 101 bands were detected by amplification using 13 markers，among which 98 were polymorphic，with a polymorphism ratio of 97.12%.An average of 7.8 bands were amplified by each primer，with an average of 7.5 polymorphic bands.The average number of alleles（Na），average effective number of alleles（Ne），Neis gene diversity index（H）and Shannon diversity index（I）were 1.97，1.49，0.30 and 0.46，respectively.【Conclusion】The clustering analysis of genetic similarity coefficient showed that the 22 germplasm resources could be clustered into four groups at the genetic coefficient of 0.69，among which No.2668 and No.1 were clustered into one group，which had great genetic difference from other materials.Keywords:sainfoin；ISSR；genetic diversity；genetic relationship红豆草（Onobrychis viciifolia）是豆科（Leguminosae）驴食草属（Onobrychis Mill）多年生草本植物，被誉为“牧草皇后”1-2，不仅富含蛋白质、维生素、矿物质，单宁含量适中且草产量较高，亦是干旱、半干旱区或高寒、高纬度地区发展畜牧业和改善生态的优良草种3。其耐旱4、耐盐5、抗寒6、耐低磷7、耐贫瘠、固氮、根系发达且花色艳丽，是很好的水土保持植物和蜜源植物8。此外，红豆草种质资源在群体doi：10.16036/j.issn.1000-2650.202302204收稿日期：2023-02-16基金项目：甘肃省科技计划项目（22YF7NA112）；国家自然科学基金（32160327）；国家现代农业产业技术体系（CARS-34）。作者简介：马彪，硕士研究生，E-mail：。*责任作者：南丽丽，教授，博士，主要从事牧草栽培与育种研究，E-mail：。四川农业大学学报第 41 卷 内有较高变异，且基因型分布与地理分布有关9。到目前为止，我国审定登记的红豆草品种只有3 个，分 别 为 甘 肃 红 豆 草（Onobrychis viciaefolia Gansu，地方品种）、蒙农红豆草（Onobrychis viciaefolia Mengnong，育成品种）和奇台红豆草（Onobrychis viciaefolia Qitai，地方品种），远不能满足我国草食畜牧业发展的需求。引进高产优质、抗逆性强的红豆草材料，是有效拓宽国内红豆草品种遗传基础的重要方面，且对改良现有品种的农艺性状、缩短红豆草育种年限、加速红豆草育种进程、扩大育种原始材料均具有重要的意义，但引进种质因地域差异往往会表现出与原产地表型性状差异较大的特性10。植物表型受环境条件的影响较大，同一基因型在不同环境条件下表现不同，相同的表型可能具有不同的基因型11，且红豆草为异花授粉植物，单纯通过表型性状来研究其遗传关系以及进行种质筛选，可靠性比较低，将表型性状12和分子标记技术结合对其进行遗传多样性和亲缘关系研究，可靠性比较高。ISSR（inter-simple sequence repeat）分子标记技术是利用微卫星DNA序列设计引物，对简单重复序列进行区段扩增的分子标记，具有操作便捷、快速、高效的特点，多用于植物遗传多样性、居群遗传结构及其亲缘关系检测等13。目前已在蓝花楹（Jacaranda mimosifolia）14、苦茶（Camellia assamica）15、樱花（Cerasus spp.）16、鸭茅（Dactylis）17、狗牙根（Cynodon dactylon）18、报春花（Primula malacoides）19等种质资源遗传多样性和品系鉴定等方面均有报道，但在红豆草上的研究报道少见。为此，本研究运用ISSR分子标记技术，从DNA分子水平上分析国内外22份红豆草种质间的遗传多样性状况和亲缘关系，旨在为红豆草种质资源的评价和合理利用提供理论依据。