干旱沙漠生活的塔里木兔肾脏中水通道蛋白7的高表达.pdf

第35卷 第 2期2023年6月塔里木大学学报Journal of Tarim UniversityVol.35 No.2Jun.2023文章编号：1009-0568（2023）02-0023-11干旱沙漠生活的塔里木兔肾脏中水通道蛋白7的高表达李永乐1，罗生杰1，张刘凯1，史瑞军1，张建萍1,2*（1 塔里木大学生命科学与技术学院，新疆 阿拉尔 843300）（2 塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室-省部共建重点实验室培育基地，新疆 阿拉尔 843300）摘要本研究利用RT-PCR方法克隆获得塔里木兔肾脏水通道蛋白7（aquaporin7，AQP7）基因片段并测序，进行生物信息学分析，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、免疫印迹（western blotting）和免疫组织化学（IHC）分析了AQP7在塔里木兔和家兔肾脏中mRNA和蛋白质表达特征及定位，探讨AQP7在塔里木兔适应极端干旱环境过程中可能发挥的作用。结果表明：AQP7基因序列编码区长度为1 032 bp，共编码343个氨基酸，塔里木兔AQP7与家兔AQP7氨基酸序列相似度为95.63%，塔里木兔中的差异氨基酸丙氨酸和脯氨酸的积累可能有助于其适应极端干旱环境。塔里木兔肾脏中AQP7基因的mRNA和蛋白质表达水平均高于家兔；AQP7在塔里木兔近端小管曲部主细胞刷状缘和近端小管直部主细胞顶质膜分布。AQP7的高表达表明塔里木兔肾脏近端小管对水和甘油的重吸收能力更强。关键词塔里木兔；肾脏；AQP7；适应性；荒漠生境中图分类号：Q734文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.1009-0568.2023.02.003High expression levels of aquaporin-7 in the kidneyof arid desert-living Lepus yarkandensisLI Yongle1，LUO Shengjie1，ZHANG Liukai1，SHI Ruijun1，ZHANG Jianping1,2*(1 College of Life Science and Technology,Tarim University,Alar,Xinjiang 843300）（2 State Key Laboratory Breeding Base for The Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin Co-funded byXinjiang Production Construction Crops and The Ministry of Science&Technology,Alar,Xinjiang 843300)AbstractIn this study,the kidney aquaporin 7 gene of Lepus yarkandensis was cloned and sequenced by RT-PCR and bioinfor-matics analysis was carried out.The mRNA and protein expression characteristics and localization of AQP7 in L.yarkandensis andOryctolagus cuniculus kidney were analyzed by quantitative real-time PCR(qRT-PCR),western blotting and immunohistochemistry(IHC),so as to explore the possible role of AQP7 in L.yarkandensis adaptation to extreme drought environment.The results showedthat the coding region ofAQP7 gene sequence was 1 032 bp,encoding a total of 343 amino acids.The amino acid sequence