川芎蛋白-葡聚糖共聚物的制备工艺优化及其抗氧化性.pdf

为改善川芎蛋白（Ligusticum chuanxiong protein，LCP）的溶解性，提高其抗氧化性，采用响应面法优化川芎蛋白-葡聚糖（dextran，Dex）共聚物的制备工艺，并对所得川芎蛋白-葡聚糖共聚物（glycosylated Ligusticum chuanxiongprotein，GLCP）的抗氧化性进行研究。结果表明，GLCP 的最佳制备工艺为底物质量比 Dex颐LCP=1.8颐1、溶液 pH9、反应时间 153 min、加热温度 74 益。在此条件下，共聚物的接枝度为（35.21 依0.12）%。电泳结果表明，LCP 与 Dex 共价结合，且 GLCP 分子量大于 LCP；扫描电镜结果表明，LCP 呈近圆球形，而 GLCP 表面结构变得疏松多孔，呈蜂窝状；红外光谱结果表明：糖基化改变了 LCP 的二级结构。相较 LCP，GLCP 抗氧化性明显提高，当浓度为 1 mg/mL 时，羟自由基清除率为（65.91依1.93）%，ABTS+自由基清除率为（81.80依2.18）%。关键词：川芎蛋白；葡聚糖；糖基化；工艺优化；抗氧化性Preparation Process Optimization of Ligustrum chuanxiong Protein-Dextran Conjugate andIts Antioxidant PropertiesWANG Haiyan1，LI Jiaxuan1，WEI Lifen1，RUAN Jinghua2*，TANG Dongxin2，XIN Jiamin2，ZHA Xin2（1.College of Pharmacy，Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550025，Guizhou，China；2.The First Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang550001，Guizhou，China）粤遭泽贼则葬糟贼：Response surface methodology was employed to optimize the preparation conditions of Ligusticumchuanxiongprotein（LCP）-dextran（Dex）conjugate，so as to improve the solubility and antioxidant activity ofLCP.Furthermore，the antioxidant activity of glycosylated L.chuanxiong protein（GLCP）was investigated.Theresults showed that the optimal preparation conditions were as follows：substrate mass ratio Dex 颐 LCP of 1.8 颐 1，pH9，153 min，and 74 益，under which the degree of grafting of the obtained conjugate was（35.21依0.12）%.SDS-PAGE showed that the molecular weight of GLCP was higher than that of LCP.The results of scanningelectron microscopy showed that the LCP was nearly spherical，and GLCP had a honeycomb surface structurewhich was incompact and porous.The results of Fourier transform infrared spectroscopy（FTIR）showed thatglycosylation changed the secondary structure and significantly improved the antioxidant activity of LCP.Compared with LCP，1 mg/mL GLCP showed the scavenging abilities on hydroxyl and ABTS free radicals was（65.91依1.93）%and（81.80依2.18）%，respectively.运藻赠 憎燥则凿泽：Ligusticum chuanxiong protein；dextran；glycosylation；process optimization；antioxidant activity引文格式：王海燕，李佳璇，韦利芬，等.川芎蛋白-葡聚糖共聚物的制备工艺优化及其抗氧化性J.