高效液相色谱三重四极杆质谱联用法测定茶叶中百草枯残留量.pdf

现代食品XIANDAISHIPIN178/分析检测Analysis and Testingdoi:10.16736/41-1434/ts.2023.13.044高效液相色谱三重四极杆质谱联用法测定 茶叶中百草枯残留量Determination of Paraquat Residue in Tea by High-Performance Liquid Chromatography Triple Quadrupole Mass Spectrometry 吴 琼1，汪文俊2，朱 林1，徐小雷1，宗凯1，韩 芳1，叶 菁1，余晓峰1（1.合肥海关技术中心，食品安全分析与检测安徽省重点实验室，安徽 合肥 230022；2.黄山市茶产业促进中心，安徽 黄山 245000）WU Qiong1,WANG Wenjun2,ZHU Lin1,XU Xiaolei1,ZONG Kai1,HAN Fang1,YE Jing1,YU Xiaofeng1(1.Technology Center of Hefei Customs,Anhui Province Key Laboratory of Analysis and Detection for Food Safety,Hefei 230022,China;2.Huangshan Tea Industry Promotion Center,Huangshan 245000,China)摘 要：采用高效液相色谱三重四极杆质谱联用技术建立了一种测定茶叶中百草枯残留量的方法。试样中的百草枯农药残留经含甲酸（Formic Acid，FA）的甲醇水溶液提取后，使用弱阳离子交换固相萃取柱（Oasis WCX）净化，以含 0.1%FA 的水溶液和乙腈作为流动相，经亲水性 HILIC 色谱柱分离后采用电喷雾离子源（Electrospray Ionization，ESI）正离子模式采集，多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式下检测，外标法定量。目标物在 5.0 200.0 gL-1内线性良好，相关系数（r2）大于 0.99，平均回收率为92.5%103.2%，相对标准偏差为 3.2%5.6%，方法定量限为 5 gkg-1。该方法线性范围、回收率、精密度均符合方法学要求，适用于各类茶叶基质，定量限能满足 GB 27632021 和欧盟对茶叶中百草枯的限量要求，为完善百草枯检测标准、监控茶叶质量安全和国家食品安全抽检提供技术支撑。关键词：百草枯；茶叶；液相色谱质谱联用；除草剂Abstract：A method was developed for the determination of paraquat residue in tea by high-performance liquid chromatography triple quadrupole mass spectrometry(HPLC-MS-MS).Paraquat pesticide residues in samples were extracted by methanol-formic acid solution,purified by WCX solid phase extraction column,Water-acetonitrile solution containing 0.1%formic acid was used as mobile phase,after separation by hydrophilic HILIC column,collected by electrospray ion source positive ion mode,detected under selective reaction monitoring mode,and quantified by external standard method.The correlation coefficient(r2)was greater than 0.99 in the range of 5.0 200.0 gL-1.The average recoveries were 92.5%103.2%,the relative standard deviations were 3.2%5.6%,and the limit of quantization was 5 gkg-1.The linear range,recovery and precision of the method meet the requirements of methodology and are suitable for various tea substrates.The limited quantity can meet the GB 27632021 and the European Union for paraquat in tea limited requirements,the research provide technical support for national food safety sampling inspection.Keywords：paraquat;tea;liquid chromatography-mass spectrometry;herbicides中图分类号：O657.63基金项目：安徽省科技重大专项（202003a06020001）。