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,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢。本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢,L/O/G/O,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢。本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢,生物样品预处理惯用方法,以及最新进展,第1页,惯用处理方法,处理方法介绍,4,生物样品预处理目标,1,预处理指导标准,2,3,目录,第2页,一、生物样品,生物样品种类,胆汁、乳汁、脑脊液、泪液、精液、胃液、胰液、淋巴液、粪便等。,第3页,一、生物样品预处理目标,1.,使药品从缀合物及结合物中释放出来，以测定药品,总浓度。,2.,生物样品介质组成复杂，干扰多，而药品组分是微量,，必须先经过预处理，使纯化，富集。,3.,为了适应和符合测定方法所要求灵敏度。,4.,为了预防分析仪器污染、劣化，提升测定灵敏度、,准确度、精密度和选择性等。,第4页,二、生物样品预处理指导标准,生物样品进行预处理时应考虑到问题：,1.,药品理化性质和存在性质,2.,待测药品浓度,3.,药品测定目标,4.,选取生物样品类型,5.,样品预处理与分析技术关系,第5页,二、指导标准,-,预处理应考虑问题,1.,药品理化性质和存在形式,A.,酸碱性质、未电离分子亲脂性、挥发性：,包括药品,提取性质、是否挥发损失以及能否采取,GC,法,a.,较亲脂药品：,可用溶剂萃取，也可用烷基键和相,硅胶、大孔吸附树脂及亲水型填料,SPE,等方法。,b.,亲水性较强且有酸碱性、可电离药品：,离子交换柱,和离子对液液萃取等。,c.,亲水性较强但不能电离药品：,沉淀蛋白,第6页,二、指导标准,-,预处理应考虑问题,1.,药品理化性质和存在形式,B.,药品在体内存在形式及蛋白结合率：,a.,结合蛋白率高,:,首先去蛋白,b.,多为代谢缀合物：,缀合物水解,C.,药品光谱特征及官能团特征：,包括分析仪器,选择以及是否需要衍生化和特殊检测器。,紫外吸收强弱：,是否用,UV,检测器,含有,-NO,2,、,-Cl,等电负性基团：,ECD,检测器,第7页,二、指导标准,-,预处理应考虑问题,1.,药品理化性质和存在形式,D.,药品稳定性：,a.,易氧化药品,:,加入抗氧剂,b.,易被光分解药品,:,避光,c.,易被酯酶水解药品,:,对酶进行灭活,第8页,二、指导标准,-,预处理应考虑问题,2.,待测药品浓度,浓度越大，预处理要求越低；反之，浓度越小，,预处理要求越高。比如，地高辛治疗血药浓度,为,1-2ng/ml,而水杨酸治疗血药浓度为,20-100g/ml,。,3.,药品测定目标,a.,急性中毒病例：,快速判定所怀疑药品，尽,可能短时间测得。预处理可粗放些。,b.,分别取得酸性、中性或碱性代谢物：,要考虑,全方面、细致,第9页,二、指导标准,-,预处理应考虑问题,4.,选取生物样品类型,血浆、血清：,除蛋白然后提取,唾液：,离心去粘蛋白,尿液：,酸水解或酶水解法使缀合物水解,头发：,有机破坏,5.,样品预处理与分析技术关系,样品预处理需要净化程度与所用分析,方法是否专属、是否含有分离能力、检,测系统对杂质污染耐受程度相关。,第10页,三、惯用处理方法,惯用方法,1.,有机破坏法,2.,除蛋白法,3.,缀合物水解,4.,分离，纯化,与浓集,5.,衍生化法,重点介绍,除蛋白法,液液萃取法,第11页,三、惯用处理方法,-,有机破坏法,1.,有机破坏法,分 类,特 点,样 品,湿法,破坏,硝酸,高氯酸法,1、硫酸作为分解剂（消化剂），加氧化剂（硝酸、高氯酸、过氧化氢等）作辅助分解剂。