反流性疾病与微生物关系的研究进展.pdf

基金项目:山西省基础研究计划自然科学基金项目(20210302123250);山西医科大学博士启动基金资助项目(03201628);山西医科大学第一医院 136 专项经费科研项目第一作者简介:刘晨阳,住院医师,研究方向:反流性食管炎。E-mail:lcyy96 通讯作者:龚龙岗,主任医师,研究方向:耳鼻咽喉头颈外科整形修复。E-mail:xahhglg doi:10.3969/j.issn.1006-5709.2023.08.016反流性疾病与微生物关系的研究进展刘晨阳1,龚龙岗1,李育军2,张森21.西安交通大学附属红会医院耳鼻咽喉头颈外科,陕西 西安 710000;2.山西医科大学第一医院耳鼻咽喉头颈外科【摘要】微生物是在人类健康平衡中发挥作用的重要因素之一,它们与某些疾病的关系已被明确界定。然而,微生物与反流性疾病之间的关系尚不清楚,微生物对反流性疾病的发病率和预后的影响却不容忽视。因此,本文系统、全面地总结了与反流性疾病相关的微生物生态失调的流行病学研究,并讨论了它们之间的差异,认为微生物可能改变反流性疾病的风险和结局,并且可能是新的治疗靶点。【关键词】反流性疾病;胃食管反流病;咽喉反流性疾病;微生物中图分类号:R57文献标识码:A文章编号:1006-5709(2023)08-0919-04收稿日期:2022-08-11Advances in the relationship between reflux diseases and microorganismsLIU Chenyang1,GONG Longgang1,LI Yujun2,ZHANG Sen21.Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery,HongHui Hospital,Xian Jiaotong University,Xian 710000;2.Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery,the First Hospital of Shanxi Medical University,China【Abstract】Microorganisms are one of the important factors in human health balance,and their relationship to certain diseases has been clearly defined.However,the relationship between microorganisms and reflux disease is still unclear,and the impact of microorganisms on the incidence and prognosis of reflux disease cannot be ignored.Therefore,this pa-per summarized the epidemiological studies of microbial dysbiosis associated with reflux disease and discussed the differ-ences between them,systematically and comprehensively suggesting that microorganisms may alter the risk and outcome of reflux disease and may be novel therapeutic targets.【Key words】Reflux disease;Gastroesophageal reflux disease;Laryngopharyngeal reflux disease;Microorganisms反流性疾病包括胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)和咽喉反流性疾病(laryngopha-ryngeal reflux disease,LPRD),属 于 功 能 性 胃 肠 病(functional gastrointestinal disease,FGID),主要症状有烧心、反酸、胸痛、咽喉不适、哮喘及咳嗽等。因其发病机制不明,症状复杂多样,给该病的诊断和治疗带来很多困惑,亟待发现有效预防反流性疾病的新方法,以补充其在饮食、减重和药物方面的防治。人体含有大量微生物,主要分布在消化道、呼吸道、皮肤和生殖道1。