作者简介：吴琼（1990），女，硕士，工程师，研究方向为茶叶质量安全。通信作者：余晓峰（1967），男，本科，研究员，研究方向为茶叶加工与品质。E-mail：。现代食品XIANDAISHIPIN179/分析检测AnalysisandTesting百草枯是一种快速灭生性除草剂，能够迅速被植物绿色组织吸收，可有效杀死一年或多年生杂草，在土壤中迅速与土壤结合而使其钝化1-3。因此，它们曾长期被认为是对环境无害类农药而在全球推广使用，但百草枯对人和动物毒性极大，一旦误服无药可解，口服中毒死亡率在 90%以上，我国是百草枯生产使用大国，也是中毒者数量最多的国家4。食品安全国家标准 食品中百草枯等 43 种农药最大残留限量（GB 2763.12018）发布后，食品安全国家标准增加了百草枯在谷物和茶叶中的最大残留限量要求，目前现行的食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量（GB 27632021）延续了百草枯在茶叶中的最大残留限量要求（0.2 mgkg-1）。国外标准中，欧盟对输欧茶叶中百草枯残留量作了规定，不得大于 0.05 mgkg-1。目前现行的百草枯检测标准有出口植物源性食品中百草枯和敌草快残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法（SN/T 02932014）、出口果蔬中百 草 枯 检 测 拉 曼 光 谱 法（SN/T 46982016）和 稻米中百草枯残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法（DB22/T 16222012），检测方法主要包含液相色谱串联质谱法和拉曼光谱法等，检测对象涉及水果蔬菜、玉米、稻米等植物源性食品。SN/T 02932014作为 GB 27632021 指定的百草枯检测方法，其适用范围仅为大米、大豆、玉米、小麦、棉籽、干木耳、甘蓝、苹果、香蕉和草莓，未包含茶叶。直接使用该方法对茶叶中百草枯残留量进行检测时存在溶剂用量大且回收率偏低的情况。覃重阳等5利用表面增强拉曼光谱法对茶叶中百草枯农药残留进行快速检测，但该方法在分析不同茶叶中农药含量时存在基质影响大的问题，普适性较差。目前主流的百草枯残留量检测方法仍为高效液相色谱质谱联用法6-15。色谱质谱联用技术具有选择性好、定性能力强、灵敏度高的优点，近年来较少有该方法对茶叶中百草枯残留量的检测研究报道。本研究以茶叶为检测对象，在出口植物源性食品中百草枯和敌草快残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法（SN/T 02932014）方法基础上，采用固相萃取结合高效液相色谱三重四极杆质谱联用技术，通过优化前处理过程及仪器条件等，建立了一种准确、高效测定茶叶中百草枯残留量的方法。本方法定量限为 5 gkg-1，可满足国标和欧盟对茶叶的限量要求，为完善百草枯检测标准、监控茶叶质量安全和国家食品安全抽检提供了技术支撑。1 材料与方法1.1 材料与试剂本实验中所用绿茶、红茶、黑茶等茶叶样品均购自黄山茶城。甲醇、乙腈（色谱纯，西陇科学）；甲酸（色谱纯，阿拉丁）；氨水（分析纯，阿拉丁）；超纯水由纯水仪制得（Milli-Q，美国 Millipore）；WCX 固相萃取柱（60 mg，3 mL，美国Waters）；百草枯二氯酸盐（CAS：1910-42-5，100 mgL-1，天津阿尔塔）。1.2 仪器与设备样 品 磨（KN295，丹 麦 FOSS）；涡 旋 振 荡 仪（Vortex-Genie 2，美国 Scientific Industries）；分析天平（万分之一，上海梅特勒）；固相萃取装置（美国 Waters）；液相色谱-质谱联用仪（1290II-6470，美国安捷伦）。1.3 实验方法1.3.1 标准溶液配制标准储备液：移取 1 mL 质量浓度为 100 mgL-1的百草枯二氯盐有证标准储备液于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到 1 mgL-1百草枯二氯盐标准储备液。标准工作溶液：移取相应体积的标准储备液（1 mgL-1）用空白样品基质溶液稀释，分别配制成质量浓度为 5.0 gL-1、10.0 gL-1、20.0 gL-1、50.0 gL-1、100.0 gL-1和 200.0 gL-1的系列标准工作溶液。1.3.2 样品前处理取代表性的茶叶样品 500 g 经样品磨粉碎后充分混匀。