similari-ty between L.yarkandensis AQP7 and O.cuniculus AQP7 was 95.63%.The accumulation of differential amino acids alanine and pro-line in L.yarkandensis may help it adapt to extreme drought environment.The mRNA and protein expression levels ofAQP7 gene in收稿日期：2023-02-23基金项目：国家自然科学基金项目“塔里木兔细胞色素P450的耐干旱功能研究”（32160112）第一作者：李永乐（1998-），女，2020级在读硕士研究生，研究方向为动物基因工程。E-mail：*通信作者：张建萍（1980-），女，博士，教授，研究方向为动物基因与细胞工程以及植物有效成分抗炎机制。E-mail：塔里木大学学报第35卷塔里木兔是中国新疆特有物种，体型较小，生活在气候十分干旱的塔里木盆地。塔里木盆地年降水量少、食物十分稀缺，对水资源的高效吸收利用是塔里木兔的生存之道。近年来有相关研究报道，生态位模型（ecological niche modeling，ENM）可以揭示塔里木兔第四纪的进化史，发现栖息地干旱荒漠化、气候变化影响塔里木兔的数量和种群分布1。利用特定长度扩增片段测序（specific-length amplified frag-ment sequencing，SLAF-seq）技术分析塔里木兔的种群结构与遗传多样性，揭示塔里木兔种群之间存在一定的基因流动性，可能与塔里木兔随水源迁徙的活动影响种群之间的基因流动性有关2。水通道蛋白在塔里木兔肺中的高表达，会加速毛细血管与肺泡管之间的水转运以补充肺泡表面的水分缺失，且水通道蛋白在塔里木兔消化道中的高表达提高了消化道对粪便中水的重吸收效率3。此外，线粒体基因ND1 和ND6的正向选择可能有助于塔里木兔适应干旱环境4。以上研究表明，塔里木兔对极端干旱环境具有一定的适应性，但其适应干旱的作用机理尚不清楚。水通道蛋白（aquaporins，AQPs）是一类高选择性的水分运输膜通道蛋白，不仅可以在渗透梯度的推动下通过细胞膜进行水的运输，而且个别水通道蛋白家族成员还参与甘油、尿素和某些无机离子的运输，在维持机体的水平衡过程中发挥着重要作用。肾脏不仅是身体中最重要的水分调节器官，而且也是机体内AQPs含量最高的器官。肾脏水通道蛋白包 含 AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、AQP6、AQP7、AQP8和AQP11这8个亚型。它们通过调控肾脏水分重吸收和浓缩尿液过程以维持机体水平衡3。各个肾单位区段对水的通透性取决于每个部位上的AQPs，肾单位区段在机体的体液再吸收和排泄中发挥关键作用。不同的水通道蛋白相互协调共同调节机体内肾脏的水盐平衡。近年来有研究报道，肾脏中 AQP1、AQP2、AQP3 和 AQP4可能通过调控肾脏的水分运输来调节肾脏尿液的浓缩，使塔里木兔可以高效利用体内水分，以适应极端干旱环境3。AQP4蛋白参与沙漠袋鼠尿液浓缩的形成过程以维持极端环境下体内的水平衡5。AQP5可能参与荒漠动物麝香鼩的髓质集合管（MCD）细胞的顶质膜水转运6。以上研究表明，部分水通道蛋白在维持荒漠动物机体正常的生命活动以及对其适应恶劣环境的过程中可能发挥着重要作用，水通道蛋白家族中AQP7在荒漠动物中研究较少。AQP7是一种水-甘油通道蛋白，允许水分子以及甘油、尿素、氨等小分子溶质通过。大鼠睾丸中，甘油激酶与AQP7上的甘油转运体（GlpF）发生功能耦合时，AQP7运输甘油并调节精子的甘油渗透性7。MADEIRA A等8研究发现，在人和小鼠中，水溶性金配位化合物（Auphen）与硫供体蛋氨酸残基（Met47）结合可以抑制AQP7的水运输和甘油运输。脂肪组织或细胞中，AQP7作为水和甘油通道，参与并调节水和甘油运输，当AQP7功能丧失时，会增加甘油三酯在脂肪细胞中的含量，并引发肥胖9。从以上研究分析可知，AQP7对水运输和甘油运输具有一定的调节作用。由于目前AQP7在荒漠动物塔里木兔适应极端环境过程中发挥的作用机理仍然不清楚。本研究通过克隆塔里木兔AQP7的编码区核酸序列并对其进行生物信息学分析，更全面地了解 AQP7 的功能结构；检测AQP7在塔里木兔和家兔肾脏中的分布和表达水平，并与亲缘关系较近且水资源充足的家兔进行比较。