食品研究与开发，2023，44（17）：90-98.WANG Haiyan，LI Jiaxuan，WEI Lifen，et al.Preparation Process Optimization of Ligustrum chuanxiong Protein-DextranConjugateandItsAntioxidantPropertiesJ.Food Research and Development，2023，44（17）：90-98.应用技术90食品研究与开发圆园23 年 9 月第 44 卷第 17 期川芎蛋白（Ligusticum chuanxiong protein，LCP）为伞形科植物川芎的干燥根茎的分离蛋白。前期研究表明，LCP 提取率较高，且具有较好的抗氧化能力，但其溶解度较差，限制了其作为天然抗氧化剂在食品行业的应用1，所以有必要对 LCP 进行有效地改性处理。相比物理法（高压加工、高压均质化和高强度超声）和酶法（谷氨酰胺转胺酶、氧化酶和酶修饰）的改性方式，糖基化改性被称为“绿色工艺”，是自发进行的反应，无需添加化学物质，具有绿色、安全的优势。反应实质是蛋白质氨基与还原糖羰基的共价结合2，使得糖基化共聚物同时具有蛋白质的大分子特性和多糖的亲水特性，从而改善蛋白质溶解度，提高蛋白质的抗氧化性。葡聚糖（dextran，Dex）是一种中性多糖，具有还原性，是糖基化反应的必要条件之一，并且中性电荷可抑制蛋白质与多糖之间静电络合的形成3。其葡萄糖残基由 琢-1，6 键连接成线性链，具有很高的灵活性，可与蛋白质紧密缠绕，为糖基化下的分子间聚集提供强大的空间位阻4，是制备蛋白质-多糖共聚物的理想材料。本研究以接枝度（degree of grafting，DG）为评价指标，通过 Box-Behnken 响应面法优化川芎蛋白-葡聚糖共聚物（glycosylated Ligusticum chuanxiong protein，GLCP）制备条件，并对在最优条件下所得的 GLCP 进行抗氧化性研究。1材料与方法1.1材料与试剂川芎：四川千方中药股份有限公司；葡聚糖、考马斯亮蓝 R250、四硼酸钠、邻苯二甲醛、溴酚蓝：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；十二烷基硫酸钠：北京酷来搏科技有限公司；羟自由基清除能力试剂盒、2，2-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸2，2-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS自由基清除能力试剂盒：苏州格锐思生物科技有限公司；以上试剂均为分析纯。1.2仪器与设备MINIB-100I 金属浴：杭州米欧仪器有限公司；MiniPROTEAN Tetra Cell 电泳仪：美国 BIO-RAD 公司；UV-6000PC 紫外分光光度计：上海元析仪器有限公司；Qua-nta 450 FEG 扫描电镜：美国 FEI 公司；Nicolet Is50 傅里叶变换红外光谱：赛默飞世尔（上海）仪器有限公司。1.3方法1.3.1LCP 的提取采用饱和酚法5提取 LCP。称取脱脂后川芎药材粉末 0.5 g，加入预冷丙酮 3 mL，置于-20 益冰箱浸提30 min。3 000 r/min 离心 5 min，弃去上清液，分别加入80%丙酮、0.1 mol/L 乙酸铵的 80%甲醇液洗涤。沉淀中加入细胞裂解液 2.5 mL 重悬，再加入 Tris-饱和酚溶液2.5mL，充分摇匀，静置 1h。3000r/min 离心 5min，收集上清液，加入 3 倍量 0.1 mol/L 乙酸铵的 80%甲醇液，置于-20 益冰箱，放置过夜。3 000 r/min 离心 5 min，收集沉淀，分别用甲醇、80%丙酮洗涤沉淀，-80 益冷冻干燥即得 LCP。1.3.2DG 测定采用邻苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）法6，称取 OPA 80 mg 溶解于 2 mL 的甲醇中，依次加入 20%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液 5 mL、0.1 mol/L 硼砂溶液 50 mL，茁-巯基乙醇 200 滋L，定容至 100 mL。取配制的 OPA 试剂 4 mL 加入 GLCP 溶液200 滋L，混匀，于 35 益水浴锅中反应 2 min，340 nm 测其吸光值 A1，相同条件下加入 200 滋L LCP 溶液为空白，测定吸光值 A0，二者之差为自由氨基的净吸光值，通过以下公式计算接枝度（D，%）。D=A0-A1A0伊1001.3.3GLCP 的单因素考察采用湿热法7，将提取的 LCP 与 Dex 配制成一定比例的溶液，磁力搅拌 1 h，调 pH 值，置于水浴中反应，反应后迅速冷却，得到 GLCP。