电针促进应激性溃疡小鼠胃黏膜损伤修复的实验研究.pdf

2023 年第 57 卷第9 期 Shanghai J Tradit Chin Med，Vol.57，No.9，Sept.2023 上海中医药杂志电针促进应激性溃疡小鼠胃黏膜损伤修复的实验研究高浩1，雍玥2，吴晓珲1，陈文婷11.上海中医药大学附属曙光医院麻醉科（上海 201203）；2.上海中医药大学附属曙光医院针麻研究所（上海 201203）【摘要】目的观察电针对应激性溃疡小鼠胃黏膜损伤修复的促进作用，探讨电针的修复作用与促进修复因子释放及上调低氧诱导因子-1（HIF-1）表达水平的相关性。方法雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组（Sham组）、模型组（CRS组）及模型+电针组（CRS+EA组），每组9只。除Sham组外，CRS组、CRS+EA组通过3 d冷束缚应激制备应激性溃疡模型（CRS模型），造模3 d后进行电针干预，CRS+EA组电针“足三里”穴和“梁丘”穴，时间为15 min，上、下午各1次，持续2 d。实验开始后第6天小鼠全胃取材，评估胃黏膜溃疡指数（UI）评分，实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）和免疫印迹（Western blot）法测定修复因子 包括三叶因子2（TFF2）、血管内皮生长因子（VEGF）、热休克蛋白70（HSP70）以及调控因子低氧诱导因子-1（HIF-1）表达水平。结果与Sham组比较，CRS组、CRS+EA组UI评分显著升高（P0.05）；与CRS组比较，CRS+EA组UI评分显著下降（P0.05）。与Sham组比较，CRS组VEGF、HSP70水平显著升高（P0.05），CRS+EA组TFF2、VEGF、HSP70水平显著升高（P0.05）；与CRS组比较，CRS+EA组TFF2、VEGF、HSP70水平显著升高（P0.05），CRS+EA组HIF-1表达显著升高（P0.05）；与CRS组比较，CRS+EA组HIF-1表达显著升高（P0.05）。结论电针可以促进修复因子（TFF2、VEGF、HSP70）的释放，促进应激性溃疡小鼠胃黏膜损伤后的修复，且电针的疗效可能与治疗后HIF-1的表达水平显著上调相关。【关键词】应激性溃疡；胃溃疡；电针；低氧诱导因子-1；小鼠模型Experimental study on electric acupuncture promoting repair of gastric mucosal injury in mice with stress ulcerGAO Hao1，YONG Yue2，WU Xiaohui1，CHEN Wenting11.Anesthesiology Department，Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China；2.Acupuncture and Anesthesia Research Institute，Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，ChinaAbstract：ObjectiveTo observe the effect of electric acupuncture（EA）on promoting the repair of gastric mucosal injury in mice with stress ulcer，and explore the correlation between repair effect of EA and promoting repair factor release and up-regulating hypoxia-inducible factor-1（HIF-1）expression.MethodsMale C57BL/6 mice were randomly divided into control group（Sham group），model group（CRS group）and model+EA group（CRS+EA group），with 9 mice in each group.Except for the Sham group，the stress ulcer model（CRS model）was established in the CRS and CRS+EA groups after 3 days of cold-restraint stress，and EA intervention was performed 3 d after modeling.In the CRS+EA group，EA was applied to Zusanli（ST 36）and Liangqiu（ST 34）for 15 min，once in the morning and once in the afternoon，for 2 d.On day 6 of the experiment，the whole stomachs were separated from mice and were sampled to assess the gastric mucosal