以上研究有助于了解AQP7对于塔里木兔耐旱适应性的潜在机理，揭示AQP7在塔里木兔适应干旱环境过程中可能发挥的作用。1材料与方法1.1试验动物本试验选用年龄均为8个月的健康成年塔里木兔和家兔各6只。塔里木兔采样于塔里木盆地，家兔由塔里木大学动物科学学院试验站提供。试验动物身体状况良好，试验前腹腔注射 3%戊巴比妥钠（5mL/kg）麻醉动物，解剖获得肾脏。使用动物对象的研究由新疆维吾尔自治区野生动物保护协会批准。the kidney of L.yarkandensis were higher than those of O.cuniculus,and AQP7 was distributed in the brush edge of the principalcell of the proximal convoluted tubule and the apical plasma membrane of the the prinicipal cell of the proximal straight tubule.The high expression of AQP7 indicates that the proximal tubule of L.yarkandensis kidney has stronger reabsorption ability to waterand glycerol.KeywordsLepus yarkandensis;kidney;AQP7;adaptation;arid desert-living24第 2期1.2塔里木兔AQP7基因克隆利用 Trizol 法提取塔里木兔肾组织的总 RNA，并反转录成 cDNA，根据 GeneBank 家兔AQP7 基因序列（100350611），利用 PrimerPremier 5.0 软件设计引物（表1）。25 L PCR扩增体系：2x GC-Rich PCRMasterMix 12.5 L，10 mol/L上、下游引物各1 L，cDNA 1 L，ddH2O 9.5 L。扩增条件：预变性94，3 min，变性94，3 s，退火60，10 s，延伸72，1 min，35个循环；延伸72，10 min，扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。按照胶回收试剂盒说明书回收纯化目的片段，然后将纯化目的片段与 PMD-19T 载体16 连接过夜，并转化至DH5细胞中，氨苄抗性平板挑选阳性菌落并进行菌落PCR鉴定，最后送至上海生工测序。表1AQP7和GAPDH的引物信息引物名称AQP7 F-1AQP7 R-1AQP7 F-2AQP7 R-2GAPDH FGAPDH R引物序列（53）GATGGGAATGTGAGGCCTGGTTTCACCCCAAAGAGAGCCGATCCAGCAGGCAGGCAGAGGGAACTCTCGCACTGTCTCCTTCTGGAAGGTCGGAGTGAACGGATTGCCGTGGGTGGAATCATACT产物长度/bp1 03210789退火温度/53.554.257.6应用PCRqRT-PCRqRT-PCR1.3生物信息学分析1.3.1AQP7 理化性质与蛋白质结构分析本 研 究 使 用 Expasy Protparam（https:/web.ex-pasy.org/protparam）和CLCbio main workbench 20.0.4软件测定AQP7蛋白的分子量、等电点、电荷和疏水性。Heliquest 分析工具（rs.f）测定AQP7蛋白前18个氨基酸的极性氨基酸组成。利用 SOPMA（https:/npsa-prabi.ibcp.fr）软件预测和构建AQP7二级结构。以同源结构模型为基础，利用Swiss-model 数据库（https：/swissmodel.expasy.org）构建AQP7的三维结构，分析塔里木兔和家兔AQP7结构相似性。利用TMHMM（http:/w ww.cbs.dtu.dk/se rvices/TMHMM）确定 AQP7 蛋白质中的跨膜螺旋，并使用 Expasy（www.expasy.org/Proteology）和NetPhos3.1（http:/www.cbs.dtu）检测磷酸化位点。用PSORT II软件（https:/psort.hgc.jp/cgi-bin/runpsort.pl）测定AQP7蛋白的亚细胞分布。