1.3.3.1不同底物质量比对 DG 的影响按照 3 颐 1、2 颐 1、1 颐 1、1 颐 2、1 颐 3 的底物质量比准确称取 Dex 与 LCP，加入去离子水 4 mL 溶解，磁力搅拌 1 h，用 0.1 mol/L 的氢氧化钠调节溶液的 pH 值至9.0。将调好 pH 值的溶液放入水浴加热反应，设定反应温度为 70 益、反应时间为 150 min，反应结束后立即用冷水停止其反应，得糖基化产物，对其接枝度进行测定。单因素试验均重复 3 次。1.3.3.2不同 pH 值对 DG 的影响参照 1.3.3.1 方法，分别选取反应 pH 值为 7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，其他条件固定为底物质量比 2 颐 1，反应温度 70 益、反应时间 150 min。1.3.3.3不同反应时间对 DG 的影响参照 1.3.3.1 方法，分别选取反应时间为 90、120、150、180、210 min，其他条件固定为底物质量比 2 颐 1、pH9.0、反应温度 70 益。1.3.3.4不同反应温度对 DG 的影响参照 1.3.3.1 方法，分别选取反应温度为 30、50、70、90、110 益，其他条件固定为底物质量比 2 颐 1、pH9.0、反应时间 150 min。1.3.4糖基化川芎蛋白响应面优化试验建立根据单因素试验结果分析，以 A 底物质量比、BpH 值、C 反应时间、D 反应温度为自变量，DG 为响应值，采用 Design Export 8.0.6 软件分析，通过四因素三应用技术91食品研究与开发圆园23 年 9 月第 44 卷第 17 期水平优化制备过程。每组平行试验 3 次，响应面优化试验因素和水平见表 1。1.3.5十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）的测定配制 12%分离胶，5%浓缩胶，进行垂直电泳。样品和 3 倍量溴酚蓝缓冲液涡旋混合，置于 100 益金属浴加热反应 10 min，待冷却后，取样品 10 滋L，标准蛋白（Maker）5 滋L 上样。初始电压为 80 V，待指示剂进入分离胶后电压调为 120 V，距离电泳板底部 0.5 cm 时，停止电泳。电泳完毕，取出胶片，置于考马斯亮蓝 R-250中染色，凝胶背景透明为止，于脱色液（冰醋酸 颐 甲醇 颐水=1 颐 4 颐 10，体积比）中进行脱色处理，直至条带清晰，观察分子量。1.3.6扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）观察取少量 LCP 和 GLCP 样品固定于双面导电胶上，进行喷金处理，厚度约为 10 nm 的电镀层，在 20 kV 电压下进行电子扫描，拍摄具有代表性样品图。1.3.7傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infraredspectrometer，FTIR）的测定分别取适量 LCP、GLCP 干燥冻干粉末，按照 1 颐100（质量比）加入溴化钾进行压片，用傅里叶变换红外光谱仪做全波段扫描（4 000耀400 cm-1），扫描次数32 次。1.3.8抗氧化性的测定1.3.8.1羟自由基清除能力的测定取浓度为 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的样品溶液各 125 滋L，分别加入试剂盒中试剂一、试剂二、试剂三各 125 滋L 和蒸馏水 500 滋L 作为测定组。样品溶液125 滋L，试剂一、试剂二各 125 滋L 和蒸馏水 625 滋L 作为对照组。试剂一、试剂二、试剂三各 125 滋L 和蒸馏水625 滋L 作为空白组。以 VC为阳性对照。混匀后，37 益水浴反应 20 min，510 nm 下测吸光值。X=A0-（A1-A2）A0伊100式中：X 为羟自由基清除率，%；A0为空白组吸光值；A1为测定组吸光值；A2为对照组吸光值。1.3.8.2ABTS+自由基清除能力的测定取浓度为 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的样品溶液各 50 滋L，加入试剂盒中工作液 950 滋L 作为测定组。样品溶液 50 滋L，无水乙醇 950 滋L 作为对照组。无水乙醇 50 滋L 和工作液 950 滋L 作为空白组。以 VC为阳性对照。混匀后，25 益避光反应 6 min，734 nm 下测吸光值。Y=1-（A1-A2）A0伊100式中：Y 为 ABTS+自由基清除率，%；A0为空白组吸光值；A1为测定组吸光值；A2为对照组吸光值。1.4数据处理所有试验均重复 3 次，数据以平均值依标准差表示，使用 Excel 2019 进行处理；Design Expert 8.0.6 进行响应面优化；Origin 2018 绘图。2结果与分析2.1单因素试验糖基化反应是蛋白质游离氨基和还原糖羰基之间的共价结合，接枝度表示反应前后的游离氨基酸含量的变化，以此判断糖基化反应程度，接枝度越大，说明反应越完全8。