粪便SDC2、TFPI2、SFRP2基因甲基化联合检测在结直肠癌早期筛查中的临床价值.pdf

doi:10.3969/j.issn.1006-5709.2023.08.002基金项目:江苏省临床免疫学重点实验室开发课题(KJS2203)第一 作 者 简 介:谭 能 姣,硕 士,研 究 方 向:消 化 道 肿 瘤。E-mail:t15871563653 通讯作者:张德庆,博士,副主任医师,研究方向:消化道早癌的诊治。E-mail:13915508847 粪便 SDC2、TFPI2、SFRP2 基因甲基化联合检测在结直肠癌早期筛查中的临床价值谭能姣,张德庆苏州大学附属第一医院消化内科,江苏 苏州 215006【摘要】目的探讨粪便 SDC2、TFPI2、SFRP2 基因甲基化联合检测在结直肠癌早期筛查中的临床价值。方法收集苏州大学附属第一医院 2021 年 6 月至 2022 年 2 月就诊患者 105 例,其中结直肠癌组患者 30 例,腺瘤组患者 45 例,健康对照者 30 名,采用荧光定量 PCR 法检测患者粪便 SDC2、TFPI2、SFRP2 的甲基化情况。分析粪便 SDC2、TFPI2、SFRP2 甲基化及其三者联合检测诊断结直肠癌的敏感度及特异度,以病理结果为金标准,通过 ROC 曲线分析该检测方法对疾病的诊断效能。结果结直肠癌组患者粪便SDC2、TFPI2、SFRP2 甲基化及其联合结直肠癌检测阳性率高于腺瘤组和正常对照组,且腺瘤组高于正常对照组。SDC2、TFPI2、SFRP2 甲基化及其联合检测结直肠癌的敏感度分别为 46.7%、53.3%、66.7%、76.7%;特异度分别为 96.7%、93.3%、96.7%、86.7%。ROC 曲线分析显示粪便 SDC2、SFRP2、TFPI2 甲基化联合检测筛查结直肠癌的效能较高。结论粪便 SDC2、TFPI2、SFRP2甲基化联合检测对结直肠癌早期筛查的诊断价值较高,具有重要意义。【关键词】结直肠癌;硫酸类肝素蛋白多糖 2;分泌型卷曲蛋白 2;组织因子途径抑制物 2;甲基化检测;筛查中图分类号:R735.3文献标识码:A文章编号:1006-5709(2023)08-0847-05收稿日期:2022-09-01Clinical value of combined gene methylation(SDC2,TFPI2 and SFRP2)in fecal specimen for early screening of colorectal cancerTAN Nengjiao,ZHANG DeqingDepartment of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 215006,China【Abstract】ObjectiveTo investigate the clinical value of combined gene methylation of SDC2,TFPI2 and SFRP2 in fecal for early screening of colorectal cancer.MethodsA total of 105 stool samples were collected from 30 colorectal cancer patients(colorectal cancer group),45 adenoma patients(adenoma group)and 30 healthy people(normal con-trol group)from Jun.2021 to Feb.2022 in the First Affiliated Hospital of Soochow University.The gene methylations of SDC2,TFPI2 and SFRP2 were detected by fluorescence quantitative PCR.The sensitivity and specificity of their methy-lation status in diagnosis of colorectal cancer were analyzed.Using pathological results as the gold standard,ROC curve was used to analyze the diagnostic efficiency.ResultsThe gene methylation rates of fecal SDC2,TFPI2 and SFRP2 in colorectal cancer group were higher than those in adenoma group and normal control group,and the rates in adenoma group were higher than those in normal control group.The sensitivities of SDC2,TFPI2 and SFRP2,and their combined detection