1材料和方法1.1试验材料供试材料共22份（表1），其中20份由农业农村部全国畜牧兽医总站牧草种质资源搜集保护项目表1供试红豆草材料及来源Table1Materials and sources of sainfoin used in this study序号No.12345678910111213141516171819202122编号Code99771370974562208GS13523MN2323-220499155162616689699986096022559266811029519942323-16来源地Origins俄罗斯俄罗斯俄罗斯俄罗斯甘肃俄罗斯内蒙古俄罗斯俄罗斯俄罗斯俄罗斯俄罗斯俄罗斯俄罗斯俄罗斯俄罗斯俄罗斯俄罗斯俄罗斯俄罗斯俄罗斯俄罗斯品种（系）名Specific name野生材料野生材料野生材料野生材料甘肃红豆草野生材料蒙农红豆草野生材料野生材料野生材料野生材料 野生材料野生材料野生材料野生材料野生材料野生材料野生材料野生材料野生材料野生材料野生材料620第 4 期马彪，等：基于ISSR分子标记的红豆草资源遗传多样性分析协作组（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所）从俄罗斯瓦维洛夫植物基因库引进，蒙农红豆草（MN）和甘肃红豆草（GS）分别由内蒙古农业大学和甘肃农业大学提供，所有材料于2021年7月1日种植于甘肃农业大学草业学院植物生长室，出苗后剪取健康的红豆草幼嫩叶片，液氮速冻后放置在-80 冰箱中保存备用。1.2试验方法1.2.1基因组DNA的提取采用集群采样法提取DNA，即同种的植物材料分别取2030株的叶片，充分混合后使用植物基因组提取试剂盒法（产品编号：DP305）提取总DNA，用超微量紫外分光光度计和电泳凝胶检测DNA浓度质量后再用ddH2O稀释到同一浓度放入4 保存备用。1.2.2ISSR引物筛选及最佳退火温度筛选试验所用引物是从加拿大哥伦比亚大学UBC公司设计的通用ISSR标记，从相关文献20-21中挑选出用于豆科植物扩增的ISSR引物，经过对红豆草PCR 扩增筛选出相对条带较多、稳定性较好的引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。再对筛选出的引物使用梯度PCR仪，根据各引物理论退火温度设置6个退火温度梯度（Tm1）进行最佳退火温度的确定。1.2.3PCR扩增ISSR-PCR 反应体系确定为 20 L，其中包括DNA模板1 L，10 mmol/L引物1 L，2 Taq Master Mix 8.5 L，再用 ddH2O 补足。PCR 扩增程序为：94 预变性4 min后，94 30 s、41.4 61.4 （退火温度因引物不同而不同）退火 45 s、72 延伸2 min，共35次循环；最后72 延伸7 min，4 保存。PCR扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，用DM4500（M）和 DM2000(M1)作标准分子量对照，在5 V/cm电压下电泳1 h，电泳结果在紫外凝胶成像系统中观察并拍照记录。1.2.4数据分析凝胶图像用（quantity one）软件进行分析，将电泳图谱信息根据条带（DNA片段）的有无统计转化成“0/1”二元矩阵。利用NTSYS-pc V2.10软件将读取的“0，1”数据进行矩阵转换后根据不同材料间的遗 传 相 似 性 系 数 按 UPGMA 法（unweighted pair group method using arithmetic averages）构建遗传聚类图；用POPGENE32软件计算有效等位基因（effective number of alleles，Ne）、Neis 基因多样性指数（Neis gene diversity，H）、Shannons 多态信息指数（Shannons information index，I）等。2结果与分析2.1引物筛选及最佳退火温度确定将引物用于4个差异较大的特殊材料（GS、MN、9155、13709）的扩增，筛选出了13条扩增条带清晰且多态性较高的引物，根据各引物理论退火温度设置6个退火温度梯度（Tm1），再使用梯度PCR仪对各引物进行扩增，去除带型不易辨别，扩增条带减少、片段变短等处所对应的温度，选择扩增条带清晰较多，扩增稳定性较高处对应的温度则确定为该引物的最佳退火温度，且在此过程中发现实际退火温度一般高于理论退火温度，具体见表2。2.2扩增产物多态性分析由表2可知，13条引物共获得101条清晰可辨条带，其中具有多态性的条带98条，平均多态性比率为97.12%，平均每条引物扩增出7.8条条带，平均多态性条带为7.5条；除引物UBC873的扩增多态性比例仅为62.50%外，其他引物扩增多态性比例均为100.00%；扩增的DNA片段集中在2502 000 bp，可见供试的22份红豆草种质资源DNA片段较大且具有较高的遗传多态性。引物UBC835对22份种质材料的扩增结果如图1所示。2.3遗传多样性分析由表3可知，22个红豆草样本平均等位基因数（Na）为1.97，有效等位基因数（Ne）在1.241.66，平均为1.49，Neis多样性指数（H）在0.140.38，平均为0.30，Shannons信息指数（I）在0.230.56，平均达0.46。