此外,人体微生物群,也被称为“隐形器官”,携带的遗传信息是人类基因组的 150 多倍2。这些微生物可以与宿主交换能量,传递信息,通过对宿主提供营养、免疫、生长刺激和生物拮抗,对人类健康起着至关重要的作用3。近年来有关反流性疾病的流行病学研究指出微生物菌群是潜在的致病因素4。因此,识别反流性疾病中复杂的微生物菌群及二者之间关系非常必要。1反流性疾病与微生物 1.1GERD 与微生物GERD 是指胃、十二指肠内容物逆流进入食管引发的以烧心、反流为典型症状的慢性疾病,同时可伴有胸痛、咽喉不适、哮喘及咳嗽等食管外症 状。目 前 GERD 主 要 分 为 非 糜 烂 性 反 流 病(nonerosive reflux disease,NERD)、反流性食管炎(reflux esophagitis,RE)和 Barrett 食 管(Barrett s esophagus,BE)三大临床类型。GERD 在世界范围内广泛流行,我国人群的 GERD 患病率高达 7.69%5。该病易反复发作,不仅影响患者的身心健康和生活质量,也给社会带来巨大的经济和医疗负担,其治疗是目前临床工作的难点和挑战。然而,GERD 是一种多因素参与的疾病,其发病机制尚不完全清楚。1.1.1GERD 与口腔微生物:口腔是微生物最复杂的生物环境之一,唾液和牙周袋中的微生物菌群不仅影响各类口腔疾病的发展,还与全身性疾病的风险和结局密切相关6。He 等7研究发现,GERD 患者唾液的微生物群落结构与非 GERD 患者相比有所不同,韦荣氏球菌属、纤毛菌属和放线菌属在 GERD 患者的唾液样本中的相对丰度显著升高,这些菌群通过产生有机酸改变口腔环境的 pH 值进而导致牙釉质退化和龋齿发生。此外,研究8发现口腔中 H.pylori 的丰度与919胃肠病学和肝病学杂志2023 年 8 月第 32 卷第 8 期Chin J Gastroenterol Hepatol,Aug 2023,Vol.32,No.8GERD 的发生呈正相关。因此,口腔微生物可作为新的治疗靶点来改变各种食管疾病的风险和结局。1.1.2GERD 与食管微生物:食管黏膜是人体微生物定植的场所之一,微生物组成十分复杂。Yang 等9研究发现链球菌是正常食管微生物群的主要组成部分,同时发现食管微环境变化与胃食管反流病密切有关。日本一项研究10调查正常食管人群及 RE 和 BE 患者食管远端的细菌组成,发现三组的微生物菌群在门和属两个水平上均存在差异。此外,研究11表明,对于食管远端的标本中,BE 患者的细菌丰度更高,这与Macfarlane 等12的研究结论一致。在此基础上,Gall等13发现链球菌和普氏菌在 BE 患者上消化道丰度更高,二者比例因人及解剖部位的不同而异。高峰等14证实奥美拉唑治疗 RE 前后食管中段螺杆菌属丰度值降低,而食管下段黏膜中的乳杆菌科、乳杆菌属、双歧杆菌属、螺杆菌属丰度值均明显高于治疗前,这与 肖 晓 阳15的 研 究 结 论 一 致。然 而,Ashktorab等16研究显示,H.pylori 可促进 GERD 患者的食管蠕动、升高食管下括约肌(low esophageal sphincter,LES)压力,减 少 食 管 酸 暴 露,因 此 H.pylori 感 染 可 能 对GERD 的发生、发展有保护作用。此外,冯欣宇17探讨了 GERD 的严重程度与食管黏膜菌群结构变化,结果表明:-变形菌纲丰度与 GERD 的严重程度呈正相关。1.1.3GERD 与胃肠道微生物:由于胃酸的分泌,胃内有着独特的生态环境和微生物群落。研究18显示,GERD 患者和健康人在胃黏膜和肠道中的微生物菌群具有显著性差异,与健康人群相比,GERD 患者的菌群丰度更高。此外,研究19发现在食管炎和 BE 患者的胃液中埃希菌属的丰度升高,同时发现拥有正常食管组织的 GERD 患者与食管炎或 BE 患者相比,胃反流物的微生物菌群是不同的。H.pylori 是胃内一种重要的病原 体,有 流 行 病 学 研 究 显 示 H.pylori 感 染 在GERD 患者中比健康人群更为少见20。有研究21表明 H.pylori 与 GERD 呈负相关。对于 H.pylori 感染对GERD 是否具有保护作用仍有较大争议。具体而言,有研究22认为与 H.pylori 在胃内分布部位相关,胃窦胃炎患者的 GERD 发生风险随胃酸分泌增加而增加,而胃体胃炎伴萎缩的患者则有较低的 GERD 发生风险。然而并非所有患者均受到胃酸分泌变化的影响,因为 GERD 是一种多因素参与的疾病。然而,Parson-net23进行的一项随机对照试验发现 H.pylori 不会影响 GERD 症状的发生。研究24认为人类疾病的根源在于肠道菌群失调或微生物代谢产物转移至远处器官。