称取 2.0 g 样品于 50 mL 具塞离心管中，加入20 mL 含 5%FA 的甲醇水溶液，涡旋混匀 3 min 后均质提取 2 min，4 000 rmin-1离心 5 min，取上层提取液 10 mL 到 15 mL 聚乙烯离心管中，用 5%NH4OH 水溶液调节 pH 值至 7.00.5，将上清液转移至已经过活化的固相萃取柱内，控制流速，弃去流出液。依次用 2 mL 水和 2 mL 甲醇淋洗萃取柱，最后用 4 mL 含10%FA 的乙腈溶液洗脱，控制流速，收集洗脱液于刻度离心管中，洗脱液经 45 氮吹至干，取 1 mL 乙腈-0.1%FA 水溶液溶解残渣，过 0.22 m 滤膜后，供液相色谱三重四极杆质谱联用仪测定。现代食品XIANDAISHIPIN180/分析检测Analysis and Testing1.3.3 色谱条件色谱柱：Thermo Syncronis HILIC（长度为100 mm，直 径 为 2.1 mm，粒 径 为 1.7 m）；流 动 相 A：0.1%FA 水溶液；流动相 B：乙腈；梯度洗脱程序：0 3.0 min，5%A，3.0 5.0 min，5%90%A；5.0 8.0 min，90%A；8.0 8.1 min，90%5%A；柱温：40；进样量：2 L；流速：0.3 mLmin-1。1.3.4 质谱条件离子化模式：电喷雾电离正离子模式（ESI+）；质谱扫描方式：多反应监测（MRM）；干燥气：氮气；鞘气流速：10 Lmin-1；辅助气流速：3 Lmin-1；离子传输管温度：350；喷雾气电压：4 000 V；碰撞气：氩气，1.0 mTorr，质谱参数见表 1。表 1 百草枯的质谱条件表化合物保留时间/min母离子（m/z）源内碎裂电压/V子离子（m/z）碰撞能量/V百草枯4.588186.0100171*2015530注：*为定量离子。1.4 数据处理采用高效液相色谱质谱联用仪自带软件工作站 Agilent Mass Hunter Quantitative Analysis（for QQQ）进行标准曲线绘制和样液质量浓度计算。采用 Microsoft Office Excel 2013 软件进行数据统计及统计图表绘制，采用 Win 10 自带画图软件进行图像辅助处理。2 结果与分析2.1 色谱与质谱条件的优化接双通注入质量浓度为 1 mgL-1的百草枯标准溶液以优化质谱条件，通过全扫描模式（Q3 SCAN）优化喷雾气电压、源内碎裂电压、干燥气流速和离子传输管温度等参数，得到对应母离子 186；再通过产物离子扫描模式（Product ion SCAN）找到对应子离子；分别选择响应较优的两个产物离子作为定量和定性离子，分别为 171 和 155；最后在多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式下根据响应优化碰撞能等参数4，具体参数见表 1。百草枯为亲水强极性化合物，参考 SN/T 02932014 方法采用亲水性 Syncronis HILIC 色谱柱进行分离。流动相采用 0.1%FA 水乙腈流动相体系优化峰形减少拖尾，同时提高离子化效率，利用优化好的质谱参数和色谱条件进行MRM分析，百草枯（0.2 mgL-1）的总离子流图与 MRM 质谱图见图 1。104 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 04.24.34.44.54.64.74.84.9Acquisition Time/min-0.5+TIC MRMCounts+（a）总离子流图 105 1.2 1.0 0.8155.0171.0186.0 0.6 0.4 0.2 0154 156 158 160 162 164 166 168 170 172 174 176 178 180 182 184 186 188Mass-to-Charge/（m/z）+MRM(4.542-4.644 min,20 scans)(186.0-+)200.dCounts（b）MRM 质谱图图 1 百草枯（0.2 mgL-1）总离子流图与 MRM 质谱图现代食品XIANDAISHIPIN181/分析检测AnalysisandTesting2.2 提取溶剂的优化百草枯呈碱性，易溶于水，在中性和酸性条件下稳定。调研文献6-7,11发现，大部分采用有机溶剂与稀酸混合溶液进行提取，分别选择相同体积甲醇/0.1 molL-1盐酸溶液（1 9）、乙腈/0.1 molL-1盐酸溶液（1 9）、含 5%FA 的甲醇/水（1 1）、含 5%FA 的乙腈/水（1 1）进行溶剂萃取，考察实际茶叶样品加标的萃取效率。实验发现，选择含 5%FA 的甲醇/水（1 1）溶液萃取效率最佳，百草枯归一化萃取效率见图 2。120 100 80归一化萃取效率/%60 40甲醇/0.1 molL-1盐酸溶液（1 9）乙腈/0.1 molL-1盐酸溶液（1 9）含 5%甲酸的甲醇/水（1 1）含 5%甲酸的乙腈/水（1 1）20提取溶液 0图 2 不同提取溶剂归一化萃取效率图 2.3 固相萃取柱洗脱条件的优化茶叶样品基质较蔬菜水果复杂，提取液色素含量高，基质效应强，无法直接上机分析。