多粘菌素E单用或联合头孢他啶-阿维巴坦防止泛耐药铜绿假单胞菌耐药突变的体内外研究.pdf

临床输血与检验2023年6月第25卷第3期401DOI：10.3969/j.issn.1671-2587.2023.03.020*本课题受安徽省自然科学基金项目（No.1808085MH300）资助作者单位：230001 中国科学技术大学附属第一医院重症医学科作者简介：赵梦龙，主要从事脓毒症和多器官功能衰竭研究，（E-mail）。通信作者：梅清，主要从事脓毒症研究，（E-mail）。论著 临床研究多粘菌素E单用或联合头孢他啶-阿维巴坦防止泛耐药铜绿假单胞菌耐药突变的体内外研究*赵梦龙 耿士窠 朱春艳 房晓伟 梅清 【摘要】目的 在体内外探讨多粘菌素E（COL）单用或联合头孢他啶-阿维巴坦（CAZ-AVI）对泛耐药铜绿假单胞菌（XDR-PA）防耐药突变能力的影响，为防止COL进一步耐药的产生提供理论依据。方法 采用琼脂平板倍比稀释法测定CAZ-AVI和COL单药对10株XDR-PA的最低抑菌浓度（MIC）。应用肉汤法富集浓度为1010 CFU/mL的细菌，琼脂平板倍比稀释法测定上述抗菌药物单用及联合使用对XDR-PA的防耐药突变浓度（MPC）；建立兔组织笼感染模型，分别以生理盐水，三种剂量COL2.5、3.75、5 mg/（kgd）单用或基础剂量COL 2.5 mg/（kgd）联合CAZ-AVI（50+12.5）mg/（kgd）进行治疗，探讨兔组织笼感染模型中药物浓度与耐药突变菌形成的相关性；对体内筛选出的COL耐药突变株二组分系统PmrAB、PhoPQ、ParRS和CprRS进行PCR扩增并测序分析。结果 COL对10株XDR-PA均敏感，MIC范围为0.252 mg/L；CAZ-AVI对8株XDR-PA表现为敏感，2株耐药。COL单用对10株XDR-PA的MPC范围是64256 mg/L，联合CAZ-AVI时MPC范围降低为416 mg/L。在兔组织笼模型中，COL的浓度在2 h达到峰值，在一次给药间隔内其浓度均都在耐药突变选择窗（MSW）内。当给与不同剂量COL单药治疗时，XDR-PA的菌量在治疗一次后细菌的生长明显受到抑制，但在24 h后又恢复至原有的水平。当基础剂量COL联合CAZ-AVI时，组织笼内PA的菌量保持持续下降趋势，未出现恢复生长的现象。在COL单药组中均筛选出耐药突变株，每组随机选择5株，其对COL的MIC范围为8128 mg/L，基因突变多发生在PmrB和ParS。结论 COL与CAZ-AVI联合使用可降低其单用对XDR-PA的防耐药突变浓度，缩小MSW，有效保护COL抗菌活性。【关键词】多粘菌素E 头孢他啶-阿维巴坦 联合用药 防耐药突变浓度 耐药突变选择窗理论 【中图分类号】R446.5 【文献标识码】A 【文章编号】1671-2587（2023）03-0401-07Preventing Drug Resistance of Extensively-drug Resistant Pseudomonas Aeruginosa Through Colistin Combined with Ceftazidime-avibactam:an in Vitro and in Vivo Study ZHAO Menglong,GENG Shike,ZHU Chunyan,et al.Department of Intensive Care Unit,The First Affiliated Hospital of USTC 230001【Abstract】Objective To explore the theoretical basis to prevent further drug resistance,we examined the effects of Colistin(COL)alone or in combination with ceftazidime-avibactam(CAZ-AVI)on the ability of extensively-drug resistant Pseudomonas aeruginosa(XDR-PA)to prevent COL resistant mutations in vivo and in vitro.Provide a.Methods The minimum inhibitory concentration(MIC)of CAZ-AVI and COL against 10 strains of XDR-PA were determined by agar plate doubling dilution method.The both method were used to enrich the bacteria at a concentration of 1010 CFUmL-1,and the agar plate doubling dilution method to determine the mutant