1.3.2AQP7氨基酸序列比对与同源性分析本研究通过对塔里木兔AQP7序列的核苷酸特征、蛋白质序列进行分析，并对其他物种的AQP7序列进行比对。通过对AQP7基因CDS序列克隆测序后在NCBI（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov）上Blastn比对分析并确定编码区开放阅读框完整性，再应用BioEdit 软件将核苷酸序列翻译为对应的氨基酸序列。使用Clustar W和MEGA 5.1软件进行多序列比对并构建系统发育树。1.4qRT-PCR检测AQP7 mRNA表达差异分析通过相对定量的基因表达，分析AQP7mRNA分别在塔里木兔肾和家兔肾中的表达水平。20 L反应体系：SYBR Premix Ex Taq（2x）10 L，cDNA 2L，1.0 mol/L 上、下游引物各 1 L，RNase FreedH2O 6.4 L。PCR反应条件：94 预变性30 s，94 变性5 s，60 退火15 s，72 延伸10 s，40个循环，每个待测样本设3个重复。用2-Ct法，以GAPDH为内参对照，计算靶基因的相对表达量。1.5AQP7蛋白免疫组织化学检测用4%的多聚甲醛固定肾脏组织，常规脱水透明处理后，石蜡包埋组织。将石蜡包埋的肾组织切成厚度为6 m切片进行免疫组化染色，切片经脱蜡，二甲苯洗涤3次，每次10 min，然后用不同浓度梯度的乙醇洗涤，从100%到70%再水化，每次5 min；用蒸馏水浸洗切片。将载玻片浸入0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液中（pH=6.0），将其进行加热至沸腾，冷却后用0.1 mol/L PBS（pH=7.4）洗涤。将切片浸在3%甲醇过氧化氢中室温 10 min，用 0.1 mol/L PBS（pH=7.4）洗涤切片。用15%山羊血清室温孵育载玻片2 h。切片肾组织与抗AQP7（稀释比1 300）于4 冰箱过夜。作为对照，组织切片中的一抗被PBS取代。切李永乐 等：干旱沙漠生活的塔里木兔肾脏中水通道蛋白7的高表达25塔里木大学学报第35卷片用0.1 mol/L PBS（pH=7.4）冲洗，50 L HRP标记的羊抗兔二抗室温孵育30 min，0.1 mol/L（pH=7.4）PBS清洗后进行DAB显色，孵育2 min后，蒸馏水洗涤10min。苏木素复染90 s，流水冲洗5 min后，二甲苯脱水透明，用中性树胶封片。用OLYMPUS显微镜观察切片染色结果，并采集显微图像。采集的图像在Ip-Win 32 软件中进行光密度分析，用统计分析软件Graphpad Prism 8.0分析其差异显著性。1.6AQP7蛋白免疫印迹检测分别提取塔里木兔和家兔的肾脏总蛋白。在100 mg 肾脏组织中放入含有 0.04 mol/L Tris-HCL（pH 7.4）、0.82%NaCl、1.5%Triton X-100、0.5%脱氧胆酸钠、0.1%SDS和1 mmol/L PMSF的1 mL裂解缓冲液中。组织匀浆于0 冰上静置30 min，12 000 r/min4 离心20 min取上清。总蛋白浓度使用BCA蛋白分析试剂盒测定后，将蛋白浓度调整一致与6x样品缓冲液混匀后，于95 C条件下加热5 min，然后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移到PVDF膜后，用含5%的脱脂奶粉的TBST室温封闭2 h，用1x TBST洗涤后，与抗AQP7抗体或抗GAPDH抗体在4 孵育过夜。用TBST洗涤一抗后，将PVDF膜与过氧化物酶标记的抗兔或抗鼠二抗在室温下孵育1 h，用TBST洗涤二抗后，然后将 PVDF膜放入 ECL检测试剂盒（SuperSignal，Pierce）中2 min进行显色。使用Tanon5200扫描图像观察目的条带，用Quantity One 4.6.2软件进行条带分析，以 GAPDH 蛋白为对照，用软件Graphpad Prism 8.0进行统计分析。1.7数据分析应用统计分析软件Graphpad Prism 8.0处理试验数据，并用t检验分析各组数据均数差异显著性。“*”表示在P20 h，在大肠杆菌中半衰期10 h。带正电的残基总数（Arg+Lys）为19 个，带负电的残基总数（Asp+Glu）为17 个（如图2A和图2B）。