,2、破坏能力强，反应比较激烈，操作时，应在通风橱内进行。,3、先低温反应，再高温蒸发，以免发生爆炸；,4、所得无机金属离子，普通为高价态。,血、尿、组织,电热消化器法,人发,电热板消化法,烘箱消化法,干法,破坏,高温炽灼法,1、适适用于卤素、硒、硫、磷等微量元素分析前处理,2、高温炽灼法：坩埚，先完全炭化，再灰化，盐酸溶解定容。盐酸加无水碳酸钠或氧化镁等以助灰化。（高温电子炉、低温等离子）,3、氧瓶燃烧法：密闭燃烧瓶中进行燃烧，选择适当吸收液。,氧瓶燃烧法,血、人发,第12页,三、惯用处理方法,-,除蛋白法,蛋白质,沉淀,酶解法,去除蛋白,第13页,三、惯用处理方法,-,除蛋白法,1.,蛋白质沉淀,蛋白质分子凝聚从溶液中析出现象称为,蛋白质沉淀,(precipitation),，变性蛋白质,普通易于沉淀，但也可不变性而使蛋白质,沉淀，在一定条件下，变性蛋白质也可,不发生沉淀。,表面水化层 调整,pH,至等电点,蛋白质亲水胶体颗粒 凝集析出,表面电荷 加入脱水剂,破坏,破坏,第14页,三、惯用处理方法,-,除蛋白法,测定血样时，首先应去除蛋白质。,去除蛋白质,作用：,a.,可使结合型药品释放出来，方便,测定药品总浓度；,b.,可预防提取过程中蛋白质发泡，,降低乳化形成；,c.,可保护仪器性能（如保护,HPLC,柱,不被污染），延长使用期限。,第15页,三、惯用处理方法,-,除蛋白法,1.,蛋白质沉淀方法,溶剂解法,盐析和脱水,加入中性盐,蛋白质沉淀,加入强酸,生成不溶性盐沉淀,加入重金属沉淀剂,第16页,三、惯用处理方法,-,除蛋白法,A.,溶剂解法,-,加入与水相混溶有机溶剂,加入水溶性有机溶剂，可使蛋白质分子内及分子,间氢键发生改变而使蛋白质凝聚，使与蛋白质结,合药品释放出来。,惯用水溶性有机溶剂,有：乙腈、甲醇、乙醇、丙,醇、丙酮、四氢呋喃等。含药品血浆或血清与水,溶性有机溶剂体积比为,1,：（,1,3,）,时，就能够将,90,以上蛋白质除去。水溶性有机溶剂种类不,同时，析出蛋白质形状亦不一样；而且所得上清液,pH,值也稍有差异，如用乙腈或甲醇时，上清液,pH,为,8.5,9.5,，用乙醇或丙酮时，上清液,pH,为,9,10,。,第17页,三、惯用处理方法,-,除蛋白法,A.,溶剂解法,-,加入与水相混溶有机溶剂,操作步骤：,a.,水溶性有机溶剂与血浆或血清按一定百分比混合,b.,离心分离，采取超速离心机（,10000r,min,）离,心,1,2min,。（使用具塞塑料尖底管）,c.,取上清液作为样品。,将蛋白质粘牢在管底，便于吸收上清液,第18页,三、惯用处理方法,-,除蛋白法,A.,溶剂解法,-,加入与水相混溶有机溶剂,优点：,1,）分辨能力比盐析法高，即蛋白质或其它溶剂,只在一个比较窄有机溶剂浓度下沉淀；,2,）沉淀不用脱盐，过滤较为轻易；,3,）在生化制备中应用比盐析法广泛。,缺点：,对含有生物活性大分子轻易引发变性失活，,操作要求在低温下进行。总体来说，蛋白质和,酶有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。,第19页,三、惯用处理方法,-,除蛋白法,B.,加入中性盐,加入中性盐，使溶液离子强度发生改变。中性盐,能将与蛋白质水合水置换出来，从而使蛋白质脱,水而沉淀。,惯用中性盐,有：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷,酸盐及枸橼酸盐等。,操作：,a.,按血清与饱和硫酸铵百分比为,1,：,2,混合,;,b.,离心（,10000r/min,）,1,2min,，即可除去,90,以,上蛋白质。,c.,得上清液,pH,为,7.0,7.7,。,第20页,三、惯用处理方法,-,除蛋白法,B.,加入中性盐,优点,:,药品回收率高；,不引发蛋白质变性。,注意事项,:,盐析成败决定于溶液,pH,值与离子强度，,溶液,pH,值越靠近蛋白等电点，蛋白质越轻易沉淀。