非小细胞肺癌潜在生物标志物的研究.pdf

目的对非小细胞肺癌(nonsmall-cell lung cancer,NSCLC)及癌旁组织差异表达微小 RNA(minimal RNA,miRNA)数据集进行分析,寻找有关键调控作用的 miRNA 及靶向信使 RNA(messenger RNA,mRNA),阐述目标 miRNA在非小细胞肺癌中发挥的生物学功能,为非小细胞肺癌提供早期诊断标志物。方法摇利用 GEO 数据库获得 NSCLC 癌组织与癌旁组织相关基因表达谱数据(GES102286)并对该数据集进行分析,获得差异性 miRNA 表达谱。对明显差异表达 miR鄄NA 进行靶向 mRNA 预测,通过基因本体(gene ontology,GO)、KEGG 信号通路富集及 String 蛋白互作分析靶向 mRNA 发挥的生物学功能。收集 2016 年 1 月至 2021 年 8 月 31 日锦州医科大学附属第三医院收治的 72 例 NSCLC 患者癌组织标本,选取正常肺组织标本 30 例作为对照组。使用免疫组织化学方法检测 NSCLC 组织中 PTEN 蛋白的表达,分析在 NSCLC 患者中 PTEN 表达水平与临床病理特征之间的关系。结果摇数据集 GSE102286 得到上调和下调基因各 6 个(|FC|1郾 5,P0郾 05),miR-486-5p 作为明显差异表达 miRNA 在癌旁组织中表达水平显著降低,下降倍数为 2郾 505。经 miRanda、Tar鄄getScan 及 encori 数据库对 miR-486-5p 进行靶向 mRNA 预测,发现 3 个数据库共存在 72 个交集靶向 mRNA。基因本体分析发现,靶向基因主要在调控细胞凋亡、直接转录因子结合、调控转录过程等方面发挥调控作用;KEGG 通路富集分析发现靶向基因主要参与非小细胞肺癌、mTOR 及 FOXO1 等信号通路;String 蛋白互作分析发现,PTEN、PIK3R1 作为蛋白调控网络中的枢纽基因在 mir-486-5p 的生物学功能中占主要地位。NSCLC 组织中 PTEN 阳性表达率较正常肺组织明显降低,差异具有统计学意义(P0郾 05)。PTEN 阳性表达通常伴随着较早的临床分期与未发生淋巴结转移,差异具有统计学意义(P1郾 5,P0郾 05),and miR-486-5p as obvious difference expression of miRNA expression level de鄄creased significantly in the tissue adjacent to carcinoma with drop ratio of 2郾 505.The target mRNA of miR-486-5p were predicted bymiRanda,TargetScan and encori databases,and 72 intersecting targeted mRNA were found in the three databases.Gene ontology a鄄nalysis showed that targeted genes mainly play a regulatory role in regulating apoptosis,direct transcription factor binding,and regula鄄67锦州医科大学学报J Jinzhou Medical University2023 Aug.44(4)ting transcription process;KEGG pathway enrichment analysis revealed that targeted genes were mainly involved in non-small cell lungcancer,mTOR and FOXO1 signaling pathways;String protein interaction analysis showed that PTEN and PIK3R1,as hub genes inthe protein regulatory network,played a major role in the biological functions of mir-486-5p.The positive expression rate of PTEN inNSCLC tissues was significantly lower than that in normal lung tissues,with statistical significance(P0郾 05).Positive