为了获得更好的净化效果，采用固相萃取法净化。百草枯为亲水性强极性化合物，参考 SN/T 02932014 方法，选用阳离子交换、混合型 WCX 固相萃取柱进行净化。洗脱条件是决定回收率的关键因素，在 0.2 mgkg-1加标浓度下，分别用含 5%、10%、15%FA 的乙腈溶液作为洗脱液，进行回收率实验。实验发现，含 10%、15%FA 的乙腈溶液的洗脱效率明显优于 5%，而用 10%和 15%FA-乙腈时的洗脱效率相差不大，考虑到相同洗脱效率下优先选择含酸浓度低的乙腈溶液作为洗脱液，最终采用含 10%FA 的乙腈进行洗脱。不同洗脱溶剂归一化洗脱效率结果见图 3。同时，实验考察了不同体积（2 mL、3 mL、4 mL 和 5 mL）洗脱液的洗脱效率。在 0.2 mgkg-1的加标浓度下，根据回收率结果最终选用 4 mL 洗脱液洗脱。不同洗脱体积下的回收率结果见图 4。110 100 90 80 70 60 505%FA 的乙腈溶液 10%FA 的乙腈溶液 15%FA 的乙腈溶液洗脱溶剂归一化洗脱效率/%图 3 不同洗脱溶剂归一化洗脱效率图 110 100 90 80 70 60 50 40123456洗脱溶剂体积/mL归一化回收率/%图 4 不同体积洗脱液洗脱归一化回收率图2.4 线性关系、方法定量限、回收率和精密度实验用空白基质溶液配制质量浓度为 5.0 200.0 gL-1的百草枯系列标准工作溶液，1.3 色谱和质谱条件下进样，以百草枯定量离子 171 色谱峰面积为 y 轴，质量浓度为 x 轴绘制标准曲线。结果表明，在相应质量浓度范围内线性良好，线性方程为 y=307.51x-480.63，r2=0.999 86。以 3 倍信噪比确定检出限，该方法百草枯检出限为 1 gkg-1，以 10 倍信噪比确定定量限，该方法百草枯定量限为 5 gkg-1。为了考察该方法在不同茶叶中的适用性，分别选择绿茶、红茶、黑茶阴性样品，在方法定量限（0.005 mgkg-1）、欧盟茶叶限量（0.050 mgkg-1）、标曲最高点/国标茶叶限量（0.200 mgkg-1）3 个不同浓度水平下加标，按照本研究方法进行处理和测定，每个加标水平做 6 次平行实验，加标回收率和精密度实验数据如表 2 所示。结果表示，百草枯平均回收率为 92.5%103.2%，相对标准偏差为 3.2%5.6%，准确度和精密度满足方法学要求。2.5 方法应用用本文建立的方法对市售 20 份茶叶样品进行百草枯残留量检测，20 份样品均无百草枯残留检出，市售样品和阴性加标样品 MRM 图见图 5 和图 6。现代食品XIANDAISHIPIN182/分析检测Analysis and Testing3 结论与讨论本文建立了一种茶叶中百草枯残留量的固相萃取/高效液相色谱三重四极杆质谱检测法，茶叶样品经甲醇-甲酸水溶液提取后，采用 WCX 固相萃取柱净化，样液在含 0.1%FA 水-乙腈流动相体系经亲水性HILIC 色谱柱分离，采用电喷雾离子源正离子模式采集，多反应监测模式下检测，外标法定量。由于百草枯易产生柱残留，在分析标准工作溶液与样液之间可插入数针试剂空白，避免柱残留产生的假阳性。该方法结果准确，适用于各种茶类中百草枯残留量的测定，方法定量限可满足各国对茶叶中百草枯的限量要求，为完善百草枯检测标准、监控茶叶质量安全、国家食品安全抽检提供了技术支撑。参考文献1 陈珊珊，邓晓，刘景坤，等.百草枯检测方法的研究进展 J.农药，2014，53（1）：4-6.2 林琎，高云，慕卫，等.UPLC-MS/MS 检测水中敌草快的残留 J.实验室研究与探索，2016，35（8）：37-39.3 毕思远，李金峰，王幸幸，等.除草剂百草枯的检测方法研究进展 J.安徽农业科学，2014（23）：7825-7828.4 赵静，李琛，郭自国，等.固相萃取/高效液相色谱串联质谱法测定水中百草枯与敌草快残留 J.表 2 阴性样品中百草枯加标回收率和精密度表（n=6）化合物加标量/（mgkg-1）绿茶红茶黑茶回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%百草枯0.00593.45.292.55.695.63.20.05098.74.797.63.899.84.90.200100.64.6102.44.9103.25.6 101 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0+MRM(186.0-171.0)20230220-3.d 186.0-171.0.186.0-155.0 Ratio=40.3(485.7%)4.573 minCounts3.84.04.24.44.64.85.05.25.4Acquisition Time/min3.84.04.24.44.64.85.05.25.4Acquisition Time/min 102 1 2 3 0-1-2-3-4-5-6-7Relative Abundance/%（a）定量离子色谱图 （b）定性定量离子相对丰度图图 5市售样品 MRM 图186.0-171.0.186.0-155.0 