预测的蛋白质含有214个疏水残基（Ala、Phe、Gly、Ile、Leu、Met、Pro、Val 和 Trp 占总残基比的 62.4%），83个亲水残基（Cys、Asn、Gln、Ser、Thr和 Tyr占总残基比的 24.2%）和 45个其他残基（Asp、Glu、His、Lys 和 Arg 占总残基比的 13.2%）（图2A和图2B）。AQP7蛋白的不稳定系数为35.46，具有脂肪族指数和总平均亲水性平均值分别为95.480和0.442，据推测该蛋白属于稳定疏水性蛋白质（图2C）。如图3A用TMHMM软件预测AQP7蛋白的跨膜螺旋，发现塔里木兔AQP7有6个跨膜结构域。如图3B和图3C通过NetPhos3.1预测其磷酸位点，结果表明塔里木兔AQP7蛋白共有27个磷酸位点，其中丝氨酸（S）位点15个，苏氨酸（T）位点10个，酪氨酸（Y）位点2个。PSORT 亚细胞定位显示其主要在质膜、内质网、液泡、线粒体和高尔基体中发挥作用。M：DL 2 000 Marker；1：样品的PCR扩增图。图1塔里木兔AQP7基因PCR扩增图2.3塔里木兔与家兔AQP7氨基酸序列比对分析根 据 NCBI 公 布 的 家 兔 氨 基 酸 序 列（XP_002707990.2）与本研究克隆获得的塔里木兔 AQP7氨基酸序列进行比对（图 4），其 Identidy 和 Similarresidues分别为95.63%（328/343）和3.50%（15/343），即序列同源性为95.63%。bpM1bp8 0005 0003 0002 0001 0007505002501001 03226第 2期AB：塔里木兔AQP7蛋白的氨基酸组成；C：塔里木兔AQP7蛋白编码产物的疏水性分析。图2塔里木兔AQP7蛋白质分子构成分析2.4AQP7氨基酸同源序列比对和系统进化树分析通过将克隆获得的塔里木兔AQP7与其他17个物种的AQP7氨基酸同源性NCBI在线比对分析（图5）。塔里木兔AQP7氨基酸序列与家兔（Oryctolagus cunic-ulus）XP_002707990.2、野 猪（Susscrofa）NP_001106909.1、牛（Bos taurus）NP_001069846.1、绵 羊（Ovis aries）XP_042099032.1、马（Equus caballus）XP_023483239.1、狗（Canislupusfamiliaris）XP_038537868.1、小鼠（Mus musculus）NP_001365568.1、大鼠（Rattus norvegicus）AAN52930.1、猴子（Saimiriboliviensis boliviensis）XP_039330715.1、双峰驼（Cam-elus bactrianus）XP_010965680.1、人（Homo sapiens）AAI19674.1、鸭子（Oxyurajamaicensis）XP_035166200.1、猫（Felis catus）XP_019671647、羊驼（Vicugna pacos）XP_015105459、斑马鱼（Danio rerio）XP_021324432、鸡（Gallus gallus）XP_015132918、非洲爪蟾（Xenopustropicalis）NP_001015726。所有相比于塔里木兔的AQP7同源序列相似性分别为 95.63%，71.60%，71.56%，73.97%，75.25%，75.34%，72.05%，76.87%，79.84%，72.96%，86.54%，54.84%，75.17%，72.89%，55.98%，56.56%，56.64%。结果表明，塔里木兔AQP7氨基酸序列具有1个保守的NPA序列和1个NPS序列（图6）。李永乐 等：干旱沙漠生活的塔里木兔肾脏中水通道蛋白7的高表达27塔里木大学学报第35卷A：塔里木兔AQP7蛋白的跨膜结构特征；BC：塔里木兔AQP7蛋白序列内的磷酸化位点。图3塔里木兔AQP7蛋白质理化性质分析图4塔里木兔（蓝色）与家兔（红色）AQP7氨基酸序列比对分析28第 2期图5塔里木兔AQP7氨基酸系统发育树图6塔里木兔和17个物种AQP7氨基酸序列比对分析李永乐 等：干旱沙漠生活的塔里木兔肾脏中水通道蛋白7的高表达29塔里木大学学报第35卷2.5AQP7蛋白的三维结构预测根据human Aquaporin 2晶体结构预测塔里木兔和家兔AQP7蛋白三级结构的建模参数（表2）。如图7所示，家兔和塔里木兔的AQP7都是由同源四聚体构成。