expression ofPTEN was usually associated with early clinical stage and no lymph node metastasis,and the difference was statistically significant(P0郾 05).Conclusion摇 The expression of miR-486-5p was significantly reduced in NSCLC,and it may play an important role in thedevelopment of NSCLC by regulating PTEN,thus affecting the PI3K-AKT-MTOR pathway through some pathway and making it a val鄄id clinical marker for NSCLC.Key words:non-small cell lung cancer;bioinformatics;microRNA;PTEN摇 摇 肺癌是世界上常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率一直位于世界前列。非小细胞肺癌(NSCLC)作为肺癌最常见的类型,约占所有肺癌的 80%85%1。大多数NSCLC 患者发现时已处于中晚期,并且手术治疗的可创性特点加上患者术后复发率高,导致 NSCLC 五年生存率低。目前,随着化疗技术的不断进步和分子靶向治疗的应用,NSCLC 的治疗效果虽有提高,但整体效果仍不理想。有研究发现,NSCLC 的发生发展与细胞信号转导通路异常,抑癌与促癌基因的表达失衡及细胞周期蛋白表达异常密切相关2-3。但目前针对 NSCLC 的分子生物学研究尚不完善,所以通过寻找早期特异性诊断指标及有效判断预后的生物标志物对 NSCLC 发生发展的机制探讨有着重要的临床意义。本研究通过分析 NSCLC 癌与癌旁组织的微阵列芯片表达数据集进行差异分析,获得差异表达 miRNAs,通过生物信息学预测其靶向 mRNAs 所参与的生物学进程及信号转导通路,通过免疫组化实验对其特异性相关 mRNA 表达水平与 NSCLC 临床病理特征的影响进行分析,从分子层面阐述miRNA 在 NSCLC 发生发展过程中发挥的生物学功能及作用机制,对完善 NSCLC 分子作用机制提供了理论基础。1摇 资料与方法1郾 1摇 生物信息学预测分析1郾 1郾 1摇 GEO 数据库筛选差异表达 miRNAs从美国国家生物技术信息中心的 GEO 数据库进行芯片筛选(GES102286),芯片对非裔及欧洲裔美国人非小细胞肺癌组织及癌旁组织中的 miRNAs 表达水平进行了研究,共有癌组织样本 91 例及正常组织样本 88 例,对癌与癌旁差异表达基因进行分析、筛选。1郾 1郾 2摇 基因本体分析基因本体(GO)是基因本体联合会所建立的数据库,其中包括生物学的 3 个方面:生物学过程、细胞组成、分子功能。其将差异基因进行基因功能注释,而后利用卡方检验计算每个项目的显著性差异水平,以 P0郾 05 为差异有统计学意义。1郾 1郾 3摇 KEGG 信号通路富集分析KEGG 信号通路富集是根据系统性分析基因功能进行信号通路分析的数据库,计算 Pathway 的超几何分布关系,找出差异表达基因显著性富集的信号通路,以 P0郾 05 为差异有统计学意义。1郾 1郾 4摇 明显差异表达 miRNA 的靶向 mRNAs 预测使用 TargetScan7郾 2、miRanda 和 encori 数据库预测明显差异表达 miRNA 的靶向 mRNAs,对 3 个结果取交集后纳入后续研究。1郾 2摇 一般资料收集自 2016 年 1 月至 2021 年 8 月 31 日于锦州医科大学附属第三医院行肿瘤根治性切除术的原发性 NSCLC 患者组织标本作为研究对象。纳入标准:(1)符合原发性NSCLC 诊断标准;(2)临床资料完整;(3)受试者及家属签署知情同意书。排除标准:(1)合并其他恶性肿瘤及其他严重疾病;(2)有手术禁忌症无法进行手术;(3)无法配合检查,依从性差。共收集符合标准的原发性 NSCLC 患者 72 例,其中男 38 例、女 34 例;年龄60 岁 28 例,逸60岁 44 例;淋巴结转移 43 例,未转移 29 例;TNM 分期(I+II)期 35 例,III 期 37 例。