prevention concentration(MPC)of COL alone or in combination with CAZ-AVI against XDR-PA.A rabbit tissue cage infection model was established.The three doses of COL(2.5,3.75,5 mg/（kgd）)were used alone or the basic dose of COL(2.5 mg/（kgd）)combined with CAZ-AVI(50+12.5 mg/（kgd）)for treatment to explore the correlation between drug concentration and the formation of drug-resistant mutants in rabbit tissue cage infection models.The COL resistant mutants were screened in vivo,and the coding genes of the two-component regulatory systems PmrAB,PhoPQ,ParRS,and CprRS were amplified by PCR and sequenced.Results COL is sensitive to 10 strains of XDR-PA,no intermediary and drug-resistant bacteria have been found.The MIC range is 0.252mg/L.CAZ-AVI is sensitive to 8 strains of XDR-PA and 2 strains are resistant.The MPC range of COL alone for 10 strains of XDR-PA is 64256mg/L,when combined with CAZ-AVI,the MPC range is reduced to 416mg/L,and the reduction range is 816.In the rabbit tissue cage model,the concentration of COL reached its peak at 2h,and its concentration was all within the resistance mutation selection window(MSW)within the interval of one dosing.When given different concentrations of COL monotherapy,the bacterial growth of XDR-PA was obviously inhibited after one treatment,but it returned to the original level after 24 hours.When the basic dose of COL was combined with CAZ-AVI,the amount of P.aeruginosa bacteria in the tissue J Clin Transfus Lab Med,June.2023,Vol 25,No.3402铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）作为一种条件致病菌，通常定植在人体的呼吸道、肠道等部位。一旦宿主免疫屏障遭到破坏，可引起多种急慢性感染，常见于囊性纤维化、糖尿病和接受化疗的患者1-3。PA也是导致医院感染的常见病原菌，尤其在重症加强治疗病房（intensive care unit，ICU）中，常年处于检出病原菌的前三位4。由其引起的呼吸道和泌尿道感染，对重症患者的预后造成了极大的威胁。医院来源的PA常呈现出多重耐药性，甚至泛耐药性，造成抗感染治疗的挑战。尽管多粘菌素E（colistin，COL）在对多重耐药革兰阴性菌感染的治疗中疗效得到了证实，但在治疗过程中引起的诱导耐药现象也是不争的事实5。这不仅造成治疗失败的可能，也威胁到了COL在临床上的抗菌活性。耐药突变选择窗（mutant selection window，MSW）理论认为可以通过联合用药的方式避免耐药菌的产生6。但对于泛耐药（extensively-drug resistant，XDR）PA除COL外几乎没有有效 的 抗 菌 药 物 可 供 选 择。自 头 孢 他 啶-阿 维 巴 坦（ceftazidime-avibactam，CAZ-AVI）在我国获得批准上市以来，便引起了临床医生的特别关注7。我们前期研究显示COL与CAZ-AVI联合使用表现为相加或协同作用，减少生物膜的产生，是治疗XDR-PA感染的潜在方案8。