表2家兔和塔里木兔AQP7三级结构建模参数物种家兔塔里木兔组成结构同源四聚体同源四聚体模型（A）3.703.70序列相似度/%5353覆盖范围2727927279覆盖率/%100100图7家兔和塔里木兔AQP7三级结构预测图2.6AQP7 mRNA和蛋白质在肾脏中的表达水平采用 qRT-PCR和 western blotting检测家兔和塔里木兔肾脏中AQP7 mRNA 和蛋白质的表达水平。如图8A所示，与家兔相比，AQP7 mRNA在塔里木兔肾脏中呈显著上调。如图 8B 所示，积分光密度（IOD）分析发现，与家兔相比，塔里木兔肾脏中AQP7蛋白表达水平呈显著上调。结果显示，AQP7 mRNA和蛋白质在塔里木兔的肾脏中显著上调。A：qRT-PCR检测家兔和塔里木兔肾脏中AQP7mRNA表达水平；B：western blotting检测家兔和塔里木兔肾脏中的AQP7蛋白质表达水平。图8AQP7 mRNA和蛋白质在家兔和塔里木兔肾脏中的表达2.7AQP7在塔里木兔和家兔肾脏中的分布如图 9所示，AQP7在近端小管直部（PST）和近端小管曲部（PCT）上表达。在皮质中，AQP7的阳性着色定位在PCT主细胞的刷状缘，平均光密度值分析发现，与家兔相比，AQP7在塔里木兔PCT的表达呈显著升高。在外髓质中，AQP7 在近端小管直部（PST）主细胞的顶质膜分布，平均光密度显示AQP7在塔里木兔PST的表达呈显著升高。2.8AQP7在塔里木兔和家兔肾脏中的表达图本研究发现塔里木兔肾脏AQP7的表达量显著升高。如图10所示，在家兔和塔里木兔肾脏中，AQP7在近端小管曲部主细胞的刷状缘和近端小管直部主细胞的顶质膜上表达。AQP7可以促进近端小管对肾小球产生的滤液的重吸收作用。与家兔相比，塔里木兔肾脏AQP7的高表达，可以提高水的重吸收作用，减少水分流失，有助于塔里木兔适应极端干旱环境。30第 2期AB：AQP7在家兔在肾脏中的分布；CD：AQP7在塔里木兔肾脏中的分布（标尺：AD=50 m）；EF：AQP7在家兔和塔里木兔肾的近端小管曲部（PCT）和近端小管直部（PST）的IHC光密度值分析。图9AQP7在塔里木兔和家兔肾脏中的分布A：AQP7在家兔肾脏中的分布；B：AQP7在塔里木兔肾脏中的分布。AQP7：（蓝色）分布在近端小管曲部和直部顶质膜。G：肾小球；PCT：近端小管曲部；PST：近端小管直部；DTL：细段降支；ATL：细段升支；PCTC：近端小管曲部主细胞；PSTC：近端小管直部主细胞。图10AQP7在家兔和塔里木兔肾脏中的表达3讨论本研究通过基因克隆，获得AQP7基因核酸序列全长1 032 bp，共编码343个氨基酸。使用AQP7氨基酸序列进行同源序列比对分析显示，塔里木兔AQP7氨基酸序列与家兔AQP7氨基酸序列相似率达到99%；通过AQP7氨基酸系统进化树分析发现，塔里木兔与家兔的同源性最高，与斑马鱼的同源性最低，表明塔里木兔与家兔具有共同的进化起源10。通过对塔里木兔AQP7的结构和理化性质分析发现，塔里木兔AQP7蛋白共有27个磷酸位点，其中丝氨酸位点15个，苏氨酸位点10个，酪氨酸位点2个，这可能与蛋白质翻译后修饰有关11。本研究发现AQP7蛋白通道的结构里都含有一个高度保守的天冬酸-脯氨酸-丙氨酸序列（NPA），第二个NPA基序被天冬酰胺-脯氨酸-丝氨酸（NPS）序列代替，这与大鼠AQP7的结构研究结果一致，NPA基序可以控制溶质选择性地进出。塔里木兔AQP7基因编码一种稳定且疏水性的蛋白，主要存在于质膜和内质网中。AQP7蛋白含有6个跨膜结构域，与人类AQP7蛋白结构具有一致性12，说明AQP7主要在质膜中发挥作用，因而其无信号肽序列。预测的塔里木兔AQP7蛋白三维结构序列同源性为 91.61%，建模置信度为100.0%，覆盖率为90%，其三维结构与家兔AQP7高度相似，该蛋白具有一般的折叠模式，其三维结构由李永乐 等：干旱沙漠生活的塔里木兔肾脏中水通道蛋白7的高表达31塔里木大学学报第35卷同源四聚体组成，具有典型的水通道蛋白结构。家兔和塔里木兔AQP7氨基酸序列比对分析，结果表明N-13位处的氨基酸在家兔和塔里木兔中分别为丝氨酸和半胱氨酸，N-316位处的氨基酸在家兔和塔里木兔中分别为天冬氨酸和丙氨酸。相关研究发现干旱条件下，蚯蚓体内丙氨酸的浓度增加，其身体保水能力增强，有助于蚯蚓适应干旱环境。在寒冷或干旱环境下，脯氨酸的积累可以提高果蝇对极端环境的适应性能力13。因此，塔里木兔体内的丙氨酸和脯氨酸浓度的增加可能有助于塔里木兔适应极端环境。