单因素试验结果见图 1。由图 1A 可知，随 LCP 添加量的增大，接枝度呈现先增加后降低的趋势，在底物质量比为 2 颐 1 时，接枝度达到最大值为（35.40依0.56）%。可能是体系中糖比例表 1响应面优化试验因素水平Table 1Factors and levels of response surface optimization水平因素A 底物质量比B pH 值C 反应时间/minD 反应温度/益-13颐18.01205002颐19.01507011颐110.01809040353025203颐12颐11颐3底物质量比1颐11颐2A40353025207.08.011.0pH 值9.010.0B应用技术92食品研究与开发圆园23 年 9 月第 44 卷第 17 期较高时，活性位点接触机率较大，有利于糖基化进程。当蛋白质比例较大时，由于蛋白质的空间位阻影响，活性位点接触机率降低，糖基化反应受到影响，从而接枝度降低9。综合考虑选择底物质量比为 3颐1、2颐 1、1颐1进行响应面优化试验。由图 1B 可知，随着 pH 值的增大，接枝度呈现先增加后降低的趋势，当 pH 值为 9.0 时，接枝度达到最大值（34.94依0.32）%。可能是随着 pH 值的增大，偏离等电点，溶解度增大，从而使游离氨基增加，羰氨结合，利于糖基化反应。但强碱条件下，LCP 易发生变性，蛋白质分子内部疏水基团暴露于分子表面10，而亲水基团相对较少，不与水相相溶，集聚成团，溶解度降低11，从而接枝度下降。综合考虑选择 pH 值为 8.0、9.0、10.0进行响应面优化试验。由图 1C 可知，随着反应时间的增长，接枝度呈现先增加后降低的趋势，在反应时间为 150 min 时，接枝度达到最大值（34.78依0.39）%。可能是随着反应进行，LCP 中游离氨基逐渐暴露，与 Dex 中羰基结合，进行糖基化反应，接枝度随着反应时间延长而增大。反应150 min 后，达到美拉德反应后期，生成类黑素、还原酮，与蛋白质发生交联作用，从而阻碍糖基化改性12。综合考虑选择反应时间 120、150、180 min 进行响应面优化试验。由图 1D 可知，随着反应温度的升高，接枝度呈现先增加后降低的趋势，在反应温度为 70 益 时，接枝度达到最大值（35.07依0.63）%。可能是由于葡聚糖分子含有多个羟基，引入亲水羟基与蛋白质分子结合，一定程度上保护了蛋白质，使其不易聚集，增大了溶解度，从而体系中自由氨基增加，接枝度随之增大。随着温度的升高，蛋白质在高温条件下，容易发生变性，空间结构遭受破坏，链与链之间分子间氢键易团聚13，导致溶解度降低，自由氨基的减少，从而使接枝度降低。综合考虑选择加热温度 50、70、90 益进行响应面优化试验。2.2响应面优化糖基化川芎蛋白制备工艺2.2.1响应面优化试验设计及结果每组样品平行测定 3 次，取平均值，进行统计分析。Design Expert 8.0.6 软件进行响应面设计及结果分析，如表 2 所示。403530252090120210反应时间/min150180C40353025203050110反应温度/益7090DA.底物质量比；B.pH 值；C.反应时间 D.反应温度。图 1各单因素对接枝度的影响Fig.1Effects of single factors on the degree of grafting表 2响应面试验方案与结果Table 2Scheme and results of response surface test试验号A 底物质量比B pH 值C 反应时间D 反应温度接枝度/%11-10031.512-1-10027.333110027.174-110032.98500-1-125.876001-125.50700-1126.808001128.859100-126.6110-100-127.5411100128.8512-100131.83130-1-1026.471401-1026.53150-11027.3616011028.851710-1026.9918-10-1027.7519101028.4820-101029.43210-10-126.6122010-128.10230-10128.2924010130.1525000035.9226000034.4327000034.6228000035.5529000034.99应用技术93食品研究与开发圆园23 年 9 月第 44 卷第 17 期由表 2 得拟合方程为 Y=35.10-0.60A+0.52B+0.67C+1.21D-2.50AB-0.047AC-0.51AD+0.36BC+0.092BD+0.61CD-2.40A2-3.04B2-4.60C2-3.84D2。2.2.2方差分析结果响应面试验方差分析见表 3。如表 3 所示，由模型 F 检验值可知，F=58.34，P0.05，失拟项不显著，表明回归模型与试验实测值拟合度较好，误差较小，可以使用该回归方程预测糖基化川芎蛋白的接枝度。