但这一联合方案能否有效预防COL耐药突变菌的形成和富集尚未得到验证。本研究拟进一步在体内外对CAZ-AVI协同COL防耐药突变的能力进行评估，并初步揭示XDR-PA对COL耐药突变机制，为保护COL抗菌活性、指导临床合理用药提供理论依据。材料与方法1 菌株来源 临床受试菌株来自中国科学技术大学附属第一医院重症医学科2010年9月2018年9月收集的10株XDR-PA，由MicroScan WalkAway-40自动微生物分析仪（美国DADE公司）自动鉴定系统鉴定，均经药敏试验定为泛耐药菌。PA野生株（PAO1）购于美国模式培养物集存库，ATCC 27853作为药敏质控菌。cage maintained a continuous downward trend,and there was no recovery of growth.Resistance mutants were screened in the COL single drug group,and 5 were randomly selected from each group.The MIC range for COL was 8128mg/L.Gene mutations mostly occurred in PmrB.Conclusions The combined use of COL and CAZ-AVI can reduce its single-use anti-drug resistance mutation concentration of XDR-PA,reduce MSW,and effectively protect the antibacterial activity of COL.【Key words】COL CAZ-AVI Combination medication Mutant prevention concentration Mutation selection window2 实验动物 健康、清洁雌性新西兰白兔60只，体重2.02.5 kg，2025周龄，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2019-0010，饲养于中国科学技术大学附属第一医院动物实验中心，实验前观察1周，标准饲料喂养，饮水随意。伦理学申明：该动物实验通过中国科学技术大学附属第一医院实验动物管理委员会的批准（2023-NA-37）。3 最 低 抑 菌 浓 度（m i n i m u m i n h i b i t o r y concentration，MIC）测定 采用琼脂平板倍比稀释法测定CAZ-AVI和COL单药对XDR-PA的最低抑菌浓度（MIC）。COL对XDR-PA的敏感性结果按美国临床实验室标准化委员会（CLSI）2020年标准判读9：MIC2 mg/L为敏感，4 mg/L为中介，8 mg/L为耐药。每个 CAZ 浓度中加入固定终浓度的AVI（4 mg/L），结果按照美国食品和药物管理局（FDA）提供的MIC折点标准进行判读（8 mg/L为敏感）10。4 防 耐 药 突 变 浓 度（m u t a n t p r e v e n t i o n concentration，MPC）测定 从新鲜过夜培养的细菌平板上挑取单个菌落接种于20 mL MH肉汤中，37震荡过夜培养，3 000 r/min离心后弃上清液，细菌再悬浮于200 mL的新鲜MH肉汤中，震荡培养6 h，离心后将菌液浓度调整为31010 CFU/mL。取0.1 mL菌液置于90 mm直径含不同浓度药物的MH琼脂平板上，并涂布均匀。以各单药MIC为基准，倍比稀释7个浓度配置琼脂平板。药物终浓度分别为各菌株的1MIC，2MIC64MIC，每个浓度4个平板，使每个药物浓度的细菌总接种量为1.21010 CFU。35培养72 h，以无细菌生长的最低药物浓度为MPC。测定CAZ-AVI的MPC时，每个平板中加入固定的浓度的AVI（4 mg/L）；测定联合用药的MPC时，将每个含COL的平板中加入1 mL CAZ-AVI（16 mg/L4 mg/L，稳态时平均血药浓度11）。5 动物模型的建立及干预 雌性新西兰白兔背部去毛，30 mg/kg戊巴比妥钠麻醉，皮肤碘伏消毒，皮下植入高尔夫练习球1个。术后应用青霉素10万IU/kg，一天两次，使用3天。4周后，高尔夫练习球内已充满清亮的组织液。实验前一天，用无菌注射器抽取球内液体0.5 mL，取0.1 mL接种于MH琼脂平板上，37临床输血与检验2023年6月第25卷第3期403过夜培养，经检验无菌后，用于建立感染模型。实验当日，用无菌注射器往高尔夫练习球内注入浓度为1.2109 CFU/mL（平板计数法）处于对数生长期的PA1802 或PAO1 1 mL，感染后2 d抽取球内组织液0.5 mL进行细菌菌落计数，细菌浓度在108 CFU/mL以上者用于实验12。在感染3 d后开始分组处理，在感染模型建立中共13只兔子因感染PA死亡，剔除出组。