ulcer index（UI）score.The mRNA expression levels of repair factors including trefoil factor 2（TFF2），vascular endothelial growth factor（VEGF）and heat shock protein 70（HSP70）were determined by RT-qPCR，and the protein content and mRNA expression level of HIF-1 were determined by Western blot and RT-qPCR.ResultsThe CRS group and the CRS+EA group had significantly higher gastric mucosal UI score than the Sham group（P0.05）；and the CRS+EA group had significantly lower UI score than the CRS group（P0.05）.The CRS group had significantly higher levels of VEGF and HSP70 than the Sham group（P0.05），and the CRS+EA group showed significantly higher levels of TFF2，VEGF and HSP70 than the Sham group（P0.05）.The CRS+EA group had significantly higher levels of TFF2，VEGF and HSP70 than the CRS group（P0.05），while the CRS+EA group had significantly higher HIF-1 expression than the Sham group（P0.05）and the CRS group（P2 mm者分值加倍。1.4.2胃黏膜组织修复因子（TFF2、VEGF、HSP70）和调控因子 HIF-1 的 mRNA 表达采用 RT-qPCR 法检测胃组织TFF2、VEGF、HSP70及HIF-1 mRNA表达水平，取-80 冻存的大鼠胃组织，以TRIzol 法提取结肠组织总RNA，逆转录反应体系为20 L，根据试剂说明书操作，按条件进行逆转录。反应条件：40，3060 min；95，5 min。扩增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。PCR 反应条件：95、5 min，95、15 s，60、30 s，40 个循环。采用 Melt曲线分析，以GAPDH的表达为内参，每个样品重复3次，扩增结束，记录Ct值，按照2-Ct公式计算目的基因mRNA的相对表达量。1.4.3HIF-1 的蛋白表达水平采用 Western blot 法检测胃组织中HIF-1蛋白表达。取全胃组织，用冷磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤去污，切块置于匀浆器；加入组织后在-20 冰上彻底匀浆，将匀浆液振荡；加入RIPA裂解液，冷浴20 min，然后反复吹打，确保细胞完全裂解；12 000 r/min离心10 min，收集上清为总蛋白溶液；再用BCA测蛋白浓度；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）处理45 min。转膜：准备滤纸和聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，在垫子上垫海绵、两层滤纸，并除气泡、打湿，25 V恒压转膜过夜。免疫反应：5的脱脂牛奶封闭1 h，4 孵育一抗3 h，脱色摇床上洗3次，每次5 min；孵育二抗，30 min，脱色摇床上洗3次，每次注：ST36为小鼠“足三里”穴，位于膝关节下外侧，腓骨小头下3.5 mm处；ST34为“梁丘”穴，在膝关节上外方 2 mm处，股直肌和股外侧肌之间，与外膝眼在一条直线上；Tail non-acupoint为尾巴根部非经非穴。图2鼠科动物“足三里”穴（ST36）、“梁丘”穴（ST34）与尾部非经穴图解13图3小鼠造模3 d后胃黏膜形态学变化87上海中医药杂志 2023 年第 57 卷第9 期 Shanghai J Tradit Chin Med，Vol.57，No.9，Sept.2023 5 min。化学发光：进行显影和定影，根据不同的光强度调整曝光条件，凝胶图像分析；胶片扫描，存档，整理去色，Alpha软件处理条带光密度值；以-actin作为内参蛋白，重复3次。1.5统计学方法实验数据采用SPSS 1.0软件进行统计分析。计量资料以x s表示。所有数据进行正态性检验，符合正态分布者，多组计量资料之间比较采用单因素方差分析，方差齐者用LSD和SNK法，方差不齐者用Tamhanes T2或Dunnetts T3法；不符合正态分布者采用多组资料的秩和检验。以P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1对UI评分的影响与Sham组比较，CRS组、CRS+EA 组 UI 评分显著升高（P0.05）。