而H和I是衡量群体间遗传多样性水平的重要指标，由此可知，供试22份红豆草种质资源遗传多样性较丰富。2.4遗传距离和亲缘关系分析由表4可知，22个红豆草样本的遗传相似性系数在0.2080.960，平均为0.678，其中遗传相似度最大的是2049号和7456号红豆草样本，为0.960，说明2049号和7456号红豆草样本间存在较小差异，遗传距离最小；而2668号和9699号红豆草样本的遗传相似性系数最小，为0.208，表明二者间遗传背景较远，差异较大。由图2可知，遗传系数为0.69时，22份红豆草可分为4类，第一类为1号；第二类为2668号；第三类为9602、GS、13523和13709号；第四类为6、2559、9699、2323-1、10295、1994、9860、1668、1626、2323-2、621四川农业大学学报第 41 卷 表322份红豆草样本的ISSR分子标记遗传多样性分析Table 3Genetic diversity analysis of ISSR molecular marker in 22 samples of sainfoin位点Locus平均标准差样本Simple size22观测等位基因数Observed number of alleles(Na)1.970.17有效等位基因数Effective number of alleles(Ne)1.490.30Neis多样性指数Neis gene diversity(H)0.300.14Shannon信息指数Shannons information index(I)0.460.19表213条ISSR引物扩增结果Table 2Amplified results of 13 primers引物PrimersUBC807UBC808UBC811UBC814UBC834UBC835UBC836UBC848UBC855UBC856UBC873UBC876UBC881平均小计序列Sequence(5-3)(AG)8T(AG)8C(GA)8C(CT)8A(AG)8YT(AG)8YC(AG)8YA(CA)8RG(AC)8YT(AC)8YA(GACA)4(GATA)2(GACA)2(GGGGT)3理论退火温度Tm/46.448.746.744.148.750.248.452.752.752.346.939.462.4最佳退火温度Optimum Tm/48.451.747.746.152.750.250.452.752.752.348.941.461.4扩增总条带数Total amplified bands55591091151288777.8101多态性条带数Number of polymorphic bands55591091151285777.598多态性比率Percentage of polymorphic bands100.00100.00100.00100.00100.00100.00100.00100.00100.00100.0062.50100.00100.0097.12注：Y代表简并碱基C或者T；R代表简并碱基A或者G.。Note：Y represents degenerate base C or T；R represents degenerate base A or G.M为marker；122同表1的材料编号。M means marker；1 to 22 are the same as table 1.图1UBC835扩增结果Figure 1The amplification result of UBC835 ISSR marker622第 4 期马彪，等：基于ISSR分子标记的红豆草资源遗传多样性分析表422份材料的遗传相似性（对角线下）和遗传距离（对角线上）Table 4Neis genetic identity(below diagonal)and genetic distance(above diagonal)编号No.99771370974562208GS13523MN2323-220499155162616689699986096022559266811029519942323-169977*0.6240.8610.8610.6140.7030.8320.8520.9010.8710.8220.8220.7530.7430.5940.7430.2770.5350.7530.7820.7230.693137090.472*0.7030.6830.6340.7430.6730.6340.7230.6930.7230.6440.6930.7030.6540.7230.2770.5940.6340.6630.6830.71374560.1490.352*0.8810.6140.6830.8710.8710.9600.8910.8610.8420.7920.8020.6340.7820.2570.4950.7720.8020.7030.79222080.1490.3810.127*0.6340.7230.8710.8320.9210