黄姑鱼转录因子激活蛋白AP2α的克隆和特征分析.pdf

第 44 卷 第 5 期 渔 业 科 学 进 展 Vol.44,No.5 2 0 2 3 年1 0 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Oct.,2023 *蓝色粮仓国家重点研发计划(2018YFD0900301)、福建省自然科学基金(2022J01325)、福建省新世纪人才支持计划(B18223)和 福 建 省 海 洋 渔 业 资 源 与 生 态 环 境 重 点 实 验 室 开 放 研 究 基 金(Z822280)共 同 资 助。李 佳 程，E-mail:ljc_ 通信作者：韩 芳，教授，E-mail: 收稿日期:2022-07-26，收修改稿日期:2022-09-02 DOI:10.19663/j.issn2095-9869.20220726001 http:/ AP2 的克隆和特征分析.渔业科学进展,2023,44(5):104114 LI J C,GOU T,XIAO Y,LUO S,WU B L,WANG Z Y,HAN F.cDNA cloning and characterization of transcription factor activating protein AP2 from yellow drum,Nibea albiflora.Progress in Fishery Sciences,2023,44(5):104114 黄姑鱼转录因子激活蛋白AP2的克隆和特征分析*李佳程 苟 涛 肖 遥 罗 帅 吴宝兰 王志勇 韩 芳(集美大学水产学院 福建省海洋渔业资源与生态环境重点实验室 农业农村部东海海水健康养殖重点实验室 福建 厦门 361021)摘要 转录因子激活蛋白 AP2 是一类能特异地结合 DNA 的核转录因子，参与动物胚胎发育的调节、细胞生长、细胞凋亡、肿瘤发生以及免疫反应等多种生物过程。课题组前期通过基因组关联分析(GWAS)发现，AP2 是黄姑鱼(Nibea albiflora)抗哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的候选基因。本研究克隆了黄姑鱼转录因子 AP2，其开放阅读框(ORF)为 1 275 bp，编码 424 个氨基酸；所编码的AP2 蛋白质 N 端是富含脯氨酸和谷氨酰胺(P/Q-rich domain)的反式激活结构域，中间是中心基本结构(central basic region)，C 端为高度保守的 helix-span-helix 基序，负责结合 DNA 和蛋白质二聚化。氨基酸序列多重比对表明，AP2 保守性强，与所检测的鱼类、两栖类、鸟类和哺乳动物同源性在84.63%以上。实时荧光定量PCR检测结果显示，AP2基因的mRNA广泛分布于所检测的黄姑鱼9 种组织样品中，其中血液中的表达量最高；受哈维氏弧菌攻毒感染后，肝脏、脾脏和头肾中 AP2 表达量均明显升高，特别是在肝脏中，AP2 mRNA 表达水平在 24 h 时达到攻毒前的 39 倍。通过构建重组真核表达质粒 pGEFP-AP2 并转染 HEK293T 细胞进行亚细胞定位研究的结果显示，AP2分布于 HEK293T 细胞的细胞核中。进一步通过原核克隆表达获得了可溶性的 GST-AP2 融合蛋白。以上结果表明，AP2 在黄姑鱼抵御哈维氏弧菌感染过程中发挥重要作用。本研究对 AP2 在硬骨鱼类先天免疫中的重要功能提供了新的见解，为深入研究黄姑鱼的分子免疫机理和抗病分子育种奠定了基础。关键词 黄姑鱼；转录因子激活蛋白 AP2；哈维氏弧菌；实时荧光定量 PCR；亚细胞定位；蛋白表达 中图分类号 S917.4 文献标识码 A 文章编号 2095-9869(2023)05-0104-11 转 录 因 子 激 活 蛋 白 2(transcriptional factor activating protein 2,TFAP2)又称激活蛋白 AP2，是一类分子量为 4652 kDa 核转录因子，有物种细胞类型特异性，能特异地结合 DNA，通过结合多种基因的启动子特定位点，参与基因的转录调控，在组织形态发育、细胞生长、分化、凋亡和肿瘤发生以及免疫反应中具有重要作用(Hoffman et al,2007)。很多肿瘤的重要病理特征为特定转录因子的异常高表达，如乳腺癌中锌指蛋白转录因子高表达(吕昌新等,2013)，上皮癌细胞中转录因子 Snail 高表达(Wakahashi et al,第 5 期 李佳程等:黄姑鱼转录因子激活蛋白 AP2 的克隆和特征分析 105 2013)。