与 CRS 组比较，CRS+EA组UI评分显著下降（P0.05）。上述说明电针治疗可以促进胃黏膜损伤后的修复，减轻胃黏膜损伤。见表2、图4。2.2对 TFF2、VEGF、HSP70 mRNA 表达的影响与Sham 组比较，CRS 组 VEGF、HSP70 mRNA 显著升高（P0.05），CRS+EA 组 TFF2、VEGF、HSP70 mRNA 显著升高（P0.05）。与 CRS 组 比 较，CRS+EA 组 TFF2、VEGF、HSP70 mRNA显著升高（P0.05），CRS+EA 组 HIF1 mRNA 及蛋白表达显著升高（P0.05）。与CRS组比较，CRS+EA组HIF1 mRNA及蛋白表达显著升高（P0.05）。上述说明电针能够上调HIF-1 mRNA及蛋白表达水平，增强胃黏膜损伤的修复。见表4、图5。3讨论创伤患者、重症颅脑疾病患者将面临应激性溃疡出血的风险，导致血流动力学剧烈波动，在重症监护室表1引物序列基因VEGFHSP70TFF2HIF1GAPDH引物序列上游：5-ATGAACTTTCTGCTCTCTTGGGTACA-3下游：5-GCAGATGTACAAGCCAAGGCGGTG-3上游：5-GAGGTCACCTTCGACATCGA-3下游：5-CTTGCCCGTGCTCTTGTC-3上游：5-CCCCCATAACAGGACGAAC-3下游：5-ATGAAGTTGGAGAAGCAGCAC-3上游：5-GAAAGCGCAAGTCCTCAAAG-3下游：5-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3上游：5-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3下游：5-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3引物长度/bp26242018192120202221注：VEGF 为血管内皮生长因子基因，HSP70为热休克蛋白 70基因，TFF2为三叶因子2基因，HIF1为低氧诱导因子1基因，GAPDH为甘油醛3磷酸脱氢酶。表2各组小鼠胃黏膜UI评分比较（n=6，x s，分）组别 Sham组CRS组CRS+EA组UI评分0.670.3343.5018.01*16.335.20*#注：Sham组为对照组，CRS组为模型组，CRS+EA组为模型+电针组。UI为溃疡指数。与Sham组比较，*P0.05；与CRS组比较，#P0.05。注：Sham组为对照组，CRS组为模型组，CRS+EA组为模型+电针组。图4各组小鼠胃黏膜的形态学变化表3各组小鼠胃组织TFF2、VEGF、HSP70 mRNA的表达水平比较（2-Ct）（n=3，x s）组别 Sham组CRS组CRS+EA组TFF21.210.822.080.745.231.39*#VEGF1.030.272.330.52*3.550.68*#HSP700.970.192.280.45*3.900.82*#注：TFF2为三叶因子2基因，VEGF为血管内皮生长因子基因，HSP70为热休克蛋白70基因。Sham组为对照组，CRS组为模型组，CRS+EA组为模型+电针组。与Sham组比较，*P0.05；与CRS组比较，#P0.05。表4各组小鼠胃组织HIF1 mRNA及蛋白的表达水平（n=3，x s）组别 Sham组CRS组CRS+EA组HIF1 mRNA1.010.111.720.865.981.28*#HIF-1 蛋白1.000.011.520.274.070.48*#注：HIF1为低氧诱导因子1。Sham组为对照组，CRS组为模型组，CRS+EA组为模型+电针组。与Sham组比较，*P0.05；与CRS组比较，#P0.05。88上海中医药杂志 2023 年第 57 卷第9 期 Shanghai J Tradit Chin Med，Vol.57，No.9，Sept.2023 停留时间延长以及死亡风险增加14-15，探索其发病机制并寻找安全有效的防治方法具有重要的临床意义。针灸可通过调节体内神经-内分泌-免疫系统功能，从而温热脾胃、调和阴阳、预防脾胃病，其被广泛应用于临床治疗胃黏膜病变，但相关的作用机制有待进一步论证16。本研究通过CRS的方法建立应激性溃疡小鼠模型，并采用电针治疗。结果显示，模型组小鼠胃黏膜充血、水肿，全胃散在多发点状/片状糜烂及出血，溃疡基底部可见白色或黄白色厚苔，个别溃疡点可深达肌层甚至穿孔，UI 评分显著升高，提示模型建立成功；而CRS+EA组UI评分显著降低。在明确证实针刺有效的前提下，我们采用分子生物学手段进一步证实了针刺的作用机制与促进修复因子的释放以及HIF-1的表达升高有关。3.1选穴的理论与临床依据足三里穴是足阳明胃经的合穴，它又是胃的下合穴，治疗胃痛、呕吐、腹胀、泄泻、便秘等胃肠系统疾病有明确的疗效。灵枢四时气 记载：“胃气逆则呕苦取三里以下胃气。”明代徐凤所著 针灸大全 记载足三里穴“善治胃中寒”，而高度总结和概括该穴位主治作用的是 四总穴歌 中所述“肚腹三里留”。现代实验研究17证明，针刺足三里穴具有调节肠蠕动、提高多种消化酶活性、改善胃肠黏膜血流等作用，在防治胃病方面具有重要性、特异性、广泛性的特点。