trizol法与常规法提取蛋白的比较.pdf

中国耳鼻咽喉头颈外科2 0 0 8 年4 月，第1 5 卷，第4 期T r i z o l 法提取大鼠耳蜗髓磷脂P 0 蛋白质汤黎1，郑明秀1，雷雳2，齐若梅3(1 昆明医学院第二附属医院耳鼻咽喉科，云南咽喉头颈科学教育部重点实验室(首都医科大学)昆明6 5 0 1 0 1；2 首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科，耳鼻北京10 0 7 3 0；3 卫生部北京老年病研究所，北京10 0 7 3 0)【摘要】目的用T r i z o l 法提取大鼠耳蜗髓磷B l i P O 蛋白质(m y e l i np r o t e i nP 0，P 0 蛋白)，与传统的蛋白裂解液裂解法比较蛋白提取效果，分析T r i z o l 法的优势。方法T r i z o l 法和传统的蛋白裂解液裂解法分别提取2 0 0g N 2 5 0gW i s t a r 大鼠(雌雄不限)耳蜗P 0 蛋白，用W e s t e r nB l o t 法及考马斯亮兰(B r a d f o r d)法比较两种方法提取P 0 蛋白含量及效果。结果T r i z o l 法提取的大鼠耳蜗P O 蛋白与传统的蛋白裂解液裂解法提取的含量相当，效果肯定。结论T r i z o l 法与传统的蛋白裂解液裂解法提取的蛋白效果相当，但T r i z o l 法简化了操作步骤，节省了单独提取蛋白质所需的蛋白酶抑制剂，节约样本，节省时间，提高工作效率，减少了蛋白和核酸降解的机会，有着更好的前景。【关键词】大鼠：耳蜗：髓磷脂P 0 蛋囱质T h ei n v e s t i g a t i o no ft h em e t h o do fe x t r a c t i n gt h er a t。Sc o c h l e am y e l i np r o t e i nz e r ow i t hT r i z o lT A N GL i l，Z H E N GM i n g x i u l L E IL 产Q R u o m e i 8(1D e p a r t m e n to fO t o I a r y n g o I o g yH e a da n dN e c kS u r g e r y，t h eS e c o n dA f f i l i a t e dH o s p i t a l Io fK u n m i n gM e d i c a lC o l l e g e，K u n m i n g，Y u n n a n【，6 5 0 10 1，C h i n a；2D e p a r t m e n to fO t o I a r y n g O I O g yH e a da n dJ N e c kS u r g e r y，B e i j i n gT o n g r e nH o s p i t a l，C a p i t a lM e d i c a lU n i v e r s i t y。K e yL a b o r a t o r yo fO t o l a r y n g o l o g yH e a da n d内耳螺旋神经节及蜗神经髓鞘上存在髓磷脂P 0 蛋白质(m y e l i np r o t e i nP 0，P 0 蛋白)，相对分子量为3 00 0 0”。内耳P O 蛋白可能是某些自身免疫性内耳病的自身抗原m2 1。大鼠内耳P 0 蛋白与核酸水平的研究无论是对于内耳功能的深入了解，还是对内耳疾病如感基金项目：国家自然科学基金资助项目(3 0 4 7 1 8 6 9)第一作者简介及通讯：汤黎，女，山东人，在读医学硕士，主要研究方向为耳科学。E m a i l：l i l y _ 4 1 3 1 2 6 c o m通讯作者：雷雳(E m a i l：k u n h a n _ 2 0 0 5 y a h o o c o m c n)N e c kS u r g e r y(C a p i t a lM e d i c a lU n i v e r s i t y)，M i n i s t r yo fE d u c a t i o n，B e i j i n g。