根据各因素 F值的比较可知，各因素对响应值影响大小为反应温度反应时间底物质量比pH 值。通过对回归方程系数的显著性分析，可知一次项 A、B、C、D 的 P值均小于 0.01，表明反应温度、反应时间、底物质量比、pH 值对接枝度的影响极显著；二次项 A2、B2、C2、D2影响极显著（P0.01）；交互项 AB 影响极显著（P0.05）。R2=0.983 1，R2Adj=0.966 3，表示所建立的模型置信度较高，能够很好地反映自变量与响应值之间的关系。2.2.3因素交互作用利用 Design Expert 8.0.6，分析底物质量比、pH 值、反应时间、反应温度交互作用对接枝度的影响，结果见图 2耀图 7。表 3响应面试验方差分析Table 3Analysis of variance of response surface test方差来源平方和自由度均方F值P值显著性模型279.921419.9958.340.000 1*A 底物质量比4.3814.3812.750.003 0*B pH 值3.2113.219.380.008 4*C 反应时间5.4115.4115.800.001 4*D 反应温度17.62117.6251.400.000 1*AB24.95124.9572.800.000 1*AC9.025伊10-319.025伊10-30.0260.873 4AD1.0511.053.070.101 8BC0.5110.511.490.242 1BD0.03410.0340.100.756 7CD1.4611.464.270.057 8A237.45137.45109.26 0.000 1*B260.05160.06175.21 0.000 1*C2137.341137.34400.72 0.000 1*D295.47195.47278.56 0.000 1*残差4.80140.34失拟项3.23100.320.830.635 1纯误差1.5740.39总和284.7228注：*表示具有极显著影响，P0.01。10.009.509.008.508.001.0颐11.5颐13.0颐1A 底物质量比2.0颐12.5颐1接枝度/%3252830343230180.00165.00150.00135.00120.001.0颐11.5颐13.0颐1A 底物质量比2.0颐12.5颐1接枝度/%32528303432303.0颐12.5颐12.0颐11.5颐11.0颐18.008.509.009.5010.00242628303234363.0颐12.5颐12.0颐11.5颐11.0颐124262830323436120.00135.00150.00165.00180.00图 2底物质量比与 pH 值相互作用的等高线图与响应面图Fig.2Contour diagram and response surface diagram ofinteraction between substrate ratio and pH图 3底物质量比与反应时间相互作用的等高线图与响应面图Fig.3Contour diagram and response surface diagram ofinteraction between substrate ratio and time应用技术94食品研究与开发圆园23 年 9 月第 44 卷第 17 期90.0080.0070.0060.0050.001.0颐11.5颐13.0颐1A 底物质量比2.0颐12.5颐1接枝度/%3252830343230283032180.00165.00150.00135.00120.008.008.5010.00B pH 值9.009.50接枝度/%32528303430283090.0080.0070.0060.0050.00接枝度/%3252830343228308.008.5010.00B pH 值9.009.503090.0080.0070.0060.0050.00接枝度/%3252826342830120.00C 反应时间/min30135.00150.00165.00180.002630283.0颐12.5颐12.0颐11.5颐11.0颐12426283032343650.0060.0070.0080.0090.0010.009.509.008.508.0024262830323436120.00135.00150.00165.00180.0010.009.509.008.508.002426283032343650.0060.0070.0080.0090.00180.00165.00150.00135.00120.002426283032343650.0060.0070.0080.0090.00图 4底物质量比与反应温度相互作用的等高线图与响应面图Fig.4Contour diagram and response surface diagram ofinteraction between substrate