乳腺癌 HER-2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)基因的表达与转录因子 AP2 的表达量增高相关(Berlato et al,2011)。抑制转录因子AP2 的表达，可以促进乳腺癌细胞的凋亡及对放疗及化疗的敏感性(Thewes et al,2010)。HER-2 的启动子上具有 AP2 结合位点，AP2 是通过与结合癌基因 HER-2 的启动子结合并促进其转录而导致癌变(Hung et al,2012)，免疫组化证实人乳腺癌组织中AP2表达上调，并与 HER-2表达呈正相关(Powe et al,2009)。此外，AP2 参与乳腺癌黑色素瘤、前列腺癌和大肠癌等癌变过程(Berlato et al,2011)。黄姑鱼(Nibea albiflora)是一种具有重要经济价值的海水鱼类，在我国东南沿海地区(如浙江和福建省)广受欢迎(Liu et al,2020;Xiang et al,2020)，并有较大的养殖规模。近几年来，黄姑鱼养殖遭受细菌病的严重困扰，造成很高的死亡率，特别是由哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)引起的“红头病”造成了严重的经济损失(Xiang et al,2020;Yin et al,2018)。哈维氏弧菌是一种革兰氏阴性菌，在海水养殖产业中引发了多种细菌性疾病(沈桂明等,2017)。因此，本实验室用哈维氏弧菌对黄姑鱼进行了人工攻毒实验，并对实验鱼群体进行全基因组重测序挖掘单核苷酸多态性(SNP)分子标记，以攻毒后正常存活时间作为抗病力的表型值进行全基因组关联分析(GWAS)，结果显示，黄姑鱼转录因子 AP2 基因位于定位区间中(Luo et al,2021)。然而，目前尚无转录因子 Ap2 基因参与鱼类抗病免疫过程的相关研究报道。本研究从黄姑鱼中克隆到 AP2 基因，分析其分子结构特征，利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测其在健康组织和哈维氏弧菌感染后不同组织的表达情况，并研究 AP2 蛋白的亚细胞定位，进行蛋白质原核克隆和诱导表达，旨在阐明黄姑鱼AP2基因在黄姑鱼抵御哈维氏弧菌过程中的作用，并为深入研究黄姑鱼抗病分子机制奠定基础。1 材料与方法 1.1 实验材料 实 验 所 用 黄 姑 鱼 幼 鱼(3.281.71)g,(4.56 1.39)cm,3 月龄取自福建省宁德市金铃水产科技有限公司。攻毒前，所有幼鱼在充气海水中驯养 1 周，水温保持在(27.12.1)，盐度 30，水深 1.0 m。每天在固定时间(07:00 和 18:00)饲喂 2 次市售的黄姑鱼配合饲料(天马水产科技有限公司)。攻毒实验所用哈维氏弧菌菌株分离于自然发病鱼，由集美大学水产学院孙云章教授惠赠。1.2 主要试剂 Trans Zol Up Plus RNA kit 购于北京全式金生物技 术 有 限 公 司；GoScript Reverse Transcription System Protocol 购于 Promega 公司；琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒和无内毒素质粒小量提取试剂盒购自北京天漠科技开发有限公司；ClonExpress One Step Cloning Kit 和 ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；Lipo8000 转 染 试 剂、GFP Rabbit Monoclonal Antibody、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG(H+L)、DAPI、BeyoColor 彩 色 预 染 蛋 白 Marker(15 120 kDa)、SDS-PAGE蛋 白 上 样 缓 冲 液(5)、BeyoBlue考马斯亮蓝快速染色液、EGFP 抗体和GST 抗体和 BeyoECL Plus 化学发光试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；胎牛血清(FBS)购于 Gibco公司；PBS(pH=7.4)缓冲液、胰蛋白酶消化液(0.25%胰酶和 0.02%EDTA)和 DMEM High Glucose 购于 BI公司；双抗(青霉素 10 000 IU/mL链霉素 10 mg/mL)购于 MP 公司；本研究所用引物均在厦门铂瑞生物科技有限公司合成。