口蹄疫正向间接血凝试验操作要点.doc

口蹄疫正向间接血凝试验操作要点
免疫抗体检测是科学掌握动物免疫接种疫苗后抗体产生和消长变化的有效方法之一。口蹄疫正向间接血凝试验就是用口蹄疫抗原检测未知血清中是否含有口蹄疫抗体的血清学检测方法之一。近年来，此方法经常用于牲畜接种口蹄疫疫苗后能否产生抗体或抗体滴度能否达到免疫保护，以利于指导畜牧业生产。　　
一、原理 　　
用已知血凝抗原检测未知血清抗体的试验，称为正向间接血凝试验，亦称间接血凝。 　　
抗原与其对应的抗体相遇，在一定条件下形成抗原—抗体复合物。但这种复合物的分子团很小，肉眼看不见。将抗原吸附（致敏）在红血球表面，再与抗体结合，红血球便出现凝集现象，不仅肉眼能看见，而且反应的敏感性大大提高。口蹄疫正向间接血凝试验就是将口蹄疫纯化病毒致敏到绵羊红血球表面，制成口蹄疫血凝抗原，用于检测动物血清中的口蹄疫抗体水平。 　　
二、适用范围 　　
主要用于检测口蹄疫疫苗接种动物后血清抗体效价。 　　
三、器材 　　
1、 96孔110～120度V型医用血凝板，与血凝板大小相同的玻板。　　
2、 微量移液器与吸头。 　　
3、 口蹄疫血凝抗原（口蹄疫正向血凝诊断液）。 　　
4、 口蹄疫对照阴性血清。 　　
5、 口蹄疫对照阳性血清。 　　
6、 稀释液。　　
7、 待检血清（被检血清）。 　　
四、试验方法 　　
1、加稀释液 　　
在血凝板上1～6排的1～9孔；第7排的1～4孔；第8排的1～12孔各加稀释液50微升。 　　
2、稀释待检血清 　　
取1号待检血清50微升加入第1排第1孔，混匀（避免产生过多的气泡），取出50微升移入第2孔，混匀后取出50微升移入第3孔……直到第9孔混匀后取出50微升丢弃。此时第1排1～9孔待检血清的稀释度（稀释倍数）依次为：1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64，1:128，1:256，1:512。 　　
取2号待检血清加入第2排；取3号待检血清加入第3排……均按上法稀释，注意！每取一份血清时，必须更换吸头一个。 　　
3、稀释阴性对照血清 　　
在血凝板上的第7排第1孔加阴性血清50微升，倍比稀释至第4孔，混匀后从该孔取出50微升丢弃。此时阴性血清对照孔依次为：1:2，1:4，1:8，1:16。 　　
4、稀释阳性对照血清 　　
在血凝板上的第8排第1孔加入阳性血清50微升，倍比稀释至第12孔，混匀后从该孔取出50微升丢弃，此时阳性血清稀释倍数为1:2～1:4096。 　　
5、加血凝抗原 　　
被检血清各孔、阴性对照血清各孔、阳性对照血清各孔、稀释液对照孔均各加血凝抗原25微升。 　　
6、振荡混匀 　　
将血凝板置于微量振荡器上振荡1分钟，然后将血凝板放在白纸上观察各孔红血球是否混匀，不出现血球沉淀为合格。盖上玻板，静置于室温下1.5～2小时判定结果，也可延至翌日判定。 　　
7、 判定标准 　　
移去玻板，将血凝板放在白纸上，先观察阴性对照血清1:16孔，稀释液对照孔，应无凝集，或仅出现“+”凝集。 　　
阳性血清对照1:2～1:256各孔应出现“++~++++”凝集为合格。 　　
在对照孔合格的前提下，再观察待检血清各孔，以呈现“++”凝集的最大稀释倍数为该份血清的抗体效价。例如1号待检血清1～5孔呈现“++~++++”凝集，6~7孔呈现“++”凝集，第8孔呈现“+”凝集，第9孔无凝集，那么就可判定该份血清的口蹄疫抗体效价为1:128。 　　
接种O型口蹄疫灭活苗的猪群血清O型抗体效价达到1:128（或1:128以上）为免疫合格。 　　
五、注意事项 　　
1、试验前，必须仔细阅读试剂盒内的说明书。 　　
2、严重溶血或严重污染的血清样品不宜检测，以免发生非特异性反应。 　　
3、为确保试验判断准确，不得使用90度和130度血凝板。 　　
4、血凝板用后应及时在水龙头下冲净血球，再用蒸馏水或去离子水冲洗3次，甩干水分放　37℃　恒温箱内干燥备用。检测用具应煮沸消毒，再置于　37℃　恒温箱内干燥备用。 　　
5、每次检测做一份阴性、阳性和稀释液对照即可。