ratio and temperature图 5pH 值与反应时间相互作用的等高线图与响应面图Fig.5Contour diagram and response surface diagram ofinteraction between pH and time图 6pH 值与反应温度相互作用的等高线图与响应面图Fig.6Contour diagram and response surface diagram ofinteraction between pH and temperature图 7反应时间与反应温度相互作用的等高线图与响应面图Fig.7Contour diagram and response surface diagram ofinteraction between time and temperature应用技术95食品研究与开发圆园23 年 9 月第 44 卷第 17 期由图 2图 7 可知，底物质量比、pH 值、反应时间、反应温度 4 个因素在所选范围内存在极值，即等高线中最小椭圆的中心点。结果表明，AB 交互作用显著，与 F值结果一致。2.2.4验证试验经 Design Expert 8.0.6 分析，该模型得到糖基化川芎蛋白制备最优条件为底物质量比 1.75 颐 1、pH9.19、反应时间 152.83 min、反应温度 73.67 益，预测接枝度为 35.37%。因考虑实际操作可行性，将验证条件修改为底物配质量比 1.8 颐 1、pH9、反应时间 153 min、反应温度 74 益，平行试验 3 次。经过验证试验，平均接枝度为（35.21依0.12）%，接近理论值，表明该模型可用于优化糖基化川芎蛋白的制备过程。2.3SDS-PAGE 结果SDS-PAGE 是对蛋白质的亚基及分子质量分析的重要手段，并且可用于对蛋白质糖基化后是否生成共聚物作定性鉴别14。图 8 是对 LCP 及其糖基化产物进行考马斯亮蓝染色的 SDS-PAGE 图谱。由图 8 可知，泳道 3、4 亚基谱带颜色与泳道 1、2相比，颜色变浅，可能是 LCP 与 Dex 经过湿热法糖基化后，生成了共聚物，LCP 中活性基团减少，从而蛋白质分子与考马斯亮蓝结合减少，出现亚基谱带颜色变浅15。另一方面，小分子的蛋白质与糖共价结合后，生成大分子的共聚物向上集聚，因此出现亚基谱带颜色变浅。浓缩胶顶端 P1 以及浓缩胶与分离胶接缝处 P2均出现新的条带，分析可能是 LCP 与 Dex 糖基化反应后，生成的共聚物分子量较大16，电泳时，这些共聚物无法通过凝胶，只能聚集在 P1 和 P2 处。通过亚基谱带颜色变浅，以及出现新的条带，可以说明 LCP 与 Dex糖基化后生成了共聚物。2.4SEM 观察SEM 结果见图 9。由图 9 所示，LCP 糖基化前后，结构明显不同。图9A 表明，糖基化前 LCP 呈颗粒状，近圆球形，大小不一。图 9B 为 LCP 与 Dex 简单物理混合后的扫描电镜图，两者的混合物具有 LCP 相似的结构，表面可以看出 LCP 所具备的近圆球形形态，可以推测两者之间并没有化学键缔合，而是物理混合。图 9C 为糖基化后的LCP，原本的近圆球形态消失，表面结构变得疏松多孔，呈现蜂窝状，可能是 LCP 与 Dex 共价结合，糖基化过程引入糖链，LCP 肽链逐渐延展开，形成的这种结构特点17，可以更好地提高蛋白质的溶解性，从而提高其功能特性。Qu 等18研究发现，糖基化的菜籽分离蛋白结构变得疏松多孔，呈现蜂窝状，与此结果一致。2.5FTIR 结果分析FTIR 结果见图 10。M 为 Maker；1、2 为 LCP；3、4 为 GLCP；P1 为浓缩胶顶端处；P2 为浓缩胶与分离胶接缝处。图 8Maker、LCP、GLCP SDS-PAGE 电泳图Fig.8SDS-PAGE of Maker，LCP and GLCP11 kDa17 kDa20 kDa25 kDa35 kDa48 kDa63 kDa75 kDa100 kDa135 kDa180 kDa245 kDaP1P24321MCBAA 为 LCP（10 000伊）；B 为 LCP 与 Dex 混合物（10 000伊）；C 为 GLCP（8 000伊）。图 9样品扫描电镜图Fig.9Scanning electron microscopy of samples图 10LCP、GLCP 傅里叶变换红外光谱图Fig.10Fourier transform infrared spectra of LCP and GLCP4 000 3 500500波数/cm-13 000 2 500 2 000 1 500 1 000GLCPLCP10 滋m10 滋m10 滋m应用技术96食品研究与开发圆园23 年 9 月第 44 卷第 17 期FTIR 是分析蛋白质与多糖共价结合后，分子水平上相互作用和结构变化的有效手段19。由图 10 所示，与 LCP 比较，GLCP 在波数为 3 6003 200 cm-1范围内出现了明显增强的吸收峰，可能是由于 Dex 的引入，体系中-OH 增多，伸缩振动引起的变化20。