24只实验动物用于临床株PA1802模型建立，随机分成5组，对照组4只，其余每组5只：COL单药基础剂量组COL 2.5 mg/（kgd）；COL单药高剂量组COL 3.75 mg/（kgd）；COL单药最高剂量组COL 5 mg/（kgd）；COL单药基础剂量2.5 mg/（kgd）联用CAZ-AVI 50 mg/（kgd）12.5 mg/（kgd）组；阴性对照组给予相应量的生理盐水。23只实验动物用于野生株PAO1模型建立，随机分成5组，对照组3只，其余每组5只，分组同菌株PA1802。耳缘静脉注射，给药5 d，以上药物均8 h给药一次。6 药物浓度测定 在治疗第6次给药时，兔体内的药物浓度己经达到稳态，在达到稳态后第一次给药前（记作0 h），以及给药后0.5 h，1 h，2 h，4 h和8 h时分别用无菌注射器从组织笼内抽取0.5 mL的组织液，经高速离心（8 900 r/min，10 min）后取上清存储在80超低温冰箱中用于COL药物浓度的测定。采用液相色谱串联质谱法测定组织液中COL的浓度13。7 体内抗菌效果的评价 每只兔子治疗前，治疗期间的每24 h均从组织笼内抽取组织液0.5 mL，采用平板菌落计数法测定其中的细菌浓度，绘制体内时间杀菌曲线，检测的细菌浓度的低限为2 log10 CFU/mL12。8 多粘菌素耐药突变株的检测 将上述模型处理后48 h抽取组织笼中组织液0.01 mL培养液均匀涂布于含有2倍MIC COL药物浓度的MH琼脂平板上，置35培养1820 h后观察平板上细菌生长情况。对于平板上有细菌生长的阳性结果即可判定为原培养液中有突变菌产生，并挑取单菌落测定其COL的MIC14。9 多粘菌素耐药基因检测 按照美国Sigma公司细菌DNA提取试剂盒说明书操作，提取耐药突变株的DNA。PCR引物由武汉华大基因生物技术有限公司合成，各对引物对应序列见表1。PCR反应体系为Premix Tag酶体系12 L，上下游引物各1 L，DNA模板2 L，最后用双蒸水补足至25 L。热循环参数：94预变性5 min；94变性1 min；根据各引物Tm值设置退火温度，退火1 min；72延伸1 min，循环30次；72延伸10 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，出现目的条带为检测阳性。阳性PCR扩增产物送武汉华大基因生物工程有限公司纯化并测序，采用SnapGene4.1.9对测序结果进行序列比对分析。表1 铜绿假单胞菌二元调控系统基因PCR扩增相应引物序列基因引物序列5-3产物长度（Bp）Tm（）phoPQP1ACTACAAGTTCTAAATGACC2 14650PQ2ACACCTCAGACGTAGGGAACphoQQ1CTGATGGAACAGCTCTATCC1 53455PQ2ACACCTCAGACGTAGGGAACpmrBpmrBaGCGGTGGAGGCGGTACCGCTGG 80352pmrBbGGGAATTCTCAGATATGTGACCGCCCGCParPar-F1/R1GCATATAATGCCAGCCGATT/ACCACCAGCAGGTTCTTGTC1 05554Par-F2/R2CTATTCGCTGGTGGAAAAGC/GTTAAGCCTCCGCTGTCAAC1 16255CprCpr-F1a/R1aCGCAGTATCCGAAGGAAGAA/CCCTTCCTCTTCCATCATCA1 15455Cpr-F2/R2TCTGATCCATACCCTGCACA/CTGTTCCTCGAGCAGTTCCT1 30055Cpr-F3/R3ACCTGGATCGTCACCCTGT/TCTTCTCGGCGATCAAGTTC1 16960结 果1 体外药敏试验结果 10株XDR-PA对COL均敏感，未发现中介和耐药菌，MIC范围为0.252 mg/L；CAZ-AVI对10株XDR-PA的MIC值范围在 1128 mg/L，其中 2 株的 MIC8 mg/L，详细MIC值见表2（内酰胺酶耐药基因分布情况见补充文件）。COL单用对10株XDR-PA的MPC范围是64256 mg/L，两药联合的MPC范围为416 mg/L，两药联合较单药均有降低，降低倍数范围为816。2 COL药物浓度测定 在兔组织笼模型血药浓度达到稳定后，一次给药后的血药浓度见图1，无论是PAO1组还是临床菌株PA1802组，COL的浓度在2 h达到峰值，而后开始下降，在一次给药间隔内两组兔组织笼内的COL浓度基本都在其MSW内。3 体内时间杀菌曲线 兔组织笼内的PA载量随治疗时间的变化见图2。