动物实验25显示,高脂饮食与食管发育不良、肠道微生物菌群改变、食管组织中中性粒细胞与自然杀伤细胞的比例增加相关。由此可见,肠道微生态可能对 GERD 的发病过程有影响。韩士举等26研究发现,GERD 患者肠道中链球菌科、链球菌属、欧陆森氏菌属、霍尔德曼氏菌属的丰度升高。此外,GERD 患者肠道脱硫杆状菌、嗜盐菌目、鞘脂杆菌等微生物丰度较高,而乳杆菌、消化链球菌丰度较低,此外,GERD 患者 IL-4、IL-1、TNF-水平明显升高27。1.2LPRD 与微生物LPRD 是指胃内容物反流入食管括约肌以上部位引起的一系列症状和体征。常表现出各种症状,如声音嘶哑、声音疲劳、喉咙烧灼感、持续咳嗽、喉咙痛、吞咽困难、喉咙肿块感和慢性清嗓,其主要基于质子泵抑制剂药物、生活方式和饮食调整。流行病学调查显示,我国三级甲等医院耳鼻咽喉头颈外科门诊成人 LPRD 的潜在发病率高达 10.15%28。因其发病机制不明,症状复杂多样,体征无特异性,缺乏诊断的金标准,给该病的诊断和治疗带来很多困惑,亟待进行深入的研究。咽喉部的微生态失衡可以引起感染和炎症,而胃内容物反流入咽喉和口腔可进一步加重患者咽喉部菌群失调程度29;研究30发现,炎症可以使喉-食管上括约肌和咽-食管括约肌感受器功能下降,从而诱发LPRD,因此咽部微生物状态与 LPRD 的发生和发展密切相关。Chen 等31对 LPRD 患者和正常人喉部分泌物进行对照试验,发现在 LPRD 患者的分泌物中,普氏杆菌的丰度升高(P0.01),而梭杆菌、卟啉单胞菌的丰度降低(P0.01)。此外,研究发现 LPRD 患者咽喉部微生物菌群以革兰阴性菌为主,革兰阳性菌检出数下降。具体而言,LPRD 患者咽喉部微生物菌群丰富度较健康人群下降,以及 LPRD 患者链球菌属、葡萄球菌属丰度降低。这与庄森洪32的研究结果一致。在对 LPRD 患者肠道菌群的研究中,崔小缓等33发现,LPRD 患者较正常人肠道菌群丰度和多样性均无明显改变,然而,对两组肠道微生物菌群结构比较发现显著差异菌,放线菌、红蝽菌、链球菌、瘤胃球菌、柯斯氏菌、普雷沃氏菌、梭状杆菌、乳杆菌在 LPRD 患者中占比相对较高,而假单胞菌、生丝微菌、假单胞菌、海洋杆菌、假单胞菌占比相 对较低。提示这 些 优 势 菌 可 能 在LPRD 发生和发展中起作用。2微生物影响反流性疾病的可能机制微生物群对反流性疾病的影响已被充分研究,根据反流性疾病的发病机制主要分为两个方面:(1)食管括约肌松弛:胃内容物需通过贲门到达食管,并通过松弛的食管上括约肌进入咽喉部,引起组织损伤;(2)迷走神经反射:迷走神经通过微生物-脑-肠轴感知菌群的变化,并向中枢神经系统传递信息33。2.1食管括约肌松弛微生物紊乱可以促进食管括约肌松弛,从而使胃内容物通过松弛的食管括约肌进入食管或咽喉部引起组织的损伤。Yang 等9通过聚类分析将食管远端微生物分为两型,分别命名为型029胃肠病学和肝病学杂志2023 年 8 月第 32 卷第 8 期Chin J Gastroenterol Hepatol,Aug 2023,Vol.32,No.8菌群和型菌群,推断型菌群与异常的食管黏膜组织具有显著关联,并由此提出两种假说:一是假定每个个体均有稳定的型或型微生物群,而型中占优势的革兰阴性菌可产生 LPS,此物质可以通过激活诱导型 一 氧 化 氮 合 酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)途径引起 LES 异常松弛,已知 LES 异常松弛是GERD 的病理生理基础之一,由此推断型微生物群也许是 GERD 的致病因素;另一种假定食管微生物群是暂时性的,以链球菌为主的型微生物群代表正常口腔菌群通过吞咽的唾液延伸至食管,型微生物群是胃反流引起的继发性改变。此研究表明食管的炎症和肠化生与食管远端微生物群的改变有关。与此相反,乳酸杆菌和双歧杆菌可以通过对人体微生态产生有益的影响。首先它们可以发挥营养作用,如参与多种维生素、氨基酸和酶的合成,其次它们能增加黏膜的屏障功能,这主要通过其具有免疫调节特性来保护宿主免受异常炎症和感染。因此,各种疾病的益生茵制剂广泛采用乳杆菌和双歧杆菌15。此外,研究15还显示 GERD 患者食管中 H.pylori 的比例增加,H.pylori促进食管蠕动、增加 LES 压力、减少食管酸暴露。因此,H.pylori 感 染 可 以 预 防 GERD 的 发 生 和 发 展H.pylori 感染可以,与此同时还可以保护食管黏膜,这主要通过刺激贲门和胃末端的迷走神经受体,提高血清胃泌素的分泌量,进而增加 LES 压力,降低胃酸反应和胃内容物来实现。因此,综上所述,RE 疗效与食管下段菌群的改变密切相关。