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分子诊断技术在结核分枝杆菌检测中的应用.pdf

上传人:自信****多点 文档编号:619108 上传时间:2024-01-17 格式:PDF 页数:4 大小:1.19MB
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资源描述

1、【通讯作者简介】刘小娟博士主任技师硕士研究生导师四川省卫健委学术技术带头人后备人选中华医学会儿科分会临床检验学组青年委员会副组长四川省性学会生殖检验专业委员会副主任委员四川省医师协会检验医师分会青年委员会副主任委员四川省医促会妇幼精准诊断医学专委会常务委员四川省医学会第十二届检验专业委员会委员 研究方向:感染性疾病的分子诊断标志物及胚胎发育影响因素与分子机制分分子子诊诊断断技技术术在在结结核核分分枝枝杆杆菌菌检检测测中中的的应应用用刘 芳刘小娟(四川大学华西第二医院检验科出生缺陷与相关妇儿疾病教育部重点实验室四川 成都)【摘要】结核病是全球最关注的公共卫生问题之一 结核分枝杆菌的实验室检测及早

2、筛查出潜伏性结核感染者和活动性结核病已成为当前控制结核菌感染的重中之重 随着分子诊断技术的发展其在结核分枝杆菌病原学检测中的应用已不简单的局限于实时荧光聚合酶链反应技术出现了更多灵敏度高、特异性好、样本类型应用广的新型技术 极大地提高了结核分枝杆菌的实验室检出率 应用先进的分子诊断技术提高实验室对活动性结核病的早期诊断及潜伏性结核的诊断能力帮助临床根据患者的个体化病情选择与之相对应的实验室检测技术制定合理的诊疗方案仍是分子诊断领域未来需全力解决的问题【关键词】结核分枝杆菌分子诊断技术潜伏性结核【中图分类号】【文献标志码】【文章编号】()()【】【】.().().【】结核病()是严重危害人民群众

3、健康的呼吸道传染病是我国重点防控的法定重大传染病之一它是威胁人类身体健康和生命安全的重要杀手 年世界卫生组织估计全球新发结核病患者约 万死亡 万全国第五次结核病流行病学调查结果显示我国活动性、涂阳和菌阳肺结核的患病率分别为/万、/万和/万地区、人群分布差异明显西部传染性肺结核患病率约为中部的 倍东部的 倍农村患病 率 为 城 市 的 倍 结 核 分 枝 杆 菌()于 年由 首次提出并认定为结核病的病因早诊断、早隔离、早治疗是减少肺结核发病和死亡的关键 但目前大部分结核病临床表现不典型病原标本采集困难大部分患者无法通过传统实验室检查获得病原学确诊 加强结核感染的实验室诊断及早筛查出潜伏性结核感染

4、者和活动性结核病已成为当前控制结核菌感染的重中之重 近年来分子生物学诊断技术的迅速发展让更多的 分子诊断技术应用于临床极大提高了 的检出率 本文就分子诊断技术应用于 的应用作一综述 实时荧光 技术.传统荧光 技术传统 技术以只存在于 复合群(包括、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌等)种的特异序列 为检测靶点目前可用 于 鉴 别 诊 断 与 非 结 核 分 枝 杆 菌()等研究显示常规实时荧光定量 在不同来源标本中的灵敏度均显著高于涂片及培养即使在涂片阴性的情况下其灵敏度及特异度仍较高分子诊断技术用于 诊断的早期此方法曾普遍应用于医学实验室一方面其具有灵敏度高速度快的特点另 实用医院临床杂志 年 月第

5、卷第 期一方面由于 并非存在于所有 中部分样本中 载量较低甚至缺失可能导致检出率低假阴性等情况./是以结核分枝杆菌的 聚合酶活性位点编码区(核心序列)为靶标采用半巢式实时半定量 进行 及利福平耐药基因检测的方法 无需单独的核酸提取步骤检测试剂集成了提取和扩增过程通过扩增判读样本中是否含有 并对检出的 序列中 基因进行检测来判断有无利福平耐药因为 的利福平耐药菌株同时对异烟肼耐药因此 试剂对 基因的检测结果又可在一定程度上判断是否为耐多药结核菌株 推荐 可作为检测疑似结核、疑似耐多药结核或 感染的首选方法 研究显示对于结核性脑膜炎()检测的灵敏度为 对于结核病并发 感染者的脑脊液 检测的灵敏度为