综上所述，塔里木兔AQP7蛋白与家兔AQP7蛋白的结构具有一定的相似性，除此之外，蛋白基本理化性质分析和结构也为进一步探讨AQP7蛋白在塔里木兔肾脏中的功能作用提供一定的参考价值。结果表明，塔里木兔和家兔AQP7蛋白定位在肾脏近端小管曲部刷状缘的顶质膜和近端小管直部的顶质膜。NEJSUM L N等14发现在大鼠和小鼠肾脏中也有类似发现，即AQP7在近端小管曲部和直部中被检测到。研究发现，AQP7在近端小管中分布暗示了其可能参与近端小管水的重吸收15。此外，通过定量RT-PCR和Western blotting方法研究表明，AQP7在塔里木兔近端小管mRNA和蛋白质表达水平均高于家兔。ISHIBASHI K等16发现AQP7参与肾脏近端小管的细胞间的水转运，AQP7的上调表达会促进肾脏水重吸收，引起尿液浓度增大。在基因敲除小鼠实验中，AQP7基因敲除小鼠的肾脏近端小管对水分的重吸收能力低于野生型小鼠；相比于AQP1基因敲除小鼠，AQP1/AQP7双基因敲除小鼠肾近端小管的水重吸收能力弱17。以上研究表明AQP7的低表达或缺失可能会降低近端小管水重吸收的作用。耐旱能力强的山羊具有较高的尿浓度保存体内水分的能力，有助于适应干旱缺水的环境18。根据以上试验结果，推测塔里木兔肾脏的水重吸收能力相比于家兔更强，提高了肾脏水重吸收能力，并增加了塔里木兔对有限水资源的利用效率，使塔里木兔更加适应干旱缺水的环境。成年的AQP7基因敲除小鼠比成年的野生型小鼠体重增加更明显，易出现肥胖，这是由于细胞内甘油渗透性降低引起甘油含量增加以及甘油激酶活性增加，导致甘油三酯积累，引起小鼠肥胖19。在AQP7基因敲除小鼠试验中和人类肾脏研究中均发现AQP7缺失或低表达会增加尿液中甘油量。这表明AQP7的高表达促进肾脏中甘油的重吸收。与家兔相比，AQP7在塔里木兔肾脏中表达高，可能是由于 AQP7 的高表达增加了膜内甘油渗透性，促进甘油重吸收。此外，由于 AQP7 的高表达不易引起甘油三酯积累，塔里木兔不易出现肥胖，与塔里木兔体形较小这一现象相符。此外，VANDEHAAR M J等20发现在低温、食物资源短缺的地区，体型较小的动物能更好地维持自身的生理需求，适应极端环境。AQP7基因敲除小鼠实验中，AQP7促进甘油在细胞间质间的转运，心肌细胞中的甘油转化为丙酮酸，产生能量供应心脏21。这暗示了甘油是参与能量代谢维持机体内能量稳态的重要成员22。研究发现，在麻蝇和南极蠓中，甘油浓度的增加会降低水分损失率，并适应干旱环境23-24。以上实验研究表明，在塔里木兔的肾脏中，AQP7的高表达可能会促进甘油重吸收，参与能量代谢，降低失水率，从而提高塔里木兔对极端环境的适应性。4结论综上所述，AQP7的基因克隆和相关试验表明，AQP7 主要分布在塔里木兔肾脏近端直小管刷状缘，与家兔相比，AQP7 mRNA水平和蛋白水平在塔里木兔肾脏中表达量显著升高，AQP7 的高表达可能促进了塔里木兔的肾脏近端小管水的重吸收和甘油的渗透性，提高机体对水资源的利用和增加能量供应，有利于塔里木兔适应干旱缺水的极端环境。参考文献1 KUMAR B，CHENG J L，GE D，et alPhylogeographyand ecological niche modeling unravel the evolutionaryhistory of the Yarkand hare，Lepus yarkandensis(Mamma-lia：Leporidae)，through the Quaternary J/OLBMC，Evolutionary Biology，2019，19(1)2022-03-01.https:/pubmed.ncbi.n lm.ni h.gov/31153378DOI:10.1186/s12862-019-1426-z2 ABABAIKERI B，ZHANG Y C，DAI H Y，et alReveal-ing the coexistence of differentiation and communicationin an endemic hare，Lepus yarkandensis(Mammalia，Lep-oridae)using specific-length amplified fragment sequenc-ing J Frontiers in zoology，2021，18(1)：50-68.3 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