.9110.8810.8420.7920.7820.6140.7620.2570.5350.7720.7620.7230.733GS0.4880.4560.4880.456*0.7330.6040.5840.6140.6040.5740.5740.6040.6930.7620.5740.4460.6830.6830.6730.6140.584135230.3520.2980.3810.3250.311*0.6930.6540.7230.7330.7030.7230.6930.7230.7530.7030.3760.6140.7130.7030.6630.634MN0.1840.3960.1380.1380.5040.367*0.9410.8910.8610.9110.8710.8020.7330.5840.7530.2670.5050.7620.7530.7130.7622323-20.1610.4560.1380.1840.5380.4260.061*0.8910.8610.8710.8520.7620.7330.5640.7130.2670.4650.7820.7330.6930.72320490.1040.3250.0400.0830.4880.3250.1150.115*0.9110.8810.8610.8320.8220.6340.8020.2180.4950.8120.8220.7430.79291550.1380.3670.1150.0930.5040.3110.1490.1490.093*0.8910.8910.8020.7720.6040.7720.2280.5050.7820.7920.7130.72316260.1960.3250.1490.1270.5550.3520.0930.1380.1270.115*0.8610.8120.7620.5740.7820.2380.5150.7530.7230.7430.77216680.1960.4410.1730.1730.5550.3250.1380.1610.1490.1150.149*0.7920.7620.5740.7230.2770.5150.7330.7620.7030.71396990.2840.3670.2330.2330.5040.3670.2210.2710.1840.2210.2080.233*0.7920.5640.8910.2080.4850.8020.7920.8520.88198600.2980.3520.2210.2460.3670.3250.3110.3110.1860.2580.2710.2710.233*0.7330.7430.2770.5550.7720.8020.7430.73396020.5210.4260.4560.4880.2710.2840.5380.5720.4560.5040.5550.5550.5720.311*0.5550.4650.6040.5840.6730.5550.56425590.2980.3250.2460.2710.5550.3520.2840.3390.2210.2580.2460.3250.1150.2980.590*0.2180.5350.7720.7620.7820.85226681.2831.2831.3571.3570.8090.9781.3191.3191.5241.4801.4371.2831.5711.2830.7651.524*0.5840.3270.2970.2770.24810.6260.5210.7030.6260.3810.4880.6830.7650.7030.6830.6640.6640.7230.5900.5040.6260.538*0.5450.6140.5350.525102950.2840.4560.2580.2580.3810.3390.2710.2460.2080.2460.2840.3110.2210.2580.5380.2581.1190.608*0.7920.7330.76219940.2460.4100.2210.2710.3960.3520.2840.3110.1960.2330.3250.2710.2330.2210.3960.2711.2140.4880.233*0.7230.7722323-10.3250.3810.3520.3250.4880.4100.3390.3670.2980.3390.2980.3520.1610.2980.5900.2461.2830.6260.3110.325*0.81260.3670.3390.2330.3110.5380.4560.2710.3250.2330.3250.2580.3390.1270.3110.5720.1611.3960.6450.2710.2580.208*623四川农业大学学报第 41 卷 MN、9155、2208、2049、7456和9977号。3讨论与结论遗传多样性是物种生存和发展进化的前提22，其值越高，在环境发生变化时生存下来的可能性就越大，越容易扩展其分布范围和开拓新环境23。