PAO1组和临床菌株PA1802组的 J Clin Transfus Lab Med,June.2023,Vol 25,No.3404表2 COL单用及联合CAZ-AVI使用对10株XDR-PA的MIC和MPC菌株MICCOL（mg/L）MICCAZ-AVI（mg/L）MPCCOL（mg/L）MPCAZ-AVI（mg/L）MPCCOL+CAZ-AVI（mg/L）MPCCOL降低倍数ATCC 278530.52641688PAO118643288PA10330.2546416416PA13020.52641688PA13092322561281616PA14081812832168PA15021642562561616PA152318643288PA16110.5812832168PA17040.5412816816PA18021412816816PA181911648416注：A为临床株PA1802；B为野生株PAO1。图1 在兔组织笼模型血药浓度达到稳定后，一次给药后COL的血药浓度注：纵坐标为细菌浓度，横坐标为给药后时间，虚线为检测下限。A为临床株PA1802；B为野生株PAO1。图2 在不同组处理下对PA的对数生长期杀菌曲线情况基本相似，对照组菌量在治疗结束时均保持在1.2109 CFU/mL。当给予COL单药低剂量治疗时，在治疗一次后PA的生长明显受到抑制，但在24 h后细菌开始恢复生长，至72 h时细菌浓度已恢复至治疗前水平1.2109 CFU/mL。当COL药物剂量由2.5 mg/kg/d增加到最高值5 mg/kg/d时，细菌的恢复生长依旧未能被抑制。但当基础剂量COL联合CAZ-AVI时，组织笼内PA的菌量保持持续下降趋势，临床株PA1802在5 d时达到最低菌量1102 CFU/mL，并未出现恢复生长的现象。PAO1也呈现出与PA1802类似的现象，但由于PAO1对COL和CAZ-AVI的敏感性更高，细菌载量降低至检测下限位于第4天。4 耐药突变株的检测及耐药基因的测序 在三种剂量COL单药组中均检测出大量耐药突变株，从每组中随机选择3个突变株进行二元调控系统基因检测。阳性的PCR产物经过纯化、测序后，采用SnapGene 4.1.9比对分析功能，与亲代株PAO1或PA1802序列进行比对，结果如下：在亲代株为PA1802组中，仅有1株的phoQ基因发生第263位氨基酸的点突变GlnHis，有6株的PmrB基因发生第209位氨基酸的点突变TryHis；其中一株pmrB基因第355号氨基酸Ile和第356号氨基酸Glu之间插入一段核苷酸序列临床输血与检验2023年6月第25卷第3期405 表3 18株耐药突变株的突变基因表达情况及其MIC 亲代株菌株来源MIC（mg/L）PhoQPmrBParSCprSPA1802基础剂量组8864Gln263His高剂量组32Tyr345His32Tyr345His64Tyr345His超高剂量组32Tyr345His128Tyr345His，insertion*His398Arg64Tyr345HisHis398ArgPAO1基础剂量组81616Tyr345HisHis398Arg高剂量组16Tyr345His832Tyr345His超高剂量组32-Tyr345HisHis398Arg64Tyr345HisHis398Arg32Tyr345HisHis398Arg注：*PmrB基因的第355号氨基酸Ile和第356号氨基酸Glu之间插入一段核苷酸序列GACAAGGACATC，插入了4个氨基酸Asp-Lys-Asp-Ile。GACAAGGACATC，即插入了4个氨基酸Asp-Lys-Asp-Ile;有2株的ParS基因发生第398位氨基酸的点突变HisArg；Cpr基因并未发现突变。在亲代株为PAO1组中，有6株的PmrB基因发生第209位氨基酸的点突变TryHis；有4株的ParS基因发生第398位氨基酸的点突变HisArg；Cpr和phoQ基因并未发现突变，详见表3。讨 论自20世纪40年代，多粘菌素已开始用于治疗革兰阴性菌引起的泌尿道感染、脑膜炎、菌血症、肺炎、骨髓炎、心内膜炎或烧伤15。但由于肾毒性耳毒性等问题，该方案通常用于挽救治疗。随着泛耐药菌的增多，多粘菌素的使用也更加频繁，相应的多粘菌素耐药菌呈现增长趋势。TAMM等16报道，长期使用多粘菌素会造成耐药的可能性不断加大，44例囊性纤维化患者经过吸入多粘菌素治疗后11%发展成了对多粘菌素耐药。LI等17发现从囊性纤维化疾病使用吸入式多粘菌素的病人中分离得到的铜绿假单胞菌对多粘菌素耐药的现象更加严重，23株菌株中有11株显示耐药，耐药率为47.83%。这可能是因为大多数细菌对多粘菌素具有较高的耐药突变频率，在临床使用过程中容易产生诱导耐药现象。MSW理论认为抗菌药物浓度位于野生敏感株MIC和MPC之间时，耐药突变体才会被选择性富集扩增。也就是说当药物浓度高于MPC时，这种富集才会被抑制6。尽管本研究中10株XDR-PA对多粘菌素均敏感，但其MPC均超过了64 mg/L，即便是超高剂量（5 mg/kg/d）多粘菌素E在感染部位的峰浓度也远低于此。由此可见，单独提高给药剂量不但增加了药毒性风险，也无法改变多粘菌素E药物浓度落入MSW以内的事实。但MSW理论也提出，对于这种安全治疗窗口较窄的药物，另一种方法是选择不同作用机制的抗菌药物与其联合应用，从而关闭或缩小MSW，达到防止细菌耐药产生同时不增加不良反应的目的18。