,第21页,三、惯用处理方法,-,除蛋白法,C.,加入强酸,当,pH,低于蛋白质等电点时，蛋白质以阳离子形式,存在。此时加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶,性盐而沉淀。,惯用强酸,有：,10,三氯醋酸、,6,高氯酸、硫酸,-,钨酸混合液及,5,偏磷酸等。,第22页,三、惯用处理方法,-,除蛋白法,C.,加入强酸,操作：,a.,含药品血清与强酸百分比为,1,：,0.6,混合,;,b.,离心,10000r,min,）,1,2min(,能够除去,90,以上蛋白质,),c.,取上清液作为样品。,优点,：,该方法去蛋白快速简单，且而所需样品量少，组分极少改变。,分析：,过量三氯醋酸可经煮沸，分解为氯仿和二氧化碳而被除去；,也有用乙醚提取过量三氯醋酸方法。过量高氯酸可用碳,酸钾、醋酸钾、氢氧化钠等中和，然后加乙醇使产生高氯,酸钾（钠）沉淀而被除去。偏磷酸及硫酸,-,钨酸可用同法除去。,因加入了强酸，上清液呈酸性（,pH0,4,），,在酸性条件下易,分解药品不宜用本法除蛋白。,第23页,三、惯用处理方法,-,除蛋白法,D.,加入含锌盐及铜盐沉淀剂,当,pH,高于蛋白质等电点时，金属阳离子与蛋白质,分子中带负电荷羧基形成不溶性盐而沉淀。,惯用沉淀剂,有,CuSO,4,-NaWO,4,、,ZnSO,4,-NaOH,等。,离心分离后所得上清液,pH,分别为,5.7,7.3,和,6.5,7.5,。,优点：,可将含水体液样品直接进样或只经简单去蛋白处理后进样，简化操作。,第24页,三、惯用处理方法,-,除蛋白法,2.,酶解法,在测定一些,酸不稳定,及,蛋白结合牢药品,时，常需,用酶解法。,最惯用酶是蛋白水解酶中,枯草菌溶素,。,它不但可使组织溶解，并可使药品析出。枯草菌溶素是,一个细菌性碱性蛋白分解酶，可在较宽,pH,范围（,PH7.0,11.0,）内使蛋白质肽键降解，在,50,60,含有最大活力。,第25页,三、惯用处理方法,-,除蛋白法,2.,酶解法,操作：,先将被测组织加,Tris-,缓冲液,pH 10.5,及酶，,60,培育,1h,，用玻璃棉过滤，得澄清滤液，,即可供药品提取用。,优点：,可防止一些药品在酸及高温下降解；对与,蛋白质结合牢药品（如保泰松、苯妥英钠），,可显著改进回收率；可用有机溶剂直接提取,酶解液而无乳化现象生成，当采取,HPLC,法检,测时，无需再进行过多净化操作。,不足：,不适合用于在碱性下易水解药品。,第26页,三、惯用处理方法,-,缀合物水解,缀合物：,药品或其代谢物与内源性物质结合生成,产物。,内源性物质：,a.,葡萄糖醛酸,、,硫酸,、甘氨酸、谷胱甘肽和醋酸,等；,b.,一些含有羟基，羧基，氨基和巯基药品，可,与内源性物质葡萄糖醛酸结合形成葡萄糖醛酸,苷缀合物；,c.,一些含酚羟基，芳胺及醇类药品与内源性物质,硫酸形成硫酸酯缀合物。,第27页,三、惯用处理方法,-,缀合物水解,特点：,多用于尿中药品或其代谢物；缀合物极性,较大，不易被有机溶剂提取。,惯用方法：,a.,酸水解,：适量盐酸（条件因药而异）,b.,酶水解,：惯用葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶或二者,混合酶，普通控制,pH,值在,4.5,5.5,，,37,培育数小时。,第28页,三、惯用处理方法,-,缀合物水解,特点,专属性强,温和,时间长,带入粘蛋白,阻塞,色谱柱,费用高,带入粘蛋白造成乳化,b.,酶水解法,第29页,四、惯用处理方法,-,分离、浓集、纯化,（一）液液萃取,（,liquid-liquid extraction,，,LLE,）,是传统分离、分析方法，据检测灵敏度要求，提取后,普通需浓集。,传统浓集方法：,a.,在末次提取时加入提取液尽可能少，使被测组分提取,到小体积溶剂中，然后直接吸出适量供测定。,b.,挥去提取溶剂法。挥去溶剂时应防止直接加热，预防,被测组分破坏或挥发损失。