10 0 7 3 0，C h i n a；3B e i j i n gI n s t i t u t eo fS e n i l eD i s e a s eo fM i n i s t r yo fP u b l i cH e a l t h，B e i j i n g，10 0 7 3 0，C h i n a)C o r r e s p o n d i n ga u t h o r：L E IL i(E m a i l：k u n h a n _ 2 0 0 5 y a h o o c o m c n)【A B S T R A C T】O B JE C T I V ET oe x t r a c tr a t sc o c h l e am y e l i np r o t e i nP 0b yT r i z o Ia n dc o m p a r e dw i t ht h ep r o t e i ne x t r a c t i n gm e t h o do fd e c o m p o s i t i o nf l u i di no r d e rt of i n dt h ea d v a n t a g eo fT r i z o lm e t h o d M E T H O D SC o c h l e am y e l i np r o t e i nP 0o ft h eW i s t a rr a t(2 0 0 9-2 5 0 9)w a se x t r a c t e db yT r i z o la n dt h et r a d i t i o n a lp r o t e i nd e c o m p o s i t i o nf l u i dc r a c ks o l u t i o ns e p a r a t e l y a u t h e n t i c a t e db yW e s t e r nB l o t t i n ga n dB r a d f o r d R E S U L T ST h ec o n t e n ta n de f f e c to ft w om e t h o d So fe x t r a c t i n gr a t。Sc o c h l e am y e l i np r o t e i nP 0a r es i m i l a r C O N C L U S I O NT h ee 仟e c to ft w om e t h o d so fe x t r a c t i n gt h ep r o t e i nw a ss i m i l a r，b u tt h em e t h o do fT r i z o Ih a d Im o r ea d v a n t a g e s S u c ha sI tc a ns i m p l i f yt h es e q u e n c eo fo p e r a t i o n，s a v et h et i m e，e n h a n c et h ew o r k i n ge f f i c i e n c y，m o r e o v e rr e d u c et h ep o s s i b i l i t yo fI p r o t e i na n dR N Ad e g r a d a t i o n S Ot h eT r i z o Im e t h o dh a st h eb e t t e rp r o s p e c t【K e yw o r d s R a t s；C o c h l e a；M y e l i nP 0P r o t e i n音神经性聋、梅尼埃病、听神经病等发病机制的研究都具有重要的意义，其中如何有效提取至关重型3 1。