1郾 3摇 方法1郾 3郾 1摇 免疫组织化学方法检测 NSCLC 及癌旁组织中 PTEN表达将收集到的 NSCLC 患者组织样本置于 10%甲醛溶液中经脱水后制成石蜡切片,经脱蜡,高压锅修复抗原,血清封闭,加入 PTEN 一抗(ab170941,英国 Abcam 公司,稀释倍数1 颐 150),置于37 益孵育1 2 h,滴加山羊抗兔 IgG聚合物,置于 37 益孵育 1 h,DAB 染色 1 3 min,后置入苏木素复染 3 5 min,经盐酸酒精分化后,脱水、透明、封片。1郾 3郾 2摇 阳性结果判定采用免疫反应积分(IRS)进行评分,IRS=阳性细胞百分比评分伊阳性细胞染色强度评分。阳性细胞百分比评分:无阳性细胞(0 分)、阳性细胞占比75%(4 分)。阳性细胞染色强度评分:无染色(0 分)、浅黄色(1 分)、棕黄色(2 分)、棕褐色(3 分)。以 IRS逸3 分为阳性,3 分为阴性。1郾 4摇 统计学方法应用 SPSS 21郾 0 软件对数据进行统计学分析,计数资料以例数(%)表示,两组间差异比较采用卡方检验;卡方检验分析 NSCLC 组织中 PTEN 表达水平与患者临床病理特征间的关系,以 P1郾 5 为明显差异表达 miRNA,共发现上调 miRNA 6 个、下调 miRNA 6 个,通过预测发现,相较77韩亮,等:非小细胞肺癌潜在生物标志物的研究于癌组织,miR-486-5p 在癌旁组织中明显下调,下调倍数为 2郾 505,其可能作为 NSCLC 最重要的 miRNA 影响其发生发展过程,见表 1、表 2。表 1摇 表达上调的差异 miRNAsmiRNA 名称差异倍数表达趋势P 值hsa-miR-962郾 389884上调2郾 64E-34hsa-miR-211郾 885356上调3郾 63E-23hsa-miR-1831郾 905451上调1郾 15E-12hsa-miR-1274a1郾 655036上调1郾 31E-12hsa-miR-193b1郾 581782上调1郾 55E-28hsa-miR-19791郾 568752上调2郾 00E-26表 2摇 表达下调的差异 miRNAsmiRNA 名称差异倍数表达趋势P 值hsa-miR-486-5p-2郾 625299下调6郾 10E-29hsa-miR-218-1郾 985982下调2郾 87E-18hsa-miR-126-1郾 795024下调1郾 83E-40hsa-miR-27b-1郾 738209下调7郾 33E-03hsa-miR-1-1郾 687982下调5郾 19E-10hsa-miR-30a-1郾 625315下调1郾 20E-262郾 2摇 miR-486-5p 的靶向 mRNA 预测为了探究 miR-486-5p 在 NSCLC 中发挥的生物学功能,采用 miRanda、TargetScan 7郾 2 及 encori 在线数据库预测 mir-486-5p 靶向基因,分别得到 174、331、2116 个结果,为了减少预测结果的假阳性率,将 3 个数据库预测结果取交集后共得到 72 个结果。说明 miR-486-5p 所发挥的生物学功能主要是通过该 72 个靶向基因实现的。2郾 3摇 基因功能分析对 72 个集合 mRNA 进行 GO 功能富集发现,这些基因主要参加调控细胞凋亡、维持蛋白质稳定、磷脂酰肌醇介导的信号传导、调控转录过程等生物学功能。参与这些生物学功能的靶基因主要有:PTEN、PIK3R1、IGF1、STK4等,见图 1。细胞组成主要包括:细胞间连接、粘附、细胞核、细胞 质 及 核 质 组 成。主 要 的 靶 基 因 有:PIK3R1、PTEN、STK4、AFF3(见图 2);分子功能主要富集于直接转录因子结合、直接蛋白结合等功能,主要的靶基因有:PIK3R1、STK4、SMAD2、PTEN、FOXO1,见图 3。2郾 4摇 KEGG 信号通路分析通过 KEGG 信号通路富集发现,miR-486-5p 靶向集合基因主要富集在 FOXO1 通路、癌症信号通路、非小细胞肺癌通路、mTOR 通路、p53 信号通路中等,主要富集靶基因有:FOXO1、PIK3R1、PTEN、SMAD2、IGF1、CDK4、STK4,见图 4。2郾 5摇 String 蛋白互作分析使用 string 在线数据库分析 mir-486-5p 靶向基因集合之间相互作用关系网络,发现集合基因调控网络关系网络中的枢纽基因是 FOXO1、PTEN、CDK4、PIK3R1、SMAD2。发现 PTEN、PIK3R1 在 mir-486-5p 的生物学功能中占主要地位(见图 5)。推测 mir-486-5p 在非小细胞肺癌中发挥调控功能的主要机制是通过调控 PTEN、PIK3R1 的表达,从而影响 PI3K-AKT-MTOR 通路。2郾 6摇 PTEN 在 NSCLC 组织及癌旁组织中的表达情况PTEN 主要表达于细胞质,见图 6。与癌旁组织相比,NSCLC 组织中 PTEN 蛋白阳性率显著降低(P0郾 05),见表 3。