临床实践证明，针刺足三里穴治疗胃肠疾病有明显疗效。动物实验18-19亦证实针刺足三里穴对胃黏膜具有保护作用。足阳明胃经的郄穴是梁丘，它的主治功效主要集中在调整胃肠道蠕动功能方面。研究20证实，针刺梁丘穴对于胃肠道具有双向调节作用1。基于上述临床研究和动物实验基础研究，结合中医古代文献为理论依据，本研究从中医最常用的治疗胃病穴位足三里穴、梁丘穴为切入点，进行基础实验研究，以进一步阐明电针对应激性溃疡胃黏膜修复作用的相关机制。3.2修复因子参与胃黏膜损伤修复有研究7-9认为，针刺、艾灸、经皮穴位电刺激可通过增加相关修复因子的释放，促进应激性溃疡损伤的修复。修复因子VEGF可调控黏膜血管的生成，促进胃溃疡损伤后的修复21。组织因子（TFFs）又称为三叶因子家族，分为 TFF1、TFF2和 TFF3。其中，TFF2通常由黏液分泌细胞表达于小肠和大肠，可保护胃肠内分泌的多种酸性物质和蛋白酶不被降解，并促进损伤后黏膜的重建，它是损伤后的快速反应肽22-23。热休克蛋白（HSPs）是一种普遍存在且高度守恒的蛋白家族，能够形成一种特殊机制来防止各种环境压力和不利条件对细胞结构的破坏，其主要功能是保护细胞、对抗压力，维持细胞正常生理机能，增加细胞对刺激的防御和适应能力24。本研究结果显示，电针可减轻应激性溃疡模型小鼠的胃黏膜损伤，并促进修复因子TFF2、VEGF、HSP70表达水平显著升高。上述说明电针干预的有效性主要体现在促进修复因子释放，进而增强胃黏膜损伤后的修复能力。3.3HIF-1参与胃黏膜损伤修复研究25发现，一种控制基因表达的细胞氧感应系统广泛存在于多种病理环境之中，HIF-1被确定为低氧转录反应的主要调节因子，在氧浓度正常的条件下，HIF-1通过氧敏性HIF-1特异性脯氨酰羟化酶（PHD1、PHD2、PHD3）发生羟基化。当氧浓度降低时，HIF-1将不被羟基化，在细胞核中积累，并与HIF-1结合，形成HIF-1复合体，该复合体在转录上变得活跃。在应激性溃疡胃黏膜损伤的状态下，胃黏膜组织局部处于缺血、低氧的状态，氧浓度下降使HIF-1蛋白稳定性增加，诱导内皮细胞分化，促进血管重建及改善缺血，进而增强胃黏膜损伤后的修复作用10。研究26显示，小鼠皮肤和黏膜损伤后的局部缺血、低氧性改变，可促进HIF-1蛋白稳定，激活体液因子的分泌与表达，其中最为显著的是VEGF。此外，Tsuchida等27证实，将家兔的软骨细胞置于低氧环境中，可通过刺激 HIF-1的大量生成，诱导 HSP70的高度表达，进而促进细胞生成、减少凋亡。本研究结果显示，通过电针干预模型小鼠，可减轻其胃黏膜损伤，显著降低UI评分，显著升高HIF-1表达。上述说明电针对HIF-1具有一定的调控作用，电针干预可能通过上调HIF-1的表达水平，增强应激性溃疡后胃黏膜损伤的修复作用。3.4小结本研究证实，电针促进应激性溃疡胃黏膜损伤的修复能力与 HIF-1 的上调、以及修复因子（TFF2、VEGF、HSP70）的表达增强有关，但这种相关性是否具有因果关系，抑或电针是如何通过上游调控机制来上调HIF-1的表达，促进修复因子的释放，增强应激性溃疡胃黏膜损伤修复，这些尚有待进一步的基础研究来证实。综上所述，电针治疗可以促进应激性溃疡小鼠修复因子的释放，促进胃黏膜损伤后的修复，显著上调HIF-1表达水平。本研究结果有助于推动电针应用于应激性溃疡的临床治疗，并为进一步优化针刺对低氧诱导因子为关键调控靶点的电针穴位治疗提供科学注：HIF-1为低氧诱导因子-1，-actin为肌动蛋白。Sham组为对照组，CRS组为模型组，CRS+EA组为模型+电针组。图5各组小鼠胃组织HIF-1a蛋白电泳条带89上海中医药杂志 2023 年第 57 卷第9 期 Shanghai J Tradit Chin Med，Vol.57，No.9，Sept.2023 依据。参考文献：1 朱泽荃，吴文忠，郑曼，等.电针对30例腹腔镜下胆囊切除术患者胃肠功能的影响 J.中国针灸，2021，41（2）：131-132.2 吕小生，宋玉文，石艳艳，等.重型脑创伤后足三里电针刺激联合嗜酸乳杆菌对胃肠动力作用及机制研究 J.辽宁中医杂志，2021，48（1）：190-193.3 张诗元.电针治疗对危重症病人急性胃肠损伤的影响 J.肠外与肠内营养，2017，24（2）：94-97.4 陈文婷，傅国强，王兰，等.妇科腹腔镜手术中电针足三里对胃黏膜血气指标的影响 J.临床麻醉学杂志，2014，30（8）：781-784.5 韩焱晶，代伟伟，彭磊，等.针刺对应激性胃黏膜损伤大鼠血浆和下丘脑中-内啡肽含量的影响 J.针刺研究，2011，36（5）：341-346.6 石君杰，李新伟，王海云，等.TEAS足三里预处理对NSAIDs胃黏膜损伤的保护作用 J.浙江中医杂志，2013，48（6）：406-407.7 刘密，常小荣，严洁，等.艾灸预处理对大鼠应激性胃黏膜损伤增殖修复相关因子的影响 J.世界华人消化杂志，2012，20（1）：53-59.8 YU J，PENG H，LIN Y，et al.Effect of moxibustion treatment on cell apoptosis and expressions of heat shock protein and 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