目前国内尚缺乏对活体动物实验中大鼠耳蜗P 0 蛋白提取的相关文献报道，本实验通过蛋白免疫印迹(W e s t e r nB l o t)法与考马斯亮兰法将T r i z o l 法对大鼠耳蜗P 0 蛋白的提取效果和传统的蛋白裂解液裂解法进行比较，分析T r i z o l 法的优势。1 1材料。T r i z o l 试剂(购自i n v i t r o g e n 公司)；19 0C H I NA R C HO T O L A R Y N G O LH E A DN E C KS U R G A p r i l2 0 0 8，V 0 1 15，N o 4 中国耳鼻咽喉头颈外科2 0 0 8 年4,q，第1 5 卷，第4 期T r i t o n X-10 0(购自S I G M A 公司)：P M S F、L e u p e p t i n(购自S l G M A 公司)；抗M P Z 抗体(购自A b c a m公司)，抗口-a c t i n 抗体(购自S a n t aC r u z 公司)；E D T A、P D T C、D T T、考马斯亮蓝、二巯基乙醇、过硫酸氨、牛血清白蛋白(B S A)、吐温2 0、p r o t e i nm o l e c u l a rw e i g h tm a r k e r、E C L、硝酸纤维素膜、3 M M滤纸、显影液、定影液、胶片(为柯达公司产品)，均由北京医院老年病研究所免疫室提供。2 0 0gN 2 5 0gW i s t a r g ：鼠(雌雄不限)，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，质量免疫检验认证合格01 2 方法。将W i s t a r 大鼠2 0 只，随机分为两组，T r i z o l 法提取为一组，传统蛋白裂解液法为另一组。用3 5 水合氯醛以(3 0,-4 0)m g 10 0g(体重)腹腔注射麻醉，断颈处死，迅速剥离双侧耳蜗，即刻于无酶环境中在解剖显微镜下用自制钢针挑出耳蜗蜗轴，放人液氮中待用。1 2 1T r i z o l 法提取大鼠耳蜗组织蛋白。液氮下将大鼠耳蜗组织研磨成粉，加入3 0 0p lT r i z o l 试剂，迅速混匀，入1 5m I 的E p p e n d o r f 管，室温静置5 10 分钟，加氯仿1 0 0U I，徒手剧振5 0 下，室温静置1 0 分钟，4 1 30 0 0r p m 离心1 5 分钟。此时分三层，上层为R N A 成份、中层为D N A 成份、下层为蛋白成份。取上清人新管(提R N A 用)，下层沉淀力1 1 2 0 0p l 无水乙醇混匀，室温静置5 分钟，4 5 5 0 0r p m 离心1 0 分钟，取上清人新的E p p e n d o r f 管，加异丙醇(沉淀蛋白)1m l，充分混匀，室温静置1 0 分钟，4 1 30 0 0 r p m 离心1 0分钟，弃上清，用含0 3m o l L 盐酸胍的9 5 乙醇1m I洗涤蛋白沉淀(可用超声震碎)，室温静置2 0 分钟。4 1 30 0 0 r p m 离心1 0 分钟弃上清，如此反复3 次，后用同样方法用无水乙醇洗涤一次，真空抽千1 0 分钟左右，用现配的1 S D S 溶液溶解蛋白j 不溶物最后4 1 20 0 0 r p m 离心1 0 分钟去除，得蛋白(-I-2 0 或-8 0 备用)。3 S D S 和2-巯基乙醇(9：1)，加入O 1 的溴酚蓝，混匀配成蛋白样本处理液，处理液与样本1：2 的比例混匀处理，沸水煮5 分钟，待用。1 2 2传统蛋白裂解液裂解法。取2 0m l 裂解缓冲液(6 0 5gT r i s、1 4 6gN a c l、1 4 6gE D T A 溶于5 0 0m l 超纯水中，盐酸调节p H 值至7 2，加入T r i t o nX-1 0 0(1)、P M S F(1m m o l L)、L e u p e p t i n(10 0U g m I)、ED T A(5mm o I l L)、E G T A(5m m o I，L)、D T T(1 0m m o l L)配成蛋白裂解液。液氮下将螺旋神经节组织研磨成粉，将配好的裂解处理液2 0 0U 咖入混匀，超声震碎蛋白，室温下t5 0 0r p m5 分钟，得蛋白。