1.3 样本采集 攻毒前，采集用于组织表达分析的 6 尾正常黄姑鱼的器官或组织(包括心脏、肾脏、肝脏、皮肤、鳃、胃、脾脏、肠和血)，存于 RNA 保护液中，随后80 冰箱保存，用于 RNA 提取。哈维氏弧菌感染实验采用浸泡感染的方法进行：在一个面积为 4 m2、深度为 1.5 m 的混凝土水池中，将 8 L 细菌悬浮液(109 CFU/mL)均匀泼洒到池水中，不间断充气，使其与受试幼鱼充分接触，细菌感染过程持续 3 h，之后，将所有幼鱼转移到一个新的洁净海水的水泥池中；攻毒水池用次氯酸钠消毒。分别在哈维氏弧菌感染黄姑鱼后 0、6、12、24、48、72 和96 h 采集黄姑鱼各 6 尾，采集头肾、肝脏和脾，置于RNA 保护液中，随后保存在80 的冰箱中，用于RNA 提取。动物实验操作遵循集美大学水产学院动物伦理委员会的要求进行。1.4 RNA 提取及 cDNA 的合成 按照说明书步骤，使用Trans Zol Up Plus RNA kit对组织样品进行 RNA 提取并使用 GoScript Reverse Transcription System Protocol 逆转录合成 cDNA 的第一条链，黄姑鱼内参基因-actin 用于 cDNA 合成质量的检测。106 渔 业 科 学 进 展 第 44 卷 1.5 黄姑鱼 AP2 开放阅读框序列的克隆和载体构建 从本实验室构建的黄姑鱼转录组数据库中获得AP2 的开放阅读框序列。根据 ClonExpress One Step Cloning Kit 设计了具有 Xho和 EcoR限制性位点的特异性引物(表 1)。PCR 的步骤：95，3 min预变性；30 个循环(95 变性 15 s，58 退火 15 s，72 延伸 1 min 30 s)，72 彻底延伸 5 min。将纯化 后的 AP2 产物分别连接到 pEGFP-N1 载体和pGEX-6P-1 载体上(本实验室保存)，并转化至大肠杆菌(Escherichia coli)DH5 中，抗性平板筛选阳性克隆并进行菌液 PCR 鉴定，然后送厦门铂瑞生物科技有限公司测序。其中，重组质粒 pEGFP-N1-AP2 用于转染人胚胎肾细胞 293T(HEK 293T)进行亚细胞定位，pGEX-6P-1-AP2 用于原核表达蛋白质。表 1 黄姑鱼 AP2 基因克隆、RT-qPCR 及亚细胞定位所用的引物序列 Tab.1 Primers used for the cloning,RT-qPCR and subcellular localization of AP2 gene in the study 引物Primer 引物序列 Primer sequence(53)用途 Usage q-AP2-F GTGTCTTTATCCAAGAACAACAAC q-AP2-R GCGTCTCTGCACCTCCGCCACCTG-actin-F TTATGAAGGCTATGCCCTGCC-actin-R TGAAGGAGTAGCCACGCTCTGT RT-qPCR pEGFP-AP2-F CTACCGGACTCAGATCTCGAGATGTTAGTGCACAGTTTTTCCG pEGFP-AP2-R GTACCGTCGACTGCAGAATTCCTTTCTTGCTTCTCGTCTTTGTC 亚细胞定位 Subcellular localization pGEX-6P-1-AP2-F CCCCTGGGATCCCCGGAATTCATGTTAGTGCACAGTTTTTCCG pGEX-6P-1-AP2-R GTCACGATGCGGCCGCTCGAGCTTTCTTGCTTCTCGTCTTTGTC 原核表达 Prokaryotic expression 注：EcoR(GAATTC)和 Xho(CTCGAG)的酶切位点用下划线标注。