were 46.7%,53.3%,66.7%and 76.7%,respectively.The specificities were 96.7%,93.3%,96.7%and 86.7%,respectively.ROC curve analysis showed that the combined detection had a higher efficacy in colorectal cancer screening.ConclusionThe combined detection of fecal SDC2,TFPI2 and SFRP2 methylation has high diag-nostic value for early screening of colorectal cancer.【Key words】Colorectal cancer;SDC2;SFRP2;TFPI2;Methylation detection;Screening结直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤,其发病率及死亡率分别位居世界第三、第二位,严重威胁着人类生命健康1。结直肠癌的发生发展是一个漫长的多步骤过程,正常黏膜腺瘤肠癌的发展过程通常需要数年甚至数十年2。早期结直肠癌一般无临床症状,而当出现腹痛、便血、腹部包块、体质量骤减等症状就诊时可能已发展至中晚期。中国结直肠癌诊疗规范(2020 年版)提出早期结直肠癌的诊疗包括内镜下切除、局部切除及结肠癌切除术。晚期结直肠癌主要采用放化疗及药物治疗3。早期结直肠癌 5 年生存率高达 95%,而晚期结直肠癌 5 年生存率不足 8%4。因此,早期诊断结直肠癌在诊疗过程中发挥重要作用。在结直肠癌发生的早期阶段,表观遗传学改变似乎高748胃肠病学和肝病学杂志2023 年 8 月第 32 卷第 8 期Chin J Gastroenterol Hepatol,Aug 2023,Vol.32,No.8于基因突变的频率5。DNA 甲基化是最常见的表观遗传学改变,逐渐成为肿瘤发生发展机制的热点。大量研究6-9表明,粪便硫酸类肝素蛋白多糖 2(syndecan-2,SDC2)、分泌型卷曲蛋白 2(secreted frizzled related pro-tein 2,SFRP2)、组织因子途径抑制物 2(tissue factor pathway inhibitor 2,TFPI2)均具有高敏感度及特异度,且两者联合检测结直肠癌的效能更高,可作为结直肠癌早期检测的重要标志物。目前尚未发现粪便 SDC2、SFRP2、TFPI2 联合检测结直肠癌的相关研究,本研究拟分析粪便 SDC2、SFRP2、TFPI2 基因及其联合检测在结直肠癌早期筛查中的临床价值。1资料与方法1.1一般资料选取 2021 年 6 月至 2022 年 2 月在苏州大学附属第一医院普外科及消化内科接受诊治的结直肠癌患者及拟行肠镜检查患者。其中结直肠癌组患者 30 例,男 20 例,女 10 例,年龄(61.1013.36)岁(3280 岁);腺瘤组患者 45 例,男 20 例,女 25 例,年龄(55.8210.78)岁(33 77 岁);健康者 30 名(正常对照组),男 18 名,女 12 名,年龄(55.73 13.12)岁(2382 岁)。三组在年龄、性别方面比较,差异均无统计学意义(P0.05),具有可比性。1.2纳入及排除标准纳入标准:(1)病理确诊为结直肠癌的患者;(2)有肠息肉、炎性病变等,拟行肠镜患者;(3)年龄 18 80 岁,性别不限;(4)无其他恶性肿瘤史。排除标准:(1)使用了对检测有干扰的药物,即黄连素的样本;(2)未能获取完整病历资料;(3)接受过放化疗治疗。入组研究对象均知情同意。本研究获得医院伦理委员会的批准批准号:(2021)伦审批第 011 号。1.3实验方法1.3.1标本收集:使用专用采集管收集患者治疗前或行肠镜检查前的 58 g 成型粪便,并进行基因检测。1.3.2粪便 DNA 的提取:根据试剂盒说明书,利用粪便 DNA 提取试剂盒从粪便样本中提取 DNA,主要基于磁珠法进行 DNA 回收富集纯化,并充分洗去杂质,获取高纯度的 DNA 样本。1.3.3亚硫酸氢盐转化:严格按照核酸纯化试剂盒说明书的步骤,基于亚硫酸氢盐转化法对粪便 DNA 进行转换及纯化。经亚硫酸氢盐处理后未甲基化的胞嘧啶脱氨成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变。1.3.4 荧 光 定 量 PCR 检 测:严 格 按 照 人 SDC2/SFRP2/TFPI2 基因甲基化联合检测试剂盒(荧光 PCR法)说明书操作(江苏汇先医药技术有限公司,苏苏械备 20211287 号),经亚硫酸盐修饰后的核酸取 14 l加入装有反 应液(含 SDC2、SFRP2、TFPI2、ACTB 引物、DNA 探针)的 PCR 管中,混匀后瞬时离心,在实时荧光定量 PCR 仪中进行 PCR 扩增和检测,反应条件:预变性 95 ,180 s,1 个循环;变性 95 ,10 s,退火、延伸及检测荧光,60 ,32 s,共 45 个循环。