3 S D S 和2 一巯基乙醇(9：1)，加入O 1 溴酚蓝，混匀配成蛋白样本处理液，处理液与样本1：2 L L 例混匀，煮沸5 分钟待用。1 3T r i z o l 法与传统的蛋白裂解液裂解法提取大鼠耳蜗P 0 蛋白比较。本研究采用W e s t e r nB l o t 及考马斯亮兰法来检测蛋白，鉴定所提蛋白的质量。1 3 1考马斯亮兰法测蛋白浓度。0 1m g，m I 考马斯亮兰溶液，用牛血清白蛋白(B S A)配制标准品(分别配成0 9m g，m I、0 8m g m l、0 6m g，m I、0 4m g，m I、0 2m g，m I、0 _ 1m g，m l、0 0 5m g，m I)。酶标板每孔加标准品及蛋白样品各8U l，并每孔加考马斯亮兰应用液2 0 0p l，混匀反应后，单波长滤光值5 7 5n m 下读值。做标准曲线，计算样品浓度。1 3 2W e s t e r nB l o t 法。两组各自随机任取三个处理好的蛋白样本用1 2 的S D S P A G E，行S D S-聚丙烯酰胺凝胶电泳h5 1，具体条件为：1 0 0V 电压下电泳1 5 小时，用硝酸纤维素膜半于转转膜，1 B A S4 封闭过夜：0 4(P B S+t w e e n)液洗洗膜，加P 0 蛋白抗体或做内参的声-a c t i n 抗体(一抗)，室温下2 5 小时，再次洗膜后加辣根酶标记的兔抗羊I g G(二抗)，室温下1 5 小时，彻底洗膜，E C L 显影液浸泡硝基膜并用X 线胶片暗室曝光显影摄片。2 1考马斯亮兰法OT r i z o l 法提取的蛋白浓度稳定，平均浓度为O 1 0 9 1 7m g，m I：传统的蛋白裂解液裂解法提取的蛋白浓度亦平稳，平均浓度为0 1 1 1 2 0 6m g，m I。两种方法所提取蛋白浓度相当。露雾W e s t e r nB l o t 法。两种方法均可见一条带(图1)。用B a n d S c a n 灰度分析软件对条带进行灰度分析，经过p-a c t i n 校正后灰度结果为：传统方法提取蛋白的条带校正灰度为1 0 3 9 2 7 2 0 8 5，T r i z o l 法提取蛋白的条带校正灰度为1 0 3 6 2 5 2 3 8 1。比较两种方法提取的蛋白条带灰度所占百分比，对比直方图说明所提大鼠耳蜗P 0 蛋白化学完整性好，皆可与抗体有效结合，T r i z o l 法所提蛋白与传统的蛋白裂解液裂解法比较，P 0 蛋白提取效果差异不大(圈2)。图1T r i z o l 法(1、2、3)与传统的蛋白裂解液裂解法(4、5、6)提取蛋白l 拘W e s t e r nB l o t 结果圜内耳发育和正常功能的维持涉及众多基因，据推C H I NA R C HO T O L A R Y N G O LH E A DN E C KS U R G A p r i l2 0 0 8，V 0 1 15，N o 419 1 中国耳鼻咽喉头颈外科2 0 0 8 年4 月，第1 5 卷，第4 期中，T r i z o l 能迅速使R N A 酶和蛋白酶失活，避免R N A 和蛋白质被降解，保持R N A 完整性：胍盐能最大限度地抑制R N A 酶和蛋白酶；加入氯仿后溶液分为水相和有机相，R N A 在水相中，迅速使R N A、蛋白质和D N A 分开；异丙醇能够挤去蛋白质中的水分。图2 两种方法提取蛋白条带灰度酉分比对比我们的研究结果发现T r i z o l 法提取蛋白质量稳定，测内耳表达的基因估计有1 0 0 0 个左右，表达的蛋白质完整性良好，与传统方法提取的蛋白质量相当。采用则多达5 0 0 0-100 0 0【6】，这与内耳功能的复杂性和独特T r i z o l 法提取蛋白的同时，用同一份样本也能提取所需性一致。与其他特殊感觉系统相比，内耳研究、尤其在的核酸成分，因此，同一份样本完全能同时获得高纯度分子和蛋白核酸水平明显滞后，而不断进步的蛋白质完整的R N A 和蛋白质。把R N A 和蛋白质放在同一份样组学研究方法为内耳表达蛋白的分离和鉴定提供了有本中提取可比性好，简化了操作步骤，节省时间，提高力工到L 剐。