2.2迷走神经反射脑-肠轴是一个双向的神经通路,主要由胃肠道与支配其活动的神经中枢之间形成,然而,在脑-肠轴与肠道菌群之间还存在着密切的双向联系,构成了微生物-脑-肠轴。在迷走神经中,有80%的传入神经纤维,分布于胃肠道各个部位,向中枢神经系统传递胃肠道的各种变化,在微生物和大脑沟通中起重要的作用26。研究34显示,迷走神经功能在 LPRD 患者普遍降低,相反交感神经则功能更为亢进,然而,肠道菌群是否通过微生物-脑-肠轴影响自主神经功能、引起胃肠动力异常与 LPRD 的发病相关,目前尚不清楚。有研究35发现 TLR4 信号传导通路是一种重要的炎性通路。以革兰阴性菌为代表的肠道内的部分微生物细菌通过产生 LPS 来激活 TLR4,进而诱导 IL-18 的产生,最终启动 IL 和肿瘤坏死因子的级联反应,促进炎症的发生并导致内脏高敏36。Hoyles 等37发现,在 LPRD 患者的肠道中瘤胃球菌属的丰度更高,且其代谢产物可以作用于迷走神经传入纤维的 TLR4 进而调节大脑,并进而通过来自迷走神经传出纤维来调节食管、胃肠道,最终在 LPRD 发病中起作用。放线菌门是目前公认的主要谱系中最大的分类学单位之一,研究显示放线菌在 LPRD 患者肠道中丰度更高,增加迷走神经传入纤维的 TLR 表达,使得其对肠道菌群的炎性代谢产物更加敏感,首先通过传入中枢神经系统,刺激乙酰胆碱的大量释放,使迷走神经的传出神经活性增强,进而通过激活胆碱能抗炎通路抑制炎症反应,其次部分放线菌也可合成胆碱酯酶抑制剂,从而具有拟胆碱样作用,同样能使迷走神经的传出神经活性增强,与此同时,大量增加的乙酰胆碱激活 N 受体38,阻止了自主神经节突触间的信息传递,使得迷走神经功能下降,因此使得食管括约肌、食管体部甚至胃肠道动力改变,促进了 LPRD 发生。除此之外,研究39显示神经系统参与炎症的调节,这主要通过胆碱能抗炎通路实现,具体而言,炎症信号被迷走神经传入中枢,最终通过中枢神经系统的整合而释放的乙酰胆碱与炎症细胞表面的 7 亚基 N 型胆碱能受体(7 nicotinic acetylcholine receptors,7nACHR)结合,最终调控炎症反应。与此同时,Ihalin 等40研究显示放线菌可以诱导 TLR2 和 TLR4 表达的增加,这主要是通过其中的肽聚糖相关脂蛋白实现的。3微生物检测方法微生物基因组测序的金标准是培养特异性菌株和提取 DNA 序列41。获得高质量的微生物基因组 DNA是在复杂微生物群落中进行宏基因组学研究的基础和困难,它结合了从微生物群落中直接提取 DNA 和每个微生物基因组序列的硅质重建。在宏基因组方法中,基因组重建分两个步骤进行:(1)将片段基因组序列组装成连续序列;(2)组装成谱系作为基因库,最先进的结合剂依赖于核苷酸组成信息,如四核苷酸频率、核苷酸 G 和核苷酸 C 含量或序列覆盖物42。16S rDNA 与 16S rRNA 基因测序等非培养方法因其独特的优势在微生物学领域得到了广泛的应用。16S rDNA 测序中 DNA 的获取与质检:粪便样本采用化学裂解法裂解细胞膜及细胞核膜,提取 DNA,以样本提取的 DNA 为模板,PCR 扩增 16S rDNA 基因的V4V5 区域;全部 PCR 产物回收、定量,均一化混匀后完 成 文 库 构 建,进 而 在 平 台 上 完 成 测 序43。16S rRNA 基因是原核生物核糖体 RNA 的一个亚基,存在于细菌中,但不存在于真菌和病毒中。16S rRNA基因序列由保守区域和可变区域组成,其中保守区域揭示生物物种之间的关系,而可变区域反映生物特异性核酸序列44。作为细菌分子鉴定的基础,16S rRNA基因测序已被广泛应用于头颈部鳞状细胞癌与微生物群落关系的研究中。4结论和展望本文总结了微生物与反流性疾病的流行病学研究,并讨论了它们之间的差异,表明与微生物相关的炎症变化是反流性疾病起病和发展的一个重要作用。同样,细菌的变化也可能是反流性疾病引起周围环境变化的反应。尽管关于反流性疾病与微生物相关的证据越来越多,但种族、饮食模式、生活习惯、地理环境等因129胃肠病学和肝病学杂志2023 年 8 月第 32 卷第 8 期Chin J Gastroenterol Hepatol,Aug 2023,Vol.32,No.8素在这些研究中很少被考虑。在未来的研究中,应考虑相关因素对微生物区系变化的影响是暂时的还是永久的。此外,反流性疾病患者的样本部位、对照组的取材、样本量的大小和样本在处理过程中是否被污染,这些均需要被进一步考虑,也是将来需要深入研究的方向。参考文献1 Schippa S,Conte MP.Dysbiotic 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