Zhao 等21利用大豆寡糖糖基化改性大豆分离蛋白，红外光谱也显示在 3 6003 200cm-1处吸收峰增强，与本文结果相似。在波数 1 630、1 530、1 240 cm-1处，吸收峰表现出了不同程度的变化，这 3 个波数分别在酰胺 I 带（1 7001 600 cm-1）、酰胺 II（1 5801 480 cm-1）、酰胺 III（1 3001 200cm-1）范围内，分别是由于 C=O 伸缩振动、NH弯曲振动、CN 拉伸和 NH 变形振动引起的22。波数为 1 020 cm-1时，GLCP 吸收峰强度与形状变化明显，可能是糖基化反应中新形成的 CN 共价键伸缩振动引起23。通过上述吸收峰的变化，可以表明 LCP 与Dex 以共价键的方式结合，从而引起蛋白质二级结构的变化。2.6抗氧化性结果分析抗氧化性试验结果见图 11。羟自由基清除率是评价自由基清除能力的重要指标，有效清除自由基是针对自由基诱导的氧化应激引起的各种疾病的保护方法之一24-25。由图 11A 所示，随着样品浓度的增大，LCP、GLCP 对羟自由基的清除率均呈现上升趋势，并且 GLCP 在浓度为 0.8 mg/mL 后，上升速度较快，在浓度为 1.0 mg/mL 时，清除率为（65.91依1.93）%。在相同的浓度范围内，羟自由基清除能力强弱依次为 VC跃GLCP跃LCP，其中阳性对照 VC的IC50值为 0.67 mg/mL，GLCP 的 IC50值为 0.88 mg/mL，LCP 的 IC50值为 2.20 mg/mL。由此可以看出 GLCP 的清除效果虽不及 VC，但强于 LCP。杨志伟等26研究 茁-葡聚糖糖基化对裸燕麦蛋白抗氧化活性时，发现糖基化裸燕麦蛋白羟自由基清除率是原蛋白的 2.13 倍，可以证实经过糖基化反应，清除羟自由基能力可以得到提高。由图 11B 所示，随着样品浓度的增大，LCP、GLCP对 ABTS+自由基的清除率均呈现逐渐上升趋势，其中GLCP 趋势较陡，有明显的量效关系。当其浓度达到1.0 mg/mL 时，GLCP 对 ABTS+自由基的清除率为（81.80依2.18）%，LCP 为（41.63依2.18）%。VC组 IC50值为0.16 mg/mL，GLCP 的 IC50值为 0.45 mg/mL，LCP 的 IC50值为 1.5 mg/mL，可以推测出 GLCP 具有良好的清除ABTS+自由基能力。有关乳清蛋白研究也表明，糖基化后乳清蛋白清除 ABTS+自由基能力有明显提高27。通过抗氧化试验结果，可以得出 GLCP 对羟自由基、ABTS+自由基的清除能力虽弱于 VC，但均强于LCP，表现出良好的抗氧化活性。分析可能是经过糖基化后，其结构性质的改变，使其溶解度的增加，在相同浓度下，GLCP 更易溶于水，可向自由基提供质子28。另一方面，美拉德反应会产生一些类黑素物质，而这些物质是自由基清除能力的贡献者29。并且糖基化的蛋白质有较好的供氢能力，更易与自由基反应30。3结论利用单因素及响应面法优化 LCP 糖基化最佳工艺条件为底物质量比（Dex 颐 LCP）1.8 颐 1、溶液 pH9、反应时间 153 min、反应温度 74 益。在此条件下糖基化的平均接枝度为（35.21依0.12）%。SDS-PAGE 分析可知，LCP 与 Dex 生成共聚物，并且分子量较大，电泳时，滞留在浓缩胶顶端以及浓缩胶与分离胶接缝处；SEM 分析可知，生成的共聚物表面结构呈现疏松多孔，蜂窝状；通过特征吸收峰不同程度的变化可知，LCP 二级结构有所改变。通过对自由基清除能力的测定，GLCP 相比原蛋白其抗氧化能力均有提升。综上所述，采用湿热法糖基化改性 LCP，LCP 溶解度得到改善，从而抗氧化性提高，可能是该过程引入了糖分子。本研究结果显示，GLCP 具有良好的抗氧化能力，并且为天然植物蛋白，具有安全、无刺激、无毒副作用的优势，本研究可为其在抗氧化研究方面提供参考。LCPGLCPVC120105907560453015000.21.0浓度/（mg/mL）0.40.80.6BLCPGLCPVC907560453015000.21.0浓度/（mg/mL）0.40.80.6AA.羟自由基清除能力；B.ABTS+自由基清除能力。图 11LCP、GLCP 对羟自由基和 ABTS+自由基的清除能力Fig.11Scavenging abilities of LCP and GLCP on hydroxylradical and ABTS+radical应用技术97食品研究与开发圆园23 年 9 月第 44 卷第 17 期参考文献：1谢丹,鲁延杰,李佳璇,等.响应面法优化川芎蛋白提取工艺及抗氧化活性研究J.食品工业科技,2021,42(21):213-220.XIE Dan,LU Yanjie,LI Jiaxuan,et al.Optimization of extractionprocess and antioxidant activity of Ligusticu