对微量组织细胞研究，用总R N A 提取试剂工作效率，减少R N A 降解的机会，节省了单独提取蛋T r i z o l 试剂同时提取R N A 和蛋白的设想开始被提出并越白质所需的蛋白酶抑制剂。目前，对于微量组织尤其是来越受到注视。实验表明蛋白质和R N A 的完整性取决耳蜗组织，同时提取蛋白和R N A 的报道不多，T r i z o l 法于最大限度地避免提纯过程中内源及外源性的核糖核的优势和可行性为我们在研究某些自身免疫性内耳病提酸酶(R N A 酶)和蛋白酶对R N A 和蛋白质的降解，对R N A供参考。在活体动物实验尤其是小量甚至微量组织如大酶、蛋白酶的强烈抑制是防止降解的有效方法。T r i z o l鼠耳蜗螺旋神经节P O 蛋白的研究中，T r i z o l 法有着更好是提取总R N A 的即用型试剂，在样品裂解或匀浆过程的优势与前景。1 C a oM Y，D u p r i e zV J，R i d e rM H，e ta 1 M y e l i np r o t e i nP oa sap o t e n t i a la u t o a n t i g e ni na u t o i m m u n ei n n e re a rd i s e a s e F A S E BJ，1 9 9 6，1 0：1 6 3 5-1 6 4 0 2 B o u l a s s e lM R，D e g g o u jN，T o m a s iJ P，e ta 1 I n n e re a ra u t O a n t b o d i e sa n dt h e i rt a r g e t si np a t i e n t sw i t ha u t o i m m u n ei n n e re a rd i s e a s e s A c t aO t o l a r y n g o l，2 0 0 1，12 1：2 8-3 4 3 M a t s u o k aH，C h e n gK C，K r u gM S，e ta 1 M u r i n em o d e lo fa u t o i m m u n eh e a r i n gl o s si n d u c e db ym y e l i np r o t e i nP 0 A n nO t o lR h i n o lL a r y n g o l，19 9 9，10 8：2 5 5-2 6 4 4 汪家政，范明蛋白质技术手册北京：科学出版社，2 0 0 1：4 2 _ 4 7，9 0，2 3 1-2 3 8 5 于栋桢，龚树生，杨燕珍，等制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离与纯化豚鼠内耳抗原中华耳鼻咽喉科杂志，2 0 0 1，3 6：6 1 6 A n d e r s o nN L。P o l a n s k iM，P i e p e rR，e ta 1 T h eh u m a np l a s m ap r o t e o m e：an o nr e d u n d a n tI i s td e v e l o p e db yc o m b i n a t i o no ff o u rs e p a r a t es o u r c e s M o lC e l lP r o t e o m i c s，2 0 0 4，3：3 1 1-3 2 6 7 申卫东，韩东一大鼠内耳表达蛋白质组的2-D E 分离和初步鉴定中华耳科学杂志，2 0 0 7，5：8 5 8 8 8 T h a l m a n nI I n n e re a rp r o t e o m i c s：af a do rh e a rt os t a y B r a i nR e s。