1.3.5结果判读:反应结束后自动保存结果,当内参基因 ACTB 检测的循环阈值(cycle threshold,Ct)40,SDC2、TFPI2、SFRP2 基因检测 Ct 值37 且有 S 型扩增曲线的样本为阳性样本;当内参基因 ACTB 检测 Ct值0.20 0.40 为一致性一般,Kappa 值0.400.60 为一致性中等,Kappa 值0.60 0.80 为一致性较强,Kappa 值0.801.00 为极强,P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1粪便 SDC2、TFPI2、SFRP2 甲基化及三者联合检测在结直肠癌组、腺瘤组和正常对照组的甲基化情况结直肠癌组 SDC2、TFPI2、SFRP2 基因甲基化阳性率及其三者联合阳性率高于腺瘤组和正常对照组,且腺瘤组高于正常对照组;且三者联合阳性率均高于单基因甲基化阳性率,差异有统计学意义(P0.05)。TFPI2、SFRP2 基因甲基化与患者的分化程度无关(P0.05),SDC2、三者联合检测的 甲基化阳性 率与患者的 分化程度 相 关(P TFPI2SDC2,在结直肠癌组中,三者联合检测 与 病 理 检 测 两 种 方 法 一 致 性 较 强(Kappa=0.633,P0.05,见表 3、图 1)。表 1粪便 SDC2、TFPI2、SFRP2 及三者联合在三组中的甲基化阳性率比较 例数(%)Tab 1Comparison of methylation rate of fecal SDC2,TFPI2,SFRP2 and their combined detection in the 3 groups n(%)组别例数SDC2 阳性TFPI2 阳性SFRP2 阳性三者联合结直肠癌组3014(46.7)16(53.3)20(66.7)23(76.7)腺瘤组454(8.9)15(33.3)16(35.6)21(46.7)正常对照组301(3.3)2(6.7)1(3.3)4(13.3)2值23.50815.29026.36824.274P 值0.050.050.050.05表 2粪便 SDC2、TFPI2、SFRP2 甲基化阳性率检测与结直肠癌临床病理特征的关系 例数(%)Tab 2Relationship between methylation rate of fecal SDC2,TFPI2,SFRP2 and clinicopathological features of colorectal cancer n(%)临床特征例数SDC2P 值TFPI2P 值SFRP2P 值三者联合P 值年龄0.2840.2840.2350.66960 岁124(33.3)8(66.7)10(83.3)10(83.3)60 岁1810(55.6)8(44.4)10(55.6)13(72.2)性别0.7090.7090.6901.000男2010(50.0)10(50.0)14(70.0)15(75.0)女104(40.0)6(60.0)6(60.0)8(80.0)肿瘤部位1.0001.0001.0001.000直肠199(47.4)10(52.6)13(68.4)14(73.7)结肠115(45.5)6(54.5)7(63.6)9(81.8)肿瘤最大径1.0000.7301.0001.0005 cm167(43.8)8(50.0)11(68.8)12(75.0)5 cm147(50.0)8(57.1)9(64.3)11(78.6)分期0.4400.4400.6751.000 期93(33.3)6(66.7)7(77.8)7(77.8)期2111(52.4)10(47.6)13(61.9)16(76.2)淋巴结转移0.1421.0001.0000.372有1911(57.9)10(52.6)13(68.4)16(84.2)无113(27.3)6(54.5)7(63.6)7(63.6)分化程度0.050.4940.6360.05低分化301(33.3)2(66.7)2(66.7)中低分化1611(68.8)10(62.5)12(75.0)15(93.8)中分化113(27.3)5(45.5)6(54.5)6(54.5)表 3SDC2、TFPI2、SFRP2 及三者联合检测的诊断性能Tab 3Diagnostic performance of SDC2,TFPI2,SFRP2 and their combined detection项目AUC95%CI敏感度特异度约登指数SDC20.7170.5840.8490.4670.9670.434TFPI20.7330.6030.8640.5330.9330.466SFRP20.8170.7030.9310.6670.9670.634三者联合0.8170.7030.9310.7670.8670.634948胃肠病学和肝病学杂志2023 年 8 月第 32 卷第 8 期Chin J Gastroenterol Hepatol,Aug 2023,Vol.32,No.8图 1粪便 SDC2、SFRP2、TFPI2 及联合检测诊断结直肠癌的ROC 曲线Fig 1ROC curve of fecal SDC2,SFRP2,TFPI2 and combined detection in the diagnosis of colorectal cancer3讨论 结直肠癌是临床常见的恶性肿瘤,随着医疗技术的发展,尽管新的治疗方案使晚期肿瘤总生存率较前提高,但死亡率仍较高,早期结直肠癌患者预后较好,基本可实现临床治愈10。