柴胡4种活性成分的体外抗氧化作用.pdf

柴胡 种活性成分的体外抗氧化作用王淑惠刘泽干黄小凤雷攀王莉博江明珠蔡华杜士明(.湖北医药学院药学院十堰.湖北医药学院附属太和医院科研处十堰.湖北医药学院武当特色中药研究湖北省重点实验室十堰)摘 要 目的 评价柴胡 种活性成分体外抗氧化作用 方法 通过紫外分光光度法采用 二苯基三硝基苯肼()和 联氮二(乙基苯并噻唑磺酸)二铵盐()化学试剂法检测柴胡 种活性成分的清除自由基的作用通过构建过氧化氢()诱导人正常肝细胞()损伤模型给予柴胡多糖、黄酮、皂苷干预测定模型细胞存活率、谷胱甘肽过氧化物酶()、超氧化物歧化酶()活性及丙二醛()水平比较柴胡 种活性成分抗氧化作用 结果 柴胡多糖、黄酮、皂苷和挥发油对 的半数抑制浓度()分别为.、.、.和.柴 胡 多 糖、黄 酮、皂 苷 和 挥 发 油 对 的 分 别 为.、.、.和.柴胡皂苷()可使氧化模型细胞存活率提高至.(.)和 酶活性分别提高至.和.(.)含量减少至.(.)结论 柴胡多糖、黄酮和皂苷具有体外抗氧化作用可为柴胡临床用于疏肝解郁提供理论依据关键词 柴胡活性成分自由基抗氧化中图分类号 文献标识码 文章编号()./.开放科学(资源服务)标识码()(.).()().().().(.).(.).(.).柴胡()是伞形科植物柴胡(.)或 狭 叶 柴 胡(.)的干燥根具有疏散退热、疏肝解郁、升举阳气等功效 柴胡治疗肝病的历史悠久张仲景伤寒论中记载小柴胡汤具有疏肝利胆、化浊解郁的功效宋代太平惠民和剂局方中记载逍遥散由柴胡、当归、炒白术等 味中药组成用于肝郁气滞所致疾病等在以柴胡为君药的经典名方中其主要发挥疏肝解郁的作用 研究发现柴胡的主要成分是柴胡多糖、柴胡黄酮、柴胡皂苷、柴胡挥发油等具有抗氧化、抗炎、解热、抗病毒和抗肿瘤等药理作用其主要成分可通过清除自由基、增强抗氧化酶活性等途径发挥抗氧化的作用 谢志明等研究柴胡多糖减轻氧化反应发挥小鼠肝损伤的保护作用张娜等研究发现柴胡皂苷 抑制人正常肝细胞焦亡和上皮间质转化减轻肝纤维化但是柴胡 种活性成分抗氧化保肝作用及比较笔者尚未见报道慢性肝病持续进展可致肝炎、肝纤维化、肝硬化和 肝癌 氧化应激是影响慢性肝病发生发展的主要因素之一体内氧化与抗氧化系统的动态失衡导致肝细胞功能和结构破坏促进炎症反应进一步加重氧化应激并诱导肝细胞持续性损伤 因此抗氧化应激为慢性肝病提供新的治疗策略 柴胡及其复方制剂在临床上被运用于预防和治疗肝脏疾病谢维宁等研究柴胡疏肝散改善非酒精性脂肪肝患者的肝功能刘静等研究小柴胡汤减轻非酒精性脂肪性肝炎模型小鼠的病理损伤改善小鼠肝脏功能等但柴胡的活性成分基于抗氧化发挥保护慢性肝病的作用需进一步明确因此本研究通过提取柴胡 种活性成分采用 二苯基三硝基苯肼 ()法和联氮二(乙基苯并噻唑磺酸)二铵 盐 ()法比较其化学抗氧化作用强弱筛选出抗氧化活性较好的柴胡 种活性成分对过氧化氢()诱导人正常肝细胞()的损伤模型进行干预测定细胞存活率、抗氧化酶活性及丙二醛等指标评价并比较柴胡 种活性成分的抗氧化作用为柴胡在临床上治疗慢性肝病提供理论依据 仪器与材料.仪器 型紫外分光光度仪(北京普析通用仪器有限责任公司)型生物倒置显微镜(日本 公司)型二氧化碳()恒温培养箱(美国 公司)型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)型多功能酶标仪(美国 公司)型台式离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司).