Note:EcoRenzyme restriction site(GAATTC)and Xhoenzyme restriction site(CTCGAG)are underlined.1.6 生物信息学分析 使用 ExPASy-Translate(https:/web.expasy.org/translate/)对编码的氨基酸序列进行推导；扩增出的序列与推导的氨基酸序列经 NCBI 在线 Blast(https:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)与其他物种进行相似性比对；不同物种 SPHK1 氨基酸序列在 NCBI 数据库中搜索获得，并利用 ClustalW(https:/www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/;https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/)对其进行同源性比对；黄姑鱼与其他物种的 AP2 蛋白系统发育进化树使用 MEGA v6.06 的最大似然法(ML)进行构建；蛋白质的理化性质，包括理论分子量、理论等电点和氨基酸组成等使用 ExPASy-ProtParam(https:/web.expasy.org/protparam/)进行分析(张志华等,2022)；蛋白中的结构域、信号肽切割位点和跨膜区域，分别使用 SMART(http:/smart.embl-heidelberg.de)、SignalP(http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和TMHMM(http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)进行预测；亚细胞定位预测在 TargetP(http:/www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)中进行；磷酸化位点预测在NetPhos(http:/www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)中进行；使用 SWISS-MODEL(https:/swissmodel.expasy.org/)和 tFold(https:/ VMD 1.9.2(https:/www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/vmd-1.9.2)进行蛋白三级结构可视化。1.7 RT-qPCR 设计黄姑鱼 AP2 特异性引物 q-AP2-F 和q-AP2-R，选择-actin(引物为-actin-F/-actin-R，表 1)为内参基因，以稀释 80 倍的 cDNA 为模板进行RT-qPCR。使用 StepOne Plus 荧光定量 PCR 仪，按照荧光定量染料 ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 说明书进行，反应体系(20 L)：2 ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 L；正向、反向引物各 0.5 L；cDNA 模板 4 L；ddH2O 5.0 L。反应程序：95 预变性 30 s；95 变性 10 s，60 退火 30 s，72 延伸 30 s，循环 40 次；最后为熔解曲线步骤(95 15 s，60 60 s，95 15 s)。每个样品设置 3 个生物学重复。采用 2Ct法结合 SPSS 20.0中 的 单 因 素 方 差 分 析(one-way ANOVA)及 LSD Multiple Comparison Test 进行基因差异表达分析，P0.05 为差异显著。1.8 细胞培养及黄姑鱼 AP2 的亚细胞定位和Western blot 将构建成功的真核表达质粒 pEGFP-YdSPHK1转染至人胚胎肾细胞 293T(HEK 293T)中进行亚细胞第 5 期 李佳程等:黄姑鱼转录因子激活蛋白 AP2 的克隆和特征分析 107 定位，同时转染 pEGFP-N1 作为阴性对照。HEK 293T细胞接种到 12 孔板中，培养基为含有 10%FBS 和 1%双抗的 DMEM，5%CO2，37 恒温培养 24 h 之后，使用 Lipo8000转染试剂进行转染。转染 24 h 后，收集细胞进行 Western blot 验证以检测黄姑鱼 AP2在 HEK 293T 细胞中表达。步骤如下：先用细胞裂解缓冲液裂解，制备蛋白样品，蛋白质样品通过 12%SDS-PAGE 分离，然后转移到 PVDF 膜上；将膜用含有 5%胎牛血清白蛋白的 TBST 缓冲液在室温下封闭孵育 2 h，然后转移到 GFP 一抗稀释液中 4 过夜；用 TBST 洗涤 5 次(每次 5 min)，将膜与二抗稀释液一起孵育 2 h，然后用 TBST 洗涤 7 次(每次 5 min)。膜用 BeyoECL Plus 化学发光试剂盒检测，用 Image Quant LAS 4000(GE Healthcare)拍照。