2 0 0 6 1 0 9 1：1 0 3-1 1 2(收稿日期：2 0 0 8-0 1-3 0)编辑沈懿19 2C H I NA R C HO T O L A R Y N G O LH E A DN E C KS U R G A p r i l2 0 0 8，V o i 15，N o 4 Trizol法提取大鼠耳蜗髓磷脂P0蛋白质Trizol法提取大鼠耳蜗髓磷脂P0蛋白质作者：汤黎，郑明秀，雷雳，齐若梅，TANG Li，ZHENG Mingxiu，LEI Li，QI Ruomei作者单位：汤黎,郑明秀,TANG Li,ZHENG Mingxiu(昆明医学院第二附属医院耳鼻咽喉科,云南,昆明,650101)，雷雳,LEI Li(首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科,耳鼻咽喉头颈科学教育部重点实验室(首都医科大学),北京,100730)，齐若梅,QI Ruomei(卫生部北京老年病研究所,北京,100730)刊名：中国耳鼻咽喉头颈外科英文刊名：CHINESE ARCHIVER OF OTOLARYNGOLOGY-HEAD AND NECK SURGERY年，卷(期)：2008，15(4)被引用次数：0次 参考文献(8条)参考文献(8条)1.Cao MY.Dupriez VJ.Rider MH Myelin protein Po as a potential autoantigen in autoimmune inner eardisease 19962.Boulassel MR.Deggouj N.Tomasi JP Inner ear autoantibodies and their targets in patients withautoimmune inner ear diseases 20013.Matsuoka H.Cheng KC.Krug MS Murine model of autoimmune hearing loss induced by myelin protein P019994.汪家政.范明 蛋白质技术手册 20015.于栋桢.龚树生.杨燕珍 制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离与纯化豚鼠内耳抗原期刊论文-中华耳鼻咽喉科杂志20016.Anderson NL.Polanski M.Pieper R The human plasma proteome:a nonredundant list developed bycombination of four separate sources 20047.申卫东.韩东一 大鼠内耳表达蛋白质组的2-DE分离和初步鉴定期刊论文-中华耳科学杂志 20078.Thalmann I Inner ear proteomics:a fad or hear to stay 2006 相似文献(10条)相似文献(10条)1.期刊论文 郑鸿燕.邰浩清.曾水林.ZHENG Hong-Yan.TAI Hao-qing.ZENG Shui-lin 当归补血汤对耳蜗干细胞鼓阶内移植治疗药物性感音神经性耳聋大鼠增效作用研究-东南大学学报（医学版）2010,29(2)目的:观察当归补血汤对耳蜗干细胞移植治疗感音神经性耳聋大鼠增效作用.方法:感音神经性耳聋大鼠分为耳蜗干细胞移植组、当归补血汤组和空白对照组3组.体外培养耳蜗干细胞进行内耳移植,耳蜗干细胞移植组将耳蜗干细胞悬液移植入内耳耳蜗结构,当归补血汤组将含有当归补血汤的耳蜗干细胞悬液移植入内耳耳蜗结构,空白对照组移植生理盐水.分别于术后1、3、6和12个月采用听觉脑干诱发电位方法检测模型大鼠的听力恢复情况,处死大鼠,通过免疫荧光染色方法观察移植的耳蜗干细胞在内耳存活、分化和迁移情况.结果:从E14大鼠耳蜗分离的组织,经原代和传代培养后,可获得大量未分化悬浮生长的Nestin阳性细胞团,Brdu表达阳性,说明是具有自我更新和增殖潜能的干细胞.免疫荧光检测发现在耳蜗干细胞移植组、当归补血汤组在移植针道两侧可见移植的干细胞,有些还迁移到基底膜区.存活的细胞部分呈 Myosin A阳性染色.与耳蜗干细胞移植组比较,当归补血汤组 Myosin A阳性染色细胞数量较多,差异有统计学意义(P0.05).