WEI WJ等19的研究发现，COL和氯霉素联合使用对广泛耐药的鲍曼不动杆菌表现为协同作用。幸运的是，MIKHAIL S等20发现CAZ-AVI的存在可以增强或延长多粘菌素的杀菌作用，这与我们前期研究结果类似。本研究的体外试验发现，CAZ-AVI与COL联用后各菌株的MPC值均较单用时有明显降低，两药联合的MPC可低至4 mg/L，降低倍数范围为816。因此，联合用药是降低COL耐药突变株的产生的潜在方案。但体内情况往往不同于体外，由于药物浓度在体内处于波动状态，联合使用的两种药物在药代动力学上可能出现不匹配的情况。另一方面，由于生物适应性代价及宿主免疫的存在，使耐药突变体被筛选出后 J Clin Transfus Lab Med,June.2023,Vol 25,No.3406难以适应周围的环境而繁殖。因此，我们进一步在动物体内进行了验证实验。COL单药组兔组织笼内的PA浓度测定显示，在治疗一次后细菌的生长明显受到抑制，但随后又迅速恢复到原有水平。并且我们在所有COL单药组的组织笼内均分离出了耐药突变菌。这也说明COL单药治疗失败的原因是由于耐药菌的产生与富集导致。此外，同步测定的药代动力学参数显示COL浓度始终保持在MPC以下，即使COL已增加至临床最高剂量。有趣的是，这种细菌恢复生长和耐药突变体富集的现象并没有在联合用药组中被发现。更重要的是，CAZ-AVI和COL均使用的是常规剂量，这意味着联合抗菌疗法是对抗革兰氏阴性“超级细菌”的重要选择。此外，我们还对突变菌的耐药机制进行了初步探讨，COL与PA主要依靠带阳离子的脂肽环与带阴离子脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）之间的静电而相互作用，因此，通过修饰细胞外膜LPS成分从而减少静电作用的机制被认为是最主要的耐药机制之一。在低Mg2+条件下，LPS由操纵子ArnBCADTEF指导合成，并且被PmrAB和PhoPQ二元调控系统所操纵21-23。本研究发现1株存在phoQ基因的突变，且仅存在于临床株PA1802的突变株；PmrB基因的突变最多，存在于6株临床突变株和6株野生突变株，且介导较高水平的耐药（MIC16 mg/L）。二元调控系统ParRS和CprRS的突变对铜绿假单胞菌的黏菌素耐药性也有一定作用和影响，且不受低Mg2+限制24-25。本研究中ParS基因的突变在临床株与野生株中均有发现，但并未发现CprS基因突变株。与本研究结果类似，JI-YOUNG L等26人的研究发现大多数核苷酸取代是无义突变，并且仅在多粘菌素突变体中鉴定出氨基酸改变，仅在PhoQ的三个位点和ParS的三个位点发现。此外，这些突变与临床菌株上发现的COL耐药机制也保持一致，侧面说明基因突变是PA对COL耐药形成的主要方式。然而，PA对COL产生耐药突变不仅仅在常见的二元调控系统基因上，其他系统或位置上也可能存在。例如低水平耐药突变株几乎没有出现该系统基因的突变，具体机制可能还需要借助全基因组测序技术的进一步诠释。综上所述，本研究通过对CAZ-AVI协同COL防耐药突变的能力进行了评估，在体内外证实CAZ-AVI与COL联用可显著缩窄其对PA的MSW，有效防止COL耐药菌的产生。为临床合理利用现有抗菌药物治疗XDR-PA感染提供了理论依据。利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突参 考 文 献 1 MAYER-HAMBLETT N,RETSCH-BOGART G,KLOSTER M,et al.Azithromycin for early Pseudomonas infection in cystic fibrosis.the OPTIMIZE randomized trialJ.Am J Respir Crit Care Med,2018,198(9):1177-1187.2 MONOGUE M L,STAINTON S M,BAUMMER-CARR A,et al.Pharmacokinetics and tissue penetration of ceftolozane-tazobactam in diabetic patients with lower limb infections and healthy adult volunteersJ.Antimicrob Agents Chemother,2017,61(12):e01449-e01417.3 GIRMENIA C,BERTAINA A,PICIOCCHI A,et al.Incidence,risk factors and outcome of pre-engraftment gram-negative bacteremia after allogeneic and autologous hematopoietic stem cell transplantation:an 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