6、 特异度为 也可以通过脑脊液样本进行离心富集或提高样本量至 以上还可再提高检测的灵敏度 对于有 症状的患者脑脊液 建议优先使用 检测 基因芯片技术基因芯片技术是将特定设计的 探针规律地固化于芯片表面形成 探针阵列与荧光标记的靶分子进行 杂交 通过荧光扫描仪自动检测杂交荧光信号能够在同一时间内对 进行检测并分型 其具有灵敏度高、通量大、可分型等优势但也存在芯片制备复杂、样品标记繁琐、检测成本高、容易出现非特异性扩增等缺点 值得一提的是该方法可以检测耐药一线抗结核药物相关耐药基因据 等研究显示基因芯片法对利福平耐药的灵敏度和特异度分别为 和 对异烟肼耐药的灵敏度和特异度分别为 和.等对基因芯片、和

7、 三种方法检测培养阳性痰标本 及耐药情况检出率分别为、提示基因芯片法是一种既能检测出结核菌也可判断多重耐药结核菌感染的方法 恒温扩增技术恒温扩增技术是在恒定的温度下完成扩增的一类分子生物学技术其特征为基因扩增过程不需要温度梯度的循环 恒温扩增技术对仪器的要求不高检测成本相对低一些 近年来以该项技术为基本原理发展起来的分子诊断技术主要有环介导等温扩增技术()、交叉引物法检测技术()、实时荧光核酸恒温扩增检测技术()等 年 发布的 在肺结核诊断中的应用中对来自全球的感染数据进行了总结分析建议在诊断疑似肺结核患者时使用 技术作为补充方法尤其是痰涂片镜检阴性时有必要使用此技术进行实验室检测 等曾报道与

8、培养结果相比较 检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异度分别为 和 其中涂片阴性患者的样本检出灵敏度为 提示在结核病高发地区 具有较好的诊断能力 是一种同时具备内外部质控的 核酸检测技术该技术最主要的特点在于速度快无需单独步骤提取结果判读容易使用 该方法学虽最早应用于结核分枝杆菌核酸检测上但真正大放异彩却是在 年新型冠状病毒疫情期间作为新冠病毒核酸快速检测方法应用与临床 等报道国内一项研究显示、检测结果与培养结果及临床诊断结果相比灵敏度和特异度相似 在样本量不大时能明显缩短检测时间具有较高的灵敏度和特异性适用于发热门诊及急诊 但 检测只能单管检测当样本量较大时批量检测反而更慢 是以 特异的 核糖体 为

9、靶点进行恒温扩增结合实时荧光检测的方法由于 只在活菌中存在相比其它以 为检测靶标的技术 检测结果与临床病情发展实际情况更一致可用于检测疾病活动性、监测用药疗效和判断治愈程度 高分辨率熔解曲线分析技术线()高分辨率熔解曲线技术是通过检测特异性扩增产物与探针形成双链的解链温度比较突变序列和野生型序列的温度差异从而获得靶基因序列信息 该方法可同时检测结核分枝杆菌复合群和一线二线抗结核药物(异烟肼、利福平、乙胺丁醇及氟喹诺酮类药品)的耐药基因 等用高分辨率熔解曲线技术在 例肺外结核患者新鲜组织培养分离菌株中检测到 例 患者()例()单耐 患者 例()单耐 患者 同时 也直接从组织中鉴定出 例培养阴性的

10、 患者 检测结果和测 实用医院临床杂志 年 月第 卷第 期序的结果具有 的一致性 据吴剑等报道在 例脑脊液标本中探针熔解曲线技术的阳性检出率与 快速培养法一致 线性探针()技术应用生物素修饰的特异引物扩增 产物变性后与固定在膜上的特异寡核苷酸探针杂交通过杂交信号而获得序列信息酶免疫显色法显示检测结果 具有速度快、技术简单等优势但其与基因芯片技术一样受膜上探针的限制不能检测出所有的类型 在 年推荐 用于痰标本检测 宏 基 因 组 测 序 技 术()以上技术是分子诊断技术发展过程中最常使用到的一些技术但这些技术都有一个共同点那就是必须预设引物不能完全区别 型别及所有耐药基因位点 最近几年伴随着二代