听觉脑干诱发电位结果显示当归补血汤组的感音神经性耳聋模型大鼠听力恢复情况较耳蜗干细胞移植组和对照组好,差异有统计学意义(P0.05),Wister 12月龄组大鼠ABR阈值(50.467.87)dBpeSPL较3月龄组大鼠(40.001.50)dBpeSPL升高,耳蜗相应部位LDH、ChE活性分别升高和下降(P0.05);SHR12月龄组大鼠ABR阈值(64.107.26)dBpeSPL较3月龄组大鼠(40.001.66)dBpeSPL明显升高,耳蜗相应部位LDH、ChE活性明显升高和下降(P0.01).结论 Wister 12月龄大鼠存在老年性聋,高血压可致大鼠耳蜗糖代谢发生障碍、神经递质分泌异常,这些因素都可能加重听觉系统的老化.6.期刊论文 凡启军.黄治物.梅玲.肖伯奎 水杨酸钠作用后大鼠耳蜗热休克蛋白27表达的研究-听力学及言语疾病杂志2005,13(1)目的研究水杨酸钠作用后大鼠耳蜗热休克蛋白27(heat shock protein27,HSP27)的表达特点,探讨HSP27在水杨酸钠耳毒性中的作用及意义.方法用免疫组化SP法结合图像分析技术检测水杨酸钠注射后大鼠耳蜗HSP27的表达.结果 HSP27在正常及水杨酸钠作用后大鼠耳蜗各回均有不同程度的染色,主要阳性部位是Corti器、螺旋神经节、螺旋韧带和血管纹.但水杨酸钠作用后HSP27在耳蜗各阳性部位的表达均明显增强,其中以Corti器的表达更明显,P值均小于0.01.结论 HSP27在大鼠耳蜗组织表达有选择性,水杨酸钠能够明显诱导HSP27在大鼠耳蜗中的表达,HSP27可能对耳蜗形态结构损害后的修复起作用,且与耳鸣的产生发展可能有关.7.学位论文 袁军 铁缺乏对大鼠耳蜗肌动蛋白影响的实验研究 2000 目的:观察不同饲养期铁缺乏大鼠耳蜗组织的肌动蛋白相对含量变化及耳蜗毛细胞肌动蛋白免疫组化反应,研究铁缺乏对大鼠耳蜗肌动蛋白的影响;比较铁缺乏大鼠大鼠与听阈正常大鼠耳蜗肌动蛋白的含量及分布变化,探讨铁缺乏引起听毛细胞损伤的可能机制.结论:铁缺乏引起的感音神经性聋大鼠耳蜗中肌动蛋白相对含量明显减少;铁缺乏引起的感音神经性聋大鼠耳蜗内肌动蛋白的免疫反应活性降低,在螺旋器毛细胞中此变化尤为显著;铁缺乏期长短对耳蜗内肌动蛋白相对含量及免疫反应活性的变化无明显影响.8.期刊论文 傅窈窈.张天宇.赵晖.李雯.FU Yao-yao.ZHANG Tian-yu.ZHAO Hui.LI Wen 地塞米松鼓室内注射后在大鼠耳蜗中的分布-中华耳鼻咽喉头颈外科杂志2009,44(3)目的 观察不同浓度地塞米松鼓室内注射后在大鼠耳蜗中的分布及代谢规律.方法 144只SD大鼠全麻下鼓室内分别注射5 mg/ml、10 mg/ml和20mg/ml地塞米松磷酸钠,并分别于注射后5 min、10 min、15 min、30 min、1 h、2 h,4 h,8 h、12 h、24 h、48 h及72 h处死动物,每个浓度、每个时间点4只大鼠.耳蜗标本处理后冰冻切片,免疫荧光法观察地塞米松在耳蜗组织中随时间的变化情况,并进行荧光半定量分析.另取4只正常sD大鼠采用免疫荧光方法 观察糖皮质激素受体在耳蜗内的分布.结果 地塞米松自注射后15 min起在耳蜗内始被检测到,30 min达到高峰,主要分布在螺旋韧带,Corti器和螺旋神经节.10 mg/ml组与20 mg/ml组各时间点的地塞米松浓度均高于5mg/ml组,持续时间亦从低浓度组的48 h延长至72 h.糖皮质激素受体亦主要分布于Corti器,螺旋神经节和螺旋韧带.结论 地塞米松鼓室内注射后可迅速到达耳蜗组织细胞中,其分布与糖皮质激素受体基本一致.增加地塞米松浓度可以提高其在耳蜗组织中的分布浓度,并延长其存留时间.9.期刊论文 杨卫平.于黎明.胡吟燕.郭维.陈洪文 脉冲噪声暴露后早期大鼠耳蜗外毛细胞死亡时程观察-解放军医学杂志2006,31(6)目的观察强脉冲噪声暴露后早期大鼠耳蜗毛细胞损伤发展的规律.方法将大鼠暴露于平均压力峰值级为154dBSPL的脉冲噪声100发,分别于噪声暴露后10min、30min、3h、6h解剖取耳蜗,应用碘化丙锭(PI)标记耳蜗基底膜,荧光显微镜下观察脉冲噪声暴露后耳蜗毛细胞凋亡和坏死的时程特点.