同时，用 4%的多聚甲醛固定细胞，0.2%的Triton X-100透化细胞，最后用 0.2%的 DAPI 进行细胞核染色。使用共焦荧光显微镜 Leica TCS SP8 系统(Leica,德国)观察绿色荧光蛋白在细胞中的分布。1.9 黄姑鱼 GST-AP2 重组蛋白诱导表达和检测 将测序正确的重组质粒(pGEX-6P-1-AP2)转化至大肠杆菌 BL21(DE3)中，在含氨苄青霉素(100 g/mL)的 LB 培养基中，37、200 r/min 振荡培养至 OD600 nm为 0.6。加入异丙基-D-硫代半苷(IPTG)至终浓度0.25 mmol/L，37 继续振荡培养 6 h。菌液 5 000 r/min离心 5 min，收集菌体。冰浴条件下超声裂解细菌，裂解液为含 1%Triton X-100 的冰冷 PBS，超声时间为 10 s，间隔时间为 10 s，功率为 200 W，超声直至菌液清亮。4 下 15 000 r/min 离心 20 min，收集上清液(含 GST-AP2 融合蛋白)。样品分别与 2SDS 上样缓冲液混合，煮沸 5 min，12%SDS-PAGE 凝胶电泳，同时设转化空载体的大肠杆菌 BL21 进行对照，电泳结束后，用 0.025%考马斯亮蓝 R250 进行显色观察。同 时，对 转 化 pGEX-6P-1 空 载 体 的 菌 和pGEX-6P-1-AP2重组载体的菌进行SDS-PAGE电泳分离，电转至 PVDF 膜，利用 GST 抗体进行 Western blot检测以验证AP2蛋白表达，Western Blot的方法同1.8。2 结果 2.1 黄姑鱼 AP2 基因序列分析 AP-2 基因在基因组上由 7 个外显子组成(图 1)，本研究克隆到 AP2 的基因开放阅读框(ORF)为1 275 bp，编码 424 个氨基酸(图 3)。软件预测该蛋白的理论分子量为 46.43 kDa，理论等电点(pI)为 8.57。预测得到的 AP2 蛋白结构与 AP2 蛋白家族的共有结构类似，在 N 端为反式激活结构域，在中部为中心基本结构及在 C 端高度保守的 helix-span-helix 基序(图 2)。SignaIP-5.0 Server 预测黄姑鱼 AP2 不含信号肽。NCBI 蛋白保守结构域的预测显示，黄姑鱼 AP2基因上的 AP2 超家族保守结构域位于 197392 aa，黄姑鱼 AP2 蛋白的三级结构预测如图 4 所示。图 1 黄姑鱼 AP2 的基因组结构 Fig.1 Genome structure of AP2 in N.albiflora 图 2 黄姑鱼 AP-2 的蛋白结构分析 Fig.2 Protein structures analysis of AP2 in N.albiflora 2.2 AP2 氨基酸同源性和系统进化关系分析 将黄姑鱼 AP2 的氨基酸序列与选取的 16 个其他物种的 AP2 的氨基酸序列比对后，发现其与其他物种的 AP2 蛋白的氨基酸序列同源性在 80%以上(表 2)。值得注意的是，黄姑鱼 AP2 蛋白与同属于石首鱼科(Sciaenidae)的大黄鱼(Larimichthys crocea)的同源性高达 100%。选取鱼类、哺乳类、鸟类和两栖类中的代表物种，对它们的 AP2 蛋白的氨基酸序 108 渔 业 科 学 进 展 第 44 卷 图 3 黄姑鱼 AP2 开放阅读框(ORF)序列和预测的氨基酸序列 Fig.3 Predicted amino acid sequence and the ORF sequence of AP2 gene 起始密码子和终止密码子加粗表示。AP2 超家族保守结构域使用灰色阴影突出显示。绿色框表示丝氨酸(Ser)磷酸化位点，蓝色框表示苏氨酸(Thr)磷酸化位点，黄色框表示酪氨酸(Tyr)磷酸化位点。The start codon and the stop codon are shown in bold.The AP2 superfamily conserved domain is highlighted with a grey shadow.The green boxes indicate serine(Ser)phosphorylation sites,the blue boxes indicate threonine(Thr)phosphorylation sites,and yellow boxes indicate tyrosine(Tyr)phosphorylation sites.