因此,结直肠癌早期筛查意义重大。粪便隐血试验和结肠镜检查是目前临床上检测结直肠癌最常用的方法。但各有利弊,粪便隐血试验对 CRC 筛查的敏感度及特异度较低,而结肠镜检查为有创的检测方法,且需充分的肠道准备,不适用于大范围的筛查11。简便、无创、依从性高的检测方法成为结直肠癌筛查的研究热点。遗传和表观遗传变化的长期累积最终导致结直肠癌的发生发展,常见的表观遗传学包括 DNA 甲基化、非编码 RNA 调控和组蛋白修饰,DNA 甲基化是研究最充分的表观遗传修饰形式12-13。多项研究表明,基因甲基化基于粪便、血液及尿液的分析,有望成为多种恶性肿瘤无创筛查分子标志物,包括胰腺癌、肺癌、食管癌、肾癌、结直肠癌等14-18。粪便中含有脱落的肿瘤细胞,只需提取粪便DNA,再进行 PCR 扩增,即可达到通过粪便甲基化检测结直肠癌的目的。因此,在结直肠癌中,粪便 DNA研究更为广泛,目前已发现多种适用于结直肠癌筛查的粪便基因。SDC2 基因编码一种细胞内在膜蛋白,参与细胞增殖和迁移19。TFPI2 基因是一种 Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂,保护癌细胞的细胞外基质免受降解20。SFRP2 基因是作为 Wnt 通路抑制剂发挥作用的分泌糖蛋白。SFRP2 基因的沉默可能导致 Wnt通路的激活,从而促进结直肠肿瘤的发生21。国内外多项研究表明,SDC2、TFPI2、SFRP2 基因检测结直肠癌具有较高敏感度及特异度,可作为检测结直肠癌的有效标志物6-9。且中国结直肠肿瘤早诊筛查策略专家共识也推荐多靶点粪便检测结直肠肿瘤的早诊筛查22。在 Han 等23研究中,基因甲基化率与患者肿瘤直径、淋巴结转移、分期均无相关性,表明基因甲基化是结直肠癌发生的早期事件,早于组织病理学改变,但李永坤等24研究中基因的超甲基化与分期、分化程度、淋巴结转移呈正相关。本研究中,三者联合检测结直肠癌在肿瘤的分化程度中差异有统计学意义,不同于既往研究。考虑可能因样本量不足存在偏倚,基因甲基化与临床病理特征之间的关系仍需大样本量的进一步研究。本研究结果发现,粪便 SDC2、TFPI2、SFRP2 及其联合 检 测 结 直 肠 癌 患 者 的 甲 基 化 阳 性 率 分 别 为46.7%、53.3%、66.7%、76.7%;检测腺瘤患者的甲基化阳性率分别为 8.9%、33.3%、35.6%、46.7%;并且相较于单基因甲基化检测,联合检测比单基因检测更敏感,与柏愚等25研究结果一致,可能与多基因可覆盖多种肿瘤形成的分子途径相关。研究表明腺瘤性息肉的切除可使结直肠癌的发病率降低26。因此,早期检测出腺瘤对结直肠癌的筛查具有重大意义,本研究SDC2、SFRP2、TFPI2 三者联合检测也可检测到 46.7%的腺瘤患者。进展期腺瘤的癌变风险高,进一步扩大样本量对腺瘤进行分组可能提高其敏感性。可根据病变的数量、大小和组织学特征分级为:(1)晚期腺瘤(腺瘤1 cm,高度不典型增生,或具有管状或绒毛组织);(2)非 进 展 期 腺 瘤(腺 瘤 1 cm,无 进 展 组 织学)27;与病理结果比较,三者联合检测结直肠癌的Kappa 值为 0.633,提示与结肠镜检查具有较好一致性。本研究中粪便 SDC2、TFPI2、SFRP2 基因诊断结直肠癌的 AUC 值分别为 0.717、0.733、0.817,诊断性能好,可成为结直肠癌和癌前病变无创筛查的一种生物标志物,三者联合检测时,可提高其敏感度,本研究中SFRP2 基因的 AUC 值与三者联合检测的 AUC 值一致,考虑可能与联合检测所致特异度下降及样本量不足所致。本研究存在的不足,首先,本研究患者均来自同一地区,且样本量小存在选择偏倚。其次未独立行粪便隐血试验,未能同时验证甲基化检测与粪便隐血试验检测结直肠癌的敏感性比较。综上所述,粪便 SDC2、TFPI2、SFRP2 基因检测对结直肠癌的诊断价值较高,且联合检测可提高其敏感度,可成为结直肠癌早期筛查的一种无创检测方法。参考文献1Sung H,Ferlay J,Siegel RL,et al.Global cancer statistics 2020:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 058胃肠病学和肝病学杂志2023 年 8 月第 32 卷第 8 期Chin J Gastroenterol Hepatol,Aug 2023,Vol.32,No.8cancers in 185 countries J.CA Cancer J Clin,2021,71(3):209-249.DOI:10.3322/caac.21660.2 Simon 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