结果强脉冲噪声暴露后10min出现外毛细胞核染色质移位及凋亡小体,30min可见到少量肿胀的外毛细胞核,3h观察到少量外毛细胞核的缺失.6h耳蜗基底膜损伤区出现大片外毛细胞核缺失和部分微小球形固缩的外毛细胞核.结论耳蜗外毛细胞死亡发生于强脉冲噪声暴露后即刻,外毛细胞凋亡先于坏死.细胞凋亡过程迅速,强脉冲噪声暴露后6h耳蜗基底膜损伤区大部分死亡细胞已被清除.10.学位论文 宋巍 大鼠耳蜗大上皮嵴的分离和鉴定 2005 普遍认为噪音，耳毒性药物，老化以及各种疾病引起的毛细胞的缺失，变性，损伤是感音神经性聋的主要原因。但是毛细胞是位于内耳感觉上皮的终末分化细胞，以往的研究表明哺乳类耳蜗毛细胞损伤后是不能再生的。长期以来人们为了探讨毛细胞发育、分化、再生的机制而进行了不懈的努力，刺激毛细胞的再生从而修复受损的听力及平衡障碍一直是研究的主要方向。再生可能是重复正常发育中的毛细胞分化的过程。因此，理解毛细胞的分化有助于毛细胞再生的研究。哺乳类前庭毛细胞的发生也以与低等脊椎动物相似的方式源自感觉上皮内的前体细胞和支持细胞，但哺乳类耳蜗毛细胞的确切起源还不清楚，组织学研究表明内、外毛细胞在胚胎发育过程中可能分别起源于大、小上皮嵴。最近，大上皮嵴(greaterepithelialridge，GER)成为哺乳动物毛细胞再生研究的一个新热点。研究表明，大上皮嵴很可能是毛细胞的前体细胞群之一。毛细胞分化的正性调控基因Math1在体外培养的大鼠耳蜗中过度表达后，能诱导大上皮嵴形成大量新生毛细胞。一些参与毛细胞分化和再生的重要基因和生长因子受体如P27、Hes1、Math1和FGFR1等在不同时期的大上皮嵴表达，这些研究结果都表明大上皮嵴在毛细胞的分化和再生过程中起着重要的作用，是重要的细胞群，有可能是耳蜗毛细胞的前体细胞池之一。目前对大上皮嵴了解的不多，本课题的目的在于探讨利用酶消化和机械解剖相结合的方法分离出有活性的大上皮嵴。通过形态学比较，免疫组织化学染色，RT-PCR对所分离的大上皮嵴进行鉴定，原代培养以验证分离的大上皮嵴活性。一、大鼠耳蜗大上皮嵴的分离选取出生后0天的SD大鼠耳蜗，取出基底膜，将其放入含有嗜热菌蛋白酶和少许DNA酶的D-Hanks溶液中，37孵箱孵育25分钟进行酶消化，然后在高倍显微镜下进行机械分离。经过酶的作用后，耳蜗上皮组织和结缔组织之间的结合会变得较为疏松，用超细钨丝刀将包括GER、LER、IHC、OHC在内的一层大鼠耳蜗“上皮薄层组织片”(cochlearepithelialsheet，CES)自基底膜上铲下，然后再沿内毛细胞内侧小心的切下大上皮嵴。二、大鼠耳蜗大上皮嵴的鉴定1.形态学鉴定分离后的CES环氧树脂包埋，半薄切片，硼砂甲苯胺蓝染色；新生大鼠耳蜗OCT包埋冰冻切片，HE染色，光学显微镜观察，进行细胞形态比较。发现CES只含有耳蜗内的上皮组织，只有IHC、OHC、LER、GER和支持细胞，是纯净的上皮组织而没有任何的结缔组织。2.免疫组织化学(1)CES全层铺片免疫荧光标记，FITC-Phalloidin标记毛细胞，ZO1标记上皮细胞之间的紧密连接。Phalloidin绿色荧光和ZO1红色荧光显示了GER细胞、OHC和IHC的轮廓以及3排OHC和1排IHC及其与GER的位置关系。(2)在CES上分离GER过程中进行全层铺片FITC-Phalloidin免疫荧光染色，显示了在分离GER时钨丝刀偏向内侧切除GER，切除的GER不含有毛细胞，是纯净的GER。3.RT-PCRHes1基因是耳蜗毛细胞分化的负性调控基因，在胚胎期和出生后早期大鼠耳蜗中选择性的表达在大小上皮嵴。扩增Hes1基因，琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。RT-PCR取材于所分离的GER，同种新生大鼠肝脏组织作为对照。GER表达Hes1基因，肝脏组织对照呈阴性表达。4.GER的原代培养分离的GER细胞是否具有活性是下一步实验能否顺利进行的关键，因此我们将分离的GER进行原代培养以鉴定其活性。实验证明分离的GER具有活性，可以进行原代培养。本文链接：http:/