第 5 期 李佳程等:黄姑鱼转录因子激活蛋白 AP2 的克隆和特征分析 109 图 4 黄姑鱼 AP2 蛋白三级结构预测 Fig.4 Tertiary structure of AP2 from N.albiflora 表 2 AP2 系统发育进化树及序列多重比对 所用的氨基酸序列 Tab.2 Amino acid sequences used in multiple sequence alignment and phylogenetic analysis of AP-2 物种 Species 相似度Identity/%GenBank Accession No.黄姑鱼 Nibea albiflora 100.00 大黄鱼 Larimichthys crocea 100.00 XP_010734454.1 金头鲷 Sparus aurata 99.53 XP_030254741.1 龙胆石斑鱼 Epinephelus lanceolatus 98.82 XP_033494531.1 日本青鳉 Oryzias latipes 98.11 XP_004081017.1 半滑舌鳎 Cynoglossus semilaevis 97.88 XP_008305748.1 大菱鲆 Scophthalmus maximus 97.83 XP_035475313.1 海水青鳉 Oryzias melastigma 97.41 XP_024135759.1 狭鳞庸鲽 Hippoglossus stenolepis 96.93 XP_034999004.1 红鳍东方鲀 Takifugu rubripes 96.63 XP_003967954.1 大马哈鱼 Oncorhynchus keta 96.14 XP_035612558.1 金鱼 Carassius auratus 95.29 XP_026056606.1 斑马鱼 Danio rerio 95.06 NP_001306088.1 褐家鼠 Rattus norvegicus 86.81 NP_001100815.1 小鼠 Mus musculus 86.52 XP_006516965.1 黑天鹅 Cygnus atratus 86.05 XP_035416161.1 人 Homo sapiens 85.82 NP_001358995.1 家马 Equus caballus 84.95 XP_023480207.1 非洲爪蟾 Xenopus tropicalis 84.87 NP_001032335.1 家鸡 Gallus gallus 84.63 NP_990425.1 列进行多重比对，结果如图 5 所示，各物种 AP2 蛋白中的 3 个重要的结构域相对较保守。系统进化分析结果显示，黄姑鱼 AP2 在进化关系上与其他鱼类聚为一支；哺乳类、鸟类和两栖类各自聚为一支(图 6)。2.3 黄姑鱼 AP2 的组织表达谱及对哈维氏弧菌免疫刺激后的表达谱变化 如图 7A 所示，黄姑鱼 AP2 基因在所检测的黄姑鱼的 9 个组织或器官(皮肤、肝、心脏、鳃、肾脏、肠、脾脏、血液和胃)中均有表达，属于广谱型表达，但在不同组织中的表达量具有显著差异。其中，在血液和鳃中表达量最高，其次为肝脏、心脏和皮肤，而肾脏中表达量最低。经哈维氏弧菌浸泡攻毒后，黄姑鱼头肾、脾脏和肝脏中的AP2基因的mRNA表达水平随着时间的延长而呈现不同的变化趋势(图 7B)。肝脏中，攻毒前后AP2 表达量变化最大，攻毒后 12 h 开始上调，在 24 h达到最高水平，是攻毒前的 39 倍(P0.05)，此后逐渐下降至攻毒前的 9.5 倍(48 h)2.1 倍(96 h)(P0.05)。头肾中，攻毒后 48 h 上调至攻毒前的 3.5 倍(P0.05)，其他时间点的表达量与攻毒前差异不显著；脾脏中，攻毒后 6 h 后 AP2 的表达量就上调，12 h 达到高峰，为攻毒前的 3.4 倍，24 h 恢复至 6 h 的水平，48 h 后表达量低于攻毒前的水平。2.4 黄姑鱼 AP2 的亚细胞定位 Western blot表明pEGFP-AP2蛋白在HEK 293T细胞中成功表达，在 70 kDa 以上出现一条非常明显的蛋白条带(AP2 蛋白预测大小为 46.43 kDa，EGFP蛋白预测大小为 26 kDa)，与实际大小一致(图 8A)。AP2 蛋白的亚细胞定位结果显示，pEGFP-AP2 蛋白仅在细胞核中有分布，而对照 pEGFP-N1 在细胞核及细胞质均有分布(图 8B)。