Ratio=8.5(102.9%)3.84.04.24.44.64.85.05.25.4Acquisition Time/min3.84.588 min4.04.24.44.64.85.05.25.4Acquisition Time/min 102 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0Relative Abundance/%102 2.25 2.00 1.75 1.50 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 2.50Counts+MRM(186.0-171.0)（a）定量离子色谱图 （b）定性定量离子相对丰度图图 6 茶叶加标样品 MRM 图现代食品XIANDAISHIPIN183/分析检测AnalysisandTesting分析测试学报,2018，37（5）：626-629.5 覃重阳，张媛媛，邓薪睿，等.表面增强拉曼光谱法快速检测茶叶中百草枯与敌百虫农药残留 J.食品安全质量检测学报,2022，13（14）：4439-4446.6 纪律，徐峻卿，李启，等.快速溶剂萃取 超高效液相色谱串联质谱法测定竹笋中的百草枯残留 J.中国卫生检验杂志，2018，28（1）：18-21.7 李捷，杨方，卢声宇，等.超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法测定茶叶中敌草快和百草枯残留 J.分析试验室，2014，33（5）：537-541.8PIZZUTTI I R，VELA G M，DE K A，et al.Determination of paraquat and diquat：LC-MS method optimization and validationJ.Food Chem，2016，209：248-255.9 陶胜康，段绍恒，覃世保，等.液相色谱质谱法测定绿化带土壤中 5 种除草剂残留 J.化学工程师，2022，36（7）：30-32.10 潘胜东，王立，邱巧丽，等.固相萃取净化-超高效液相色谱-高分辨质谱法测定尿液中百草枯和敌草快残留 J.色谱，2022，40（12）：1087-1094.11 金玉娥，徐骞，薛黎明，等.亲水作用色谱结合超高效液相色谱-三重四级杆质谱法检测蔬菜水果中8 种高极性农药残留 J.环境与职业医学,2022,39（6）：701-707.12 华正罡，陈曦，于浩洋，等.亲水超高效液相色谱-串联质谱法同时测定尿液中百草枯和敌草快 J.化学分析计量，2022，31（3）：14-18.13 乐浩鸣，梁泉，卢银兵，等.HPLC-MS-MS 法快速筛查 4 种常见强极性除草剂 J.中国法医学杂志,2022，37（1）：65-68.14 郭翔，李添娣，田东超，等.血浆和尿液中百草枯和敌草快测定的固相萃取-液相色谱-串联质谱法 J.中华劳动卫生职业病杂志，2021，39（8）：612-616.15 陆静，成婧，杨纯，等.超高效液相色谱-串联质谱法测定蔬菜水果中的百草枯和敌草快残留 J.食品安全质量检测学报，2020，11（2）：586-592.制备了双凝胶基人造奶油模拟体系，通过微观形态分析和稳定性分析，考察了复合凝胶剂浓度和甾醇/谷维素质量比对制备人造奶油模拟体系的影响。在凝胶剂浓度为 9%，质量比为 2 3 时得到了稳定性较好的人造奶油模拟体系。参考文献1 李胜，马传国，殷俊俊，等.-谷维素与-谷甾醇凝胶油研究进展J.粮食与油脂，2015，28（6）：4-8.2BOT A，AGTEROF W G.Structuring of edible oils by mixtures of oryzanol with sitosterol or related phytosterolsJ.Journal of the American Oil Chemists Society，2006，83（6）：513-521.3ZHANG Y，LU Y，ZHANG R，et al.Novel high internal phase emulsions with gelled oil phase：preparation，characterization and stability evaluationJ.Food Hydrocolloids，2021，121：106995.4GUO S，SONG M，GAO X，et al.Assembly pattern of multicomponent supramolecular oleogel composed of ceramide and lecithin in sunflower oil：self-assembly or self-sorting?J.Food Function，2020，11（9）：7651-7660.5 池建伟，李阳，张虹，等.-谷甾醇与-谷维素键合特征的红外光谱分析 J.中国粮油学报，2013，28（8）：97-101.（上接第 173 页）浪费犹如河缺口，节约好比燕衔泥。