挥去提取溶剂,惯用方法,是直接通入氮气流吹干；对于易随气流挥发或遇热不,稳定药品，可采取减压法挥去溶剂。,第30页,四、,分离、浓集、纯化,-,液液萃取法,原理：,多数药品,是,亲脂性,，在适当有机溶剂中溶解度,大于在水相中溶解度，而血液或尿液中含有大多,数,内源性杂质,是强极性,水溶性,杂质。因而用有机溶,剂提取一次即可除去大部分杂质，从大量样品中提,取药品经浓集后作为分析样品。,第31页,四、,分离、浓集、纯化,-,液液萃取法,操作：,萃取一次，不采取重复萃取方法。,特殊情况（杂质不易除去，萃取液难以挥发干扰测定），用一定,pH,值水溶液对含药有机相进行反萃,取（,back extraction,）,萃取率不低于,50%,即可。,萃取前加入等量内标。,第32页,四、,分离、浓集、纯化,-,液液萃取法,影响萃取原因,影响萃取原因：,有机溶剂特征、有机溶剂相与水相,体积及水相,pH,值等,1.,溶剂选择与纯度要求,a.,提取率和选择性,b.,操作是否方便。,选择溶剂时应,注意以下几点,：,要了解药品与溶剂化学结构和性质，依据相同,相溶原理进行选取,要求对药品未电离分子可溶，而对电离形式,分子不溶,沸点低，易挥散、浓集,无毒、不易燃烧,第33页,四、,分离、浓集、纯化,-,液液萃取法,影响萃取原因,选择溶剂时应,注意以下几点,：,与水不相混溶，如乙醚，萃取后可混入约,1.2%,水份，可能带入一些水溶性杂质。乙醚萃取,能力强，易于挥散、浓集、为惯用萃取溶剂，,可采取无水碳酸钠脱水，降低混入水溶性杂,质量,不易形成乳化,含有较高化学稳定性和惰性,不影响紫外检测,第34页,四、,分离、浓集、纯化,-,液液萃取法,影响萃取原因,提取溶剂,：,第35页,四、,分离、浓集、纯化,-,液液萃取法,影响萃取原因,2.,有机溶剂相和水相体积,a.,有机相与水相（体液样品）容积比为,1:1,或,2:1,。,b.,在试验中考查有机溶剂最正确用量。,3.,水相,pH,值,a.,普通规则来说，碱性药品在碱性,pH,值，酸性药品在酸性,pH,值介质下提取；,b.,生物样品普通多在碱性下提取；,c.,一些碱性药品在碱性,pH,不稳定时，则在近中性,pH,处用氯仿和异丙醇提取；,d.,中性药品在,pH7,附近提取。,第36页,四、,分离、浓集、纯化,-,液液萃取法,液液萃取法,优点：,操作方便,;,含有选择性，药品能与多数内源性物质分离，尤其,在使用非专属性光谱分析时，这一优点更为突出，但这依赖,有机溶剂选择。,缺点：,a.,产生乳化现象，引发药品损失，造成回收率较低,;,b.,有机溶剂易挥发、有毒性、对环境保护不利,;,c.,不能自动化。,注意：,1.,预防乳化现象产生,a.,采取较大致积有机溶剂进行提取；,b.,在提取前于水中加入固体氯化钠,;,c.,轻微乳化时，适当转速离心,;,d.,严重乳化时，置低温冰箱中使水相快速冻凝，破坏乳化,层再溶化后离心。,2.,降低吸附,a.,加入异戊醇,b.,加入二乙胺,第37页,四、,分离、浓集、纯化,-,液液萃取法,液液萃取法,-,离子对萃取法,离子对萃取法是用有机溶剂提取离子性药品方法。,原理：,离解 加入反离子,酸或碱性药品 带电荷离子 脂溶性离子对,体液中,亲水性极强,用有机溶剂从水相萃取,第38页,四、,分离、浓集、纯化,-,液液萃取法,离子对萃取法,碱性药品,烷基磺酸类化合物（,RSO,3,H,）,戊烷磺酸,己烷磺酸,庚烷磺酸,月桂磺酸,离子对试剂,选择,酸性药品,烷基季铵类化合物（,R,4,N,+,X,-,）,四丁基铵,四乙基铵,四辛基铵,惯用提取溶剂为,三氯甲烷、二氯甲烷,等。,第39页,四、,分离、浓集、纯化,-,液液萃取法,1,体液中呈阴离子状态药品及代谢物,2,体液中能离解成阳离子药品,3,尿液中水溶性大葡萄糖醛酸苷和硫酸酯缀合物,应用,第40页,
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