图 1摇 miR-486-5p 靶向基因生物学进程气泡图87锦州医科大学学报摇 2023 年 8 月,44(4)图 2摇 miR-486-5p 靶向基因细胞组成气泡图图 3摇 miR-486-5p 靶向基因分子功能气泡图图 4摇 miR-486-5p 靶向基因 KEGG 信号通路富集图图 5摇 miR-486-5p 集合靶向基因互作网络关系图A:癌旁组织;B:肺癌组织。图 6摇 PTEN 在非小细胞肺癌组织及癌旁组织中的阳性表达(200伊)2郾 7摇 PTEN 表达与 NSCLC 患者临床病理特征的关系NSCLC 患者 PTEN 表达与临床病理学资料之间的关系,见表4。免疫组化实验结果显示:NSCLC 组织中 PTEN 阳性表达 25 例,阴性表达 47 例。相较于 III 期或发生淋巴结转移的患者,PTEN 阳性率在(I+II)期或未发生淋巴结转移的患者群体中明显升高,差异具有统计学意义(P0郾 05)。表 3摇 PTEN 在结肠癌组织和正常结肠组织的表达TissuenPTENpositivenegativePNSCLC7225(34郾 70)47(65郾 30)normal lung3022(73郾 30)8(26郾 70)0郾 00197韩亮,等:非小细胞肺癌潜在生物标志物的研究表 4摇 PTEN 表达与 NSCLC 临床病理特征的关系n(%)临床病理特征nPTEN 阳性PTEN 阴性字2值P 值7225(34郾 70)47(65郾 30)年龄(岁)602811(39郾 30)17(60郾 70)逸604414(31郾 80)30(68郾 20)0郾 4210郾 516性别男3813(34郾 20)25(65郾 80)女3412(35郾 30)22(64郾 70)0郾 0090郾 923吸烟史有3210(31郾 25)22(68郾 75)无4015(37郾 50)25(62郾 50)0郾 3060郾 580淋巴结转移有439(20郾 90)34(79郾 10)无2916(55郾 20)13(44郾 80)8郾 9600郾 003*临床分期I+II 期3518(51郾 40)17(48郾 60)III 期377(18郾 90)30(81郾 10)8郾 3870郾 004*摇 注:*P0郾 05。3摇 讨摇 摇 论非小细胞肺癌作为一种多基因变化、多因素影响的疾病,其发生发展过程与多种因素相关,大多数患者由于发现较晚导致不能进行早期治疗从而使其五年生存率较低4-5。目前针对 NSCLC 的分子生物学研究发现,肿瘤的发生通常伴随癌基因的激活,抑癌基因的失活以及各种肿瘤相关因子的异常表达,导致其信号通路发生改变,从而加速了肿瘤的发展进程6-7。随着对 NSCLC 治疗方式的不断探索和精准医学的不断发展,针对相关靶向治疗和靶向药物的研究逐渐成为热点,对 NSCLC 发生发展过程中的分子生物学研究有利于完善 NSCLC 靶向治疗体系。miRNAs 作为一种短链非编码 RNA,主要作用是通过转录后识别靶向 mRNA,破坏靶 mRNA 的稳定性且抑制翻译功能,最终对基因表达发挥调控作用8。目前,已有大量研究证实 miRNA 在多种疾病和肿瘤中均扮演着重要角色。LIANG 等发现9,miR-196-5b 在 NSCLC 组织中表达明显上调,上调的 miR-196-5b 通过直接靶向肿瘤抑制因子 GA鄄TA6 和 TSPAN12 促进肺癌细胞的迁移、增值和细胞周期的改变。本研究通过分析 GEO 数据库中的数据集 GSE102286,并筛选差异表达的 miRNA,结果显示,在 NSCLC 癌组织与癌旁组织相比存在明显差异表达 miRNA12 个,其中上调miRNA6 个,下调 miRNA6 个,其中 miR-486-5p 作为明显差异表达 miRNA,证明 miR-486-5p 可能在 NSCLC 发生发展过程中起到重要作用。TIAN 等发现10,miR-486-5p 在NSCLC 组织、血清及细胞样本中显著下调,miR-486-5p 可通过调控 PIK3R1 有效调控 NSCLC 细胞的增值和侵袭能力,并且 miR-486-5p 的表达水平与 NSCLC 的临床表型密切相关,可能作为一种 NSCLC 诊断和预后的生物标志物。ZHANG 研究表明11,在大肠癌癌组织中 miR-486-5p 表达量明显降低,其生物学功能的发挥可能是通过 PIK3R1 抑制AKT 信号通路的激活实现的。在胰腺腺癌中同样发现 miR-486-5p 表达水平显著下降,且与胰腺腺癌患者的预后密切相关12。上述研究均提示 miR-486-5p 与肿瘤的发生发展关系密切,但 miR-486-5p 在 NSCLC 中的机制研究尚不完整,那么 miR-486-5p 在 NSCLC 中主要是通过何种途径实现其生物学功能的呢?