氟化钠通过氧化应激和内质网应激途径诱导PC12细胞凋亡.pdf

基金项目：国家自然科学基金资助项目（）；陕西省青年科技新星项目（）；中央高校基本科研业务费资助项目（）作者简介：戴姗姗，女，生，硕士，主治医师，：收稿日期：氟化钠通过氧化应激和内质网应激途径诱导 细胞凋亡戴姗姗，李锦沂，杨克宇，李征阳，刘飞，（西安交通大学口腔医院，陕西省颅颌面精准医学研究重点实验室，西安 ；西安交通大学口腔医院儿童口腔科；西安市儿童医院儿童口腔科；通讯作者，：）摘要：目的探讨氟化钠对 细胞凋亡的影响及机制。方法采用，浓度梯度的氟化钠培养基分别培养 细胞 ，。通过 法检测细胞活力，筛选构建氟中毒 细胞模型所需采用的氟化钠浓度和作用时间。将 ，氟化钠溶液培养 的 细胞进行 双染流式细胞术验证细胞凋亡状况；生化方法检测细胞内超氧化物歧化酶（）以及丙二醛（）的表达水平；及 检测内质网应激标志物葡萄糖调节蛋白 （，）的 及蛋白表达水平。结果，氟化钠分别作用 细胞 ，细胞活力与氟化钠成剂量依赖性降低，差异具有统计学意义（）。显微镜下观察细胞形态和流式细胞术验证了细胞凋亡率与氟化钠浓度呈剂量依赖性增加，差异具有统计学意义（）。与 氟化钠相比，氟化钠作用下细胞内 水平降低，而 的水平增加（均 ）；的 及蛋白表达水平增加（）。结论氟化钠可通过细胞氧化应激及内质网应激介导细胞凋亡通路，诱导 细胞凋亡。关键词：氟化钠；细胞；氧化应激；内质网应激；细胞凋亡中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：，（，；，；，；，：）：（），（）（），（），（）（），（），（）：；氟是自然界普遍存在的一种化学元素，对人体骨骼和牙齿的发育至关重要。人体主要通过饮用地下水、空气、食物等途径摄取氟元素 。长期摄入过量的氟化物引起的慢性氟中毒不仅可损害骨相系统，也损害非骨相系统。近年来越来越多的研究报道慢性氟中毒可致神经系统发育障碍，表现为记忆力减退、学习困难，影响儿童智力发育和智商评分等 ，。本课题组前期研究表明长期过量摄入氟化钠会诱发小鼠认知障碍和焦虑抑郁样行为，降低基础疼痛阈值，但氟化物引起神经毒性的机制尚未明确 ，。氧化应激是氟化物引起细胞损伤的机制之一，过量氟增加了细胞内活性氧基团（）的产生，并山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期最终诱导了细胞凋亡 ，。细胞凋亡的主要通路包括线粒体介导的细胞凋亡、内质网应激介导的细胞凋亡和死亡受体介导的细胞凋亡通路 。当细胞受到外界刺激或者病理状态下细胞内质网腔中未折叠或者错误折叠的蛋白产生增多并引起内质网应激，持续性的内质网应激将通过激活下游细胞凋亡相关信号分子导致细胞凋亡 ，。等 和 等 的研究结果观察到氟化钠会诱导细胞内质网结构的改变。但内质网应激是否参与氟化物引起的神经毒性，目前尚未见相关研究报道。因此本研究提出如下科学假说：氟化钠通过氧化应激及内质网应激诱导神经细胞凋亡，可能是氟化物造成神经的毒性的潜在机制之一。在本研究中以类神经元 细胞（大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞）为研究对象，构建神经细胞的氟中毒模型 ，观察氧化应激标志物及内质网应激标志物的变化，探讨氧化应激及内质网应激的发生与过量氟化物诱导的细胞凋亡之间的关系。材料和方法 细胞株及主要试剂 细胞系（大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞）购自武汉普诺赛生命科技有限公司（货号：）。氟化钠（天力化学试剂有限公司，中国），培养基、特级胎牛血清 （，美国），胰蛋白酶、青链霉素混合液和 凋亡检测试剂（北京索莱宝科技有限公司，中国），试剂盒、蛋白浓度试剂盒（博士德生物工程有限公司，中国），总超氧化物歧化酶测定试剂盒（法）（南京建成科技有限公司，中国），丙二醛测定试剂盒（法）、细胞裂解液 、蛋白酶抑制剂 （碧云天生物技术有限公司，中国），总 提取试剂、试剂盒、反转录试剂盒（，日本），兔源 抗体、兔源 抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体（上海翊圣生物科技有限公司，中国）。