11、测序技术普遍应用于临床微生物检测领域其在 的检测也发挥了重要作用 直接提取临床标本的全部微生物核酸进行无差别和无选择性的大规模测序再将序列信息与已知微生物数据库比对分析从而判断样本中微生物的种类和含量.全基因组测序()技术 方法是利用 测序平台重新构建生物体基因组的完整 序列 对培养困难的病原体(如)具有明显优势 等在一项研究中对 例结核病患者分离出来的标本进行了分型结果显示常规的基因分型方法可能会高估 在发病率较低国家内的传播因为不同的 菌株 发生相同突变的可能性很小所以基于鉴定 的 基因分型较其他分子分型方法具有更高的分辨率 在这种应用场景中 在肺结核和肺外结核的诊断中均具有较高的敏感度

12、有报道对 例结核性脑膜炎患者脑脊液使用 方法检测出阳性 例检出率为.同时结合传统方法还可以将检出率提高至.同时 等在其研究指出实验室技术检测脑脊液中 的灵敏度依次为(.)、()、(.)、培养(.)、涂片().病原靶向测序()技术 又称为“小宏基因测序”其结合多重 扩增与高通量测序两种技术能够对待测样本中几十种至几百种已知病原微生物及其毒力和/或耐药基因进行检测 与 相比 具有病原谱范围明确、测序成本低等优势而在 的检测中 的特异度较 更高可同时进行 及 测序且能对 进行具体分型 因此 在病原体检测领域正被逐步接受并大范围应用 数字 技术数字 技术是介于高通量测序技术与实时 技术之间的新型 技术

13、其在病原体检测中的应用场景与其余分子诊断技术不冲突主要用于绝对定量低丰度的 有报道显示使用 检测脑脊液诊断 灵敏度为 特异性为 明 显 高 于 和 实 时 荧 光 定 量 但其检测成本相对较高、通量不大也在一定程度上限制了在临床病原体检测中的应用规模 结语与展望 的实验室检测近年来越来越多的依赖于分子诊断技术在其中的应用 大量分子诊断技术被研发并应用于 的诊断治疗中 每一种方法均具有自己的优缺点很难有一种方法能覆盖所有的应用场景 尽管分子技术具有灵敏度高的明显优点但目前而言 的实验室检测率不高的主要原因仍然在于难以获取含有足够病原体的优质样本及分子诊断技术中对 核酸提取和 富集的较高要求所致

14、笔者认为未来分子诊断技术的进一步发展及更多的分子标志物的发现必然可以进一步提高实验室 检出率 但并不能片面的一味追求超高的灵敏度而应该综合考虑患者的病情发展、经济状况、生活环境等情况选择经济、高效、准确、精准、个性化的检测方案 达到快速检测、早期诊断、精准治疗的目的【参考文献】.:/.:.:/./.王宇.全国第五次结核病流行病学抽样调查资料汇编.北京:军事医学科学出版社.():./:.():.实用医院临床杂志 年 月第 卷第 期:.():.():.(/):.():.杨元利张永峰刘元等./技术对成年人结核性脑膜炎诊断价值的研究.中国防痨杂志():.()/.():./:.():.():.()/.(

15、)().():.张瑞雪龙钢冯国栋等./对结核性脑膜炎诊断的临床评价.中华检验医学杂志():.金慧芳刘鑫.脑脊液 /检测和结核杆菌快速培养辅助诊断结核性脑膜炎的价值比较.临床内科杂志():.:.:.晏子俊陈彦清蒋利华等.基因芯片技术的概述及其应用前景.中国优生与遗传杂志():.():./.()():.():/.:.:/./.:.():.王少华郑丹薇朱岩坤等.两种恒温扩增分子检测法与实时荧光定量核酸扩增法对肺结核诊断价值的比较.中华结核和呼吸杂志 ():.():.:.:.():.吴剑石学萍刘艳.溶解曲线技术在结核性脑膜炎临床诊断中的价值评价.新疆医学():.():.:.():.:.:.().:.:.:.:.():.(收稿日期:修回日期:)(本文编辑:林 赟)实用医院临床杂志 年 月第 卷第 期

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