2.5 黄姑鱼AP2融合蛋白原核诱导表达和Western blot 验证 将重组菌株 pGEX-6P-1-AP2 转化大肠杆菌BL21(DE3)，经 IPTG 诱导后在 70 kDa 以上出现一条非常明显的蛋白条带，而在表达载体 pGEX-6P-1 诱导和不诱导及重组质粒不诱导的对照中皆看不出此带，此带的大小与 AP-2 蛋白(46.43 kDa)及与其融合的 GST 蛋白的分子量(26 kDa)之和相符，说明此基因插入表达载体 pGEX-6P-1 后在大肠杆菌中获得了高效表达。超声波破碎菌，高速离心后将菌液上清液经 110 渔 业 科 学 进 展 第 44 卷 图 5 黄姑鱼 AP2 的氨基酸序列的多重比对 Fig.5 Multiple sequence alignment of AP2 in N.albiflora 图 6 不同物种的 AP2 氨基酸序列的 ML 系统发育进化树 Fig.6 Phylogenetic tree based on Maximum-Likelihood(ML)method of AP2 protein in different species 节点处数字为 Bootstrap 检验设置重复取样 1 000 次计算出的自展值；标尺(0.02)代表遗传距离；所用的 AP2 蛋白氨基酸序列的 GenBank 登录号信息见表 2。The numbers at the nodes indicate the bootstrap confidence values of 1 000 replicates;The scale bar(0.02)indicates the genetic distance;The GenBank accession numbers of amino acid sequences used are listed in Tab.2.第 5 期 李佳程等:黄姑鱼转录因子激活蛋白 AP2 的克隆和特征分析 111 图 7 黄姑鱼 AP2 组织表达谱及哈维氏弧菌攻毒后头肾、肝脏和脾脏中表达谱变化 Fig.7 Expression profiles of AP2 in tissues and the relative mRNA expressions in head-kidney,liver and spleen post V.harveyi challenging A：AP2 在健康黄姑鱼不同组织中的相对表达量；B：哈维氏弧菌攻毒后 AP2 基因的 mRNA 在头肾、肝脏和脾脏 组织中的相对表达量。*表示组织基因表达量与其他组织相比达到显著水平，*表示组织基因表达量与其他组织相比 达到极显著水平。不同字母表示 AP2 基因在不同组织表达量存在显著性差异。A:Tissue profiles of AP2 expression in healthy yellow drum;B:Relative mRNA expressions of AP2 in head-kidney,liver and spleen after V.harveyi infection.*means that the gene expression level of the tissue has reached a significant level compared with other tissues,and*means that the gene expression level of the tissue has reached a high significant level compared with other tissues.Different letters represent the significant difference of the AP2 gene expression among these tissues.图 8 黄姑鱼 AP2 的亚细胞定位 Fig.8 The subcellular localization of AP2 A：Western blot 检测 EGFP-AP2 蛋白(72.43 kDa)与对照 EGFP(26 kDa)；B：共聚焦荧光显微镜下观察到 EGFP-AP2 蛋白在 HEK 293T 细胞中定位于细胞核 A:Western blot of EGFP-AP2 protein(72.43 kDa)compared with control EGFP(26 kDa);B:Subcellular localization of EGFP-AP2 protein in HEK 293T cells was found in cytoplasm observed under the confocal fluorescence microscopy SDS-PAGE 分析(图 9A)。