本研究表明，22份红豆草种质的平均遗传相似系数为 0.678，不同材料间遗传相似系数的值介于0.2080.960，变化范围较大，表明这些材料代表性广泛，Neis基因平均多样性指数为0.30，高于N.Hilde24公布的植物平均遗传多样性水平（0.220.23），表明红豆草具有丰富的遗传多样性。影响红豆草种群遗传多样性的因素既有内部因素（繁育方式、遗传漂变、自然选择、基因突变和基因流）又有外部因素（环境变化和人为干扰引起的种群隔离、生境片断化等），内部因素可直接作用于基因组，引起等位基因数目与频率的变化，外部因素通过某种间接方式使植物群体的遗传多样性水平和遗传结构发生变化25。所以试验过程中可通过增加引物数量以及优化相应的扩增体系对种群遗传多样性进行更加准确的分析评价。ISSR分子标记将22份红豆草在遗传相似系数0.69处聚为4类，2668号和1号均单独聚为一类，与其他材料遗传距离较远，且两者间遗传距离为0.538，同时也说明两者亲缘关系较远，结合前期作者对22份红豆草种子的形态特征和营养成分进行了研究12，根据种子形态特征和主要营养成分把22份红豆草聚类为3组，发现2668号和1号种子材料也聚在不同类，比较发现2668号材料种子发芽力较强、较大较圆、重量较重、主要营养成分含量较高；1号材料种子形态指标偏小，发芽力较弱，由此说明二者为完全不同的材料。此外，与其他材料相比，9602号与其他绝大部分材料遗传距离较大，亲缘关系较远，也可作为独立的材料；大部分俄罗斯引进材料与国内品种甘肃红豆草亲缘关系较远，而与蒙农红豆草相近，这可能是由于甘肃红豆草为地方品种，与国外引进材料地理距离相隔甚远所致；而蒙农红豆草采用多次混合选择育成，为育成品种，其亲本来源广。另外，7456号与2049号二者之间遗传距离仅为0.040，推测这2份材料可能为同一种质材料。虽然ISSR标记聚类的结果与基于形态特征聚类的结果仍存在一些差别，但是形态特征和ISSR分子标记两种聚类分析都可将大部分地理来源相近的种质聚在一起，两者可相辅相成。ISSR标记体现的是种质材料间分子水平上的差异，可有效揭示植物种质资源的遗传多样性、亲缘关系和遗传分化程度26，而表型性状的差异是基因与环境共同作用的结果，所以存在分子标记检测出的遗传差异与所观测的表型差异不太相一致的现象。在实际应用中可将ISSR分析结果结合表型性状分析结论应用于品种选育，选择遗传距离较大、亲缘关系较远，表型性状表现较好的材料做亲本，以增加后代的遗传重组和提高杂种优势。图2基于ISSR标记的UPGMA聚类分析Figure 2UPGMA clustering analysis based on ISSR markers624第 4 期马彪，等：基于ISSR分子标记的红豆草资源遗传多样性分析参考文献：1 南丽丽，温素军，魏凡，等.红豆草新品系的草产量及营养价值研究 J.草地学报，2020，28（2）：383-388.2 肖占文，张俐，刘金荣.人工种植红豆草对灰棕荒漠土改土效应的研究 J.干旱地区农业研究，2011，29（3）：199-202.3 BHATTARAI S，COULMAN B，BILIGETU B.Sainfoin（Onobrychis viciifolia Scop.）：renewed interest as a forage legume for western CanadaJ.Canadian Journal of Plant Science，2016，96（5）：748-756.4 于闯，南丽丽，魏永鹏.不同红豆草材料苗期抗旱性综合评价 J.草原与草坪，2017，37（4）：74-80.5 伍国强，李辉，雷彩荣，等.添加KCl对高盐胁迫下红豆草生长及生理特性的影响 J.草业学报，2019，28（6）：45-55.6 田丰，于闯，付双军，等.7份红豆草对低温的生理响应及抗寒性评价 J.甘肃农业科技，2018（10）：21-26.7 江海慧，汪堃，陈洁，等.低磷胁迫对红豆草新品系幼苗生长及生理特性的影响 J.草原与草坪，2020，40（6）：95-101.8 张瑞，谢鹤.红豆草及其在蜂业生产中的利用价值 J.中国蜂业，2014，65（10）：33-34.9 KEMPF K，MORA-ORTIZ M，SMITH L M J，et al.Characterization of novel SSR markers in diverse sainfoin（Onobrychis viciifolia）germplasm J.BMC Genetics，2016，17（1）：124.10 关荣霞，郭娟娟，常汝镇，等.国外种质对中国大豆育成品种遗传贡献的分子证据 J.作物学报，2007，33（9）：1393-1398.11 柴继宽，赵桂琴，孟丽娟.引进红三叶种质资源遗传多样性的ISSR分析 J.草地学报，2017，25（1）：148-154.12 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