细胞的培养在 、条件下 细胞接种于 培养基（培养基构成体积比：、青链霉素双抗溶液、）中培养，细胞单层贴壁长至 时弃原培养基，漂洗 次，胰蛋白酶消化后进行传代，以 细胞浓度接种于孔板、细胞浓度接种于 孔板后显微镜下观察氟化物浓度为 ，培养 后的细胞形态。氟化钠作用于 细胞的时间及浓度筛选 孔板每孔接种 个细胞，培养 ，换为含不同浓度氟化钠（，）的培养基，继续培养，每组 个复孔，分别于不同的培养时间（，）更换为 孔无血清培养基，加 孔 溶液培养 于酶标仪测定 处各孔的吸光度（值），采用 法检测细胞的活力，筛选出氟化钠作用 细胞的时间。将不同浓度氟化钠（，）培养基按照筛选出的时间培养 细胞，弃原始培养基，更换为 孔无血清培养基，加 孔 溶液培养 于酶标仪测定 处各孔的 值，采用 法观察同一时间不同浓度氟化钠对 细胞活力的影响。细胞活力（实验孔 值 空白孔 值）（对照孔 值 空白孔 值）。流式细胞术检测细胞凋亡情况收集 孔板内经过 ，的氟化钠培养液培养 的 细胞，预冷 洗涤次，用 悬浮细胞，离心 ，弃上清，再用 重悬细胞，取 细胞悬液加入 管，加 室温避光 ，加 室温避光孵育 ，加 混匀，内用流式细胞仪检测。细胞内氧化应激标志物的检测孔板接种 细胞培养 ，换为 ，的氟化钠培养液继续培养 ，弃上清，漂洗后加胰蛋白酶消化，离心 。在细胞沉淀中加入 ，冰水浴状态下，超声功率为 ，每 超声 次，每次间隔 ，重复 次。将得到的细胞匀浆使用 法测定蛋白浓度，根据 及 检测试剂盒要求配制检测体系，酶标仪测定各孔吸光度，以此计算各组 及 水平。检测 的表达水平孔板接种 细胞培养 ，换为 ，的氟化钠培养液继续培养 ，弃上清，漂洗 次，每孔加 ，按照说明书操作步骤提取总 ，用逆转录试剂盒将 逆转录为 ，采用 ，试剂盒通过 进行 反应，预变性阶段温度为 反应时间为 ；反应阶段为 反应时间设为；反应时间设为 ，进行 个循环后停止。收集各组反应的 值并计算 值，进行相对定量分析。引物序列见表 。表 引物序列 名称引物序列引物大小（）：检测 蛋白表达水平收集 ，氟化钠处理 的 细胞，提取总蛋白并进行蛋白定量，聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、脱脂牛奶封闭 ，孵育 一抗抗体（兔源 抗体，抗体浓度为 ，含 的 溶液稀释）过夜。室温孵育二抗（辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体，抗体浓度为 ，含 的 溶液稀释），洗膜 次，加 显色液，计算机发光分析系统分析 的表达情况。统计学分析实验数据由 软件统计和分析，计量资料以平均值 标准误表示。采用 单因素方差分析和 事后检验进行组间差异性分析，为差异具有统计学意义。结果 氟化钠作用于 细胞的时间及浓度筛选结果显示，在 时，细胞活力有所上升，表明在这一阶段未表现出明显的细胞毒性。不同浓度氟化钠处理细胞 ，高浓度氟化钠（，）处理组细胞活力降低至 以下（见图 ）。不同浓度氟化钠处理细胞 ，细胞活力与氟化钠呈剂量依赖性降低。与 氟化钠相比，氟化钠处理后细胞活力差异无统计学意义（），氟化钠处理后细胞活力均降低，差异有统计学意义（，见图 ）。不同处理时间下各浓度氟化钠组细胞活力变化与 氟化钠相比，不同浓度氟化钠处理细胞 对细胞活力的影响图 不同浓度氟化钠处理不同时间对 细胞活力的影响 氟化钠对 细胞形态的影响对照组细胞形态良好，呈长梭形，有较多长突起，细胞数目较多，排列密集；氟化钠处理后细胞发生皱缩，突起变短，数目减少，排列稀疏；氟化钠处理后细胞皱缩明显，细胞突起几乎消失，数目最少，细胞散在排列，出现较多死细胞（见图 ）。氟化钠对 细胞发生凋亡的影响 双染流式细胞术结果显示，氟化钠作用于 细胞 ，随着氟化钠浓度的增加，细胞的凋亡率逐渐增高（，见图 ）。