Western blot 显示，pGEX-6P-1-AP2 蛋白在 HEK 293T 细胞中成功表达，在 70 kDa以上出现一条非常明显的蛋白条带(AP2 蛋白预测大小为 46.43 kDa，GST 蛋白预测大小为 26 kDa)，与其实际大小一致(72.43 kDa)(图 9B)，表明表达的GST-AP2 融合蛋白在菌体里为可溶性表达。112 渔 业 科 学 进 展 第 44 卷 图 9 SDS-PAGE 分析 AP2 融合蛋白的表达(A)和 Western blot 验证(B)Fig.9 Expression analysis of the recombinant AP2 fusion protein by SDS-PAGE(A)and verification by Western blot(B)3 讨论 在人类和小鼠中发现转录因子激活蛋白 AP2 家族由 AP2、AP2、AP2、AP2 和 AP2 组成，在硬骨鱼中存在 AP2、AP2、AP2 和 AP2 的直系同源基因。AP2 发现最早，通常以二聚体形式结合到GC 含量丰富的 DNA 元件上，特异性调控基因表达，参与脊椎动物生长发育、细胞增殖分化、细胞凋亡、免疫反应和抑癌作用等(毕杨等,2011)。黄姑鱼 AP2蛋白由 7 个外显子编码，这与所有哺乳动物 AP2 蛋白均由 7 个外显子编码一致。AP2 家族的所有成员中共有 3 个保守的结构域，在 N 端(H2N)是富含脯氨酸和谷氨酰胺(P/Q-rich domain)的反式激活结构域，其后是一个中心基本结构及在 C 端(COOH)高度保守的 helix-span-helix 基序，负责结合 DNA 和蛋白质二聚化。大多数 AP2 蛋白在反式激活结构域中有一个PY 基序(XPPXY)和其他高度保守的关键残基。AP2证实能与回文序列 5-GCCN3GGC-3及其相似变体GCCN4GGC、GCCN3/4GGG 等结合，在不同的细胞和病毒中可以行使增强剂的作用，可以促进一些基因和蛋白的表达(Pirone et al,2019)。序列同源比对显示，鱼类和哺乳动物 Ap2 蛋白在进化上高度保守，黄姑鱼 AP2 与斑马鱼(Danio rerio)AP2 蛋白具有 95.06%的相似性，与人类(Homo sapiens)AP2 蛋白具有 85.82%的相似性(图 6、表 2)。从鱼类到哺乳类选取了代表性物种的 AP2 蛋白的氨基酸序列构建了系统进化树，其结果与传统的分类结果基本一致，黄姑鱼 AP2 与其他鱼类的 AP2 聚为一支，以哺乳类、鸟类和两栖类为单位选取的其他物种的 AP2 各自形成一个分支。有趣的是，黄姑鱼AP2 与大黄鱼 AP2 序列同源性高达 100%，在分类地位上，大黄鱼与黄姑鱼同隶属于石首鱼科。本研究中，AP2 在黄姑鱼的各组织、器官中广泛表达，这与该基因在人和鼠等的组织中广谱型表达模式一致(Pirone et al,2019;Guo et al,2016)，说明AP2 参与生命活动的多种过程，并发挥重要作用。受到哈维氏弧菌感染后，Ap2 基因在黄姑鱼头肾、肝脏和脾脏 3 种主要免疫器官中的表达量均显著上调，特别是肝脏中 AP2 mRNA 表达量在攻毒后 24 h升高到攻毒前的 39 倍，表明 AP2 基因参与了黄姑鱼抵御哈维氏弧菌的抗病免疫过程。敲除小鼠的AP2 基因，可导致其神经管、面部、眼和四肢的胚胎形成受到影响而发育畸形甚至死亡(SulkaIa et al,2002)，说明 AP2 参与生物免疫、发育等多种生命过程。在人类牙齿釉质形成的研究中，转录因子 AP2通过与基质金属蛋白酶 20(matrix metalloproteinase-20,Mmp-20)基因的启动子进行结合和相互作用，调控MMP-20 的表达水平，牙齿特异表达的基质金属蛋白酶 MMP-20 主要在成釉细胞分泌期降解釉质蛋白。分析发现，Mmp-20 基因启动子区含有 AP2 结合位点，AP2 可以通过结合到 Mmp-20 基因启动子区域来影响 Mmp-20 基因的转录水平，从而影响釉质形成。借助小鼠成釉细胞，转染 AP2 基因的 siRNA 后，成釉细胞中 Mmp-20 mRNA 的表达水平显著上调(赵娜等,2012)。在脂肪生成过程中，AP2 通过直接与 DNA 甲基转移酶 3a(Dnmt3a)近端启动子区域结合，转录