本研究使用 miRanda、TargetScan 7郾 2 及 encori 这3 种数据库对 miR-486-5p 的靶向基因进行预测,结果发现,miR-486-5p 在 3 种数据库中共存在 72 个集合靶向基因。对这些靶向基因进行 GO 功能富集分析,发现其靶向基因主要参与调控细胞凋亡、调控转录过程、影响转录因子结合和细胞粘附等过程;KEGG 信号通路富集发现,这些集合基因主要通过影响 PI3K-AKT-MTOR、FOXO1 及非小细胞肺癌通路发挥生物学功能。最终通过 String 蛋白互作分析发现,集合基因调控网络关 系 中 的 枢 纽 基 因 是 FOXO1、PTEN、CDK4、PIK3R1、SMAD2。发现 PTEN、PIK3R1 在mir-486-5p 的生物学功能中占主要地位。最终本研究推测mir-486-5p 在非小细胞肺癌中发挥调控功能的主要机制是通过调控 PTEN、PIK3R1 的表达,从而影响 PI3K-AKT-MTOR 通路。目前已有相关研究证实 miR-486-5p 与PIK3R1 在 NSCLC 中的作用机制,DING 等的研究证明13,miR-486-5p 可 以 通 过 靶 向 核 糖 体 蛋 白 S6 激 酶 A1(RPS6KA1,RSK)和核糖体蛋白 S6 酶 B1(RPS6KB1,p70S6K)抑制 mTOR 通路抑制 NSCLC 的发生发展,证实本研究预测结果存在一定可信性。PTEN 作为一种有抑制活性的基因分子,参与各种疾病及癌症的研究,尤其在肺癌、乳腺癌中具有重要的临床参考价值。夏红蕾发现14,PTEN在浸润性乳腺癌组织中表达量明显降低,且与患者淋巴结转移、神经及脉管侵犯密切相关。莫俊贤等15研究表明,08锦州医科大学学报摇 2023 年 8 月,44(4)与癌旁组织相比,PTEN 在肺腺癌组织中的阳性表达率明显降低,并且 PTEN 的阳性表达率随着临床分期的升高而降低。而目前针对 miR-486-5p 与 PTEN 的研究较少,仅在胰岛素抵抗通路中发现过表达 miR-486-5p 后可通过调控PTEN、FOXO1 等靶基因对胰岛素通路起到抑制作用16。本研究结果表明 NSCLC 组织中 PTEN 阳性表达率明显低于正常肺组织;与 III 期或发生淋巴结转移的 NSCLC 患者样本相比,(I+II)期患者或未发生淋巴结转移的患者样本中,PTEN 表达率明显升高,此结果与张媛媛研究结果一致17。提示在 NSCLC 中 miR-486-5p 可能通过调控 PTEN发挥其调控因子的作用。但本研究尚未针对 miR-486-5p与 PTEN 间的具体作用机制进行研究,具体机制有待后续进一步研究。综上所述,本研究利用生物信息学技术对 NSCLC 的差异表达 miRNA 进行了筛选,对其生物学功能及信号通路进行预测,并对 miR-486-5p 预测出具有枢纽功能的 PIK3R1及 PTEN,最终收集临床数据,采用免疫组化实验验证了PTEN 在 NSCLC 患者样本中的表达及与临床病理特征的关系。为后期实验针对 miR-486-5p 与 PTEN 及 PIK3R1 在NSCLC 中的具体作用机制研究提供了数据和基础。然而本研究仅在 NSCLC 肿瘤样本中对 PTEN 蛋白的表达进行了研究,尚未在细胞水平验证 PTEN 在 NSCLC 细胞系中所产生的生物学作用,下一步应临床与细胞实验相结合在扩大病例数的同时使用细胞实验针对 miR-486-5p 在 NSCLC 细胞系中的表达,以及对 miR-486-5p 与 PTEN 的作用机制进行探讨,为 NSCLC 的靶向治疗提供实验依据。参考文献:1 摇 LIU J C,NARVA S,ZHOU K,et al.A review on the antitu鄄mor activity of various nitrogenous-based heterocyclic compoundsas NSCLC Inhibitors J.Mini Rev Med Chem,2019,19(18):1517-1530.2 摇 CHEN Z,FILLMORE C M,HAMMERMAN P S,et al.Non-small-cell lung cancers:a heterogeneous set of diseases J.Nat Rev Cancer,2014,14(8):535-546.3 摇 张玉辉,高亚坤,肖连波,等.RHCG 基因在非小细胞肺癌中的表达及对细胞增值的影响 J.基因组学与应用生物学,2020,39(1):278-282.4 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