山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期图 不同浓度氟处理 细胞 对细胞形态的影响 与 氟化钠相比，图 不同浓度氟处理 细胞 细胞凋亡率的变化 氟化钠对 细胞氧化应激的影响与 氟化钠相比，氟化钠处理后细胞内 的含量降低，的含量增高，差异均有统计学意义（，见图 ）。与 相比，图 不同浓度氟处理 细胞 细胞内 、含量的变化 氟化钠对 细胞 相对 表达的影响 结果显示，随着氟化钠浓度的增加，的相对 表达水平显著增加（，见图 ）。氟化钠对 细胞 蛋白表达的影响 结果显示随着氟化钠浓度的增加，的相对蛋白表达水平显著增加（，见图 ）。，与 相比，图 不同浓度氟处理 细胞 相对 的表达水平 与 相比，图 不同浓度氟处理 细胞 相对蛋白表达水平 讨论地方性氟中毒指人们长期摄入过量氟化物所致的慢性蓄积性中毒，主要包括饮水型地方性氟中毒、燃煤污染型地方性氟中毒和饮茶型地方性氟中毒。我国是世界上地方性氟中毒病情较为严重的国家之一。慢性氟中毒的损害主要包括骨骼、牙齿等骨相系统的损伤，还包括肝、肾以及神经系统等非骨相系统的损伤。目前关于氟所致神经系统损伤的机制尚不十分清楚，因此本研究通过构建 类神经元细胞氟中毒模型 ，探讨氧化应激及内质网应激在过量氟诱导 细胞凋亡中的作用及机制。本研究采用 法检测氟对 细胞活力影响，结果显示 阶段未表现出明显细胞毒性，在 阶段，细胞活力与氟化钠呈时间剂量依赖性降低。并且在 时，氟化钠组细胞活力大幅度降低，大部分细胞发生凋亡，这与 等 的研究结果类似，因此选择氟化钠处理 细胞 进行后续实验。半数抑制浓度（）通常用来反映药效的定量指标，判断药物对细胞可能产生的影响，为进一步做毒性研究提供参考。通过 软件计算得氟化钠处理细胞 时，为 ，故在后续实验中分别选择 和 分别作为氟化钠浓度梯度处理。氟的化学性质活泼，具有较强的氧化性，可诱导细胞内活性氧集团产生增多，过量的活性氧集团可诱导细胞内氧化应激的发生 ，。当发生氧化应激时细胞的结构和功能受损，发生脂质过氧化反应等导致 含量增加，抗氧化物如 等被大量消耗而含量降低 。本研究中检测了 和 的含量，结果表明氟化钠处理 细胞 ，细胞内 的含量降低，的含量增加，这与 等 和 等 的研究结果相类似，说明氟化钠诱导 细胞发生了氧化应激。越来越多的研究表明氧化应激参与氟诱导的细胞凋亡 ，。本研究通过 双染流式细胞术证实 和 的氟化钠均显著增加了细胞凋亡率。内质网应激介导的细胞凋亡通路是重要的细胞凋亡通路之一。等 和 等 的研究表明氟可通过内质网应激途径诱导成骨和成釉细胞凋亡。等 的研究表明氟可通过内质网应激途径诱导大鼠肝脏细胞凋亡。但目前较少有关于氟通过内质网应激途径诱导神经元细胞凋亡的报道。生理状态下内质网伴侣分子 与位于内质网膜上的 个信号转导分子 、结合处于失活状态。当发生内质网应激时，与这 个信号转导分子解离并分别激活其下游的信号通路发生未折叠蛋白反应，抑制进入内质网腔中的蛋白山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期的合成，促进内质网腔中错误折叠蛋白的降解从而缓解细胞内质网应激状态，调节细胞存活。持续的内质网应激使得未折叠蛋白反应的调节功能不足时，内质网膜上的 个信号转导分子将激活其下游与凋亡相关的信号分子 促进细胞凋亡 ，。本实验通过 及 检测了内质网应激标志物 的 和蛋白的表达状况。本研究中与 组相比，和 组 的 和蛋白表达水平显著性升高，这表明氟化钠诱导 细胞凋亡的过程中发生了内质网应激。氟化物神经毒性发病机制复杂，本研究采用单一细胞模型或不能完全模拟实际病理生理机制，仅得出氟化钠可通过内质网应激介导 细胞损伤。应用内质网应激抑制剂后是否能够逆转细胞损伤，发挥细胞保护作用以及更加深入的分子信号通路还需后续实验进一步探究。参考文献：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，：毕翻，万珑，温建霞，等 氟对仔鼠生长发育、学习记忆及血清氧化应激水平的影响 中华地方病学杂志，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，