药物及试剂柴胡饮片购于湖北神农本草中药饮片有限公司(批号:)由湖北医药学院杜士明教授鉴定为伞形科柴胡属植物北柴胡(收稿日期 修回日期 基金 项 目 湖 北 省 卫 生 健 康 委 员 会 资 助 项 目()湖北省科技厅项目()武当特色中药研究湖北省重点实验室(湖北医药学院)开放课题()作者简介 王淑惠()女湖北十堰人在读硕士研究方向:中药资源开发和新药研究:.通信作者 杜士明()男湖北十堰人教授硕士生导师博士研究方向:中药资源开发和新药研究:电话:.)的干燥根按 年版中华人民共和国药典中柴胡项下检查符合各项要求、和乙醇等试剂购自阿拉丁试剂上海有限公司达尔伯克改良伊格尔培养基和胎牛血清购自 公司水为纯化水.细胞系 由湖北医药学院附属太和医院生物医学研究所馈赠培养条件:、培养液:含 胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基实验选用对数生长期细胞 方法与结果.柴胡 种活性成分的提取及含量测定.柴胡多糖的提取及含量测定采用水提醇沉法提取柴胡多糖称取柴胡饮片 加入纯化水 回 流 提 取 滤 过 减 压 浓 缩 离 心(下同)取上清液加入 乙醇使提取液中乙醇浓度达 冷藏静置过夜后离心收集沉淀物 水复溶加入等体积 试剂三氯甲烷正丁醇()剧烈振摇后离心除去蛋白层得柴胡多糖溶液 保存备用以无水葡萄糖作为对照采用苯酚硫酸法测定柴胡多糖含量精密吸取柴胡多糖溶液.置于冰水浴中依次加入 苯酚和 浓硫酸各.摇匀后冷却室温放置 采用紫外可见分光光度法于 波长测定其吸光度(值)通过计算得标准曲线回归方程:.测算得柴胡多糖的含量.柴胡黄酮的提取及含量测定采用碱溶酸沉法提取柴胡黄酮取柴胡饮片 加入 乙醇 回流提取 减压浓缩成浸膏状加入碳酸钠()溶液溶解粗提取物 再缓慢加入浓盐酸()值为 时抽滤收集沉淀反复 次碱溶酸沉过程低温干燥法得柴胡黄酮 保存备用以芦丁作为对照称取柴胡黄酮提取物.加入 乙醇 溶解精密吸取.依次加入亚硝酸钠().、硝酸铝().和氢氧化钠()溶液().摇匀后放置 采用紫外可见分光光度法于波长 处测定 值通过计算得标准曲线回归方程.测算得柴胡黄酮的含量.柴胡皂苷的提取及含量测定采用热回流法提取柴胡皂苷取柴胡饮片 加入 乙醇 加热回流提取 趁热滤过并浓缩得乙醇浸膏正丁醇萃取 次合并萃取液减压浓缩乙医药导报 年 月第 卷第 期醇溶解得柴胡皂苷溶液 以柴胡皂苷 为对照采用紫外可见分光光度法测定柴胡皂苷含量依次加入 香草醛冰醋酸溶液.和高氯酸.恒温水浴 冷却至室温再加入冰醋酸于波长 处测 值 通过计算得标准回归方程.测算得柴胡皂苷的含量.柴胡挥发油的提取及含量测定采用水蒸气蒸馏法提取柴胡挥发油取柴胡饮片 加入 溶液 水蒸气蒸馏收集初馏液进行重蒸馏得到柴胡挥发油精提液 以柴胡注射液为对照通过紫外可见分光光度法测定柴胡挥发油浓度甲醇溶解挥发油精提液于波长 处测定 值分别测得柴胡挥发油精提液和柴胡注射液的吸 光 度 为 和 计 算 得 柴 胡 挥 发 油 含 量.(生药含量).柴胡 种活性成分化学抗氧化活性的测定.法测定自由基清除能力 测定液的配置:分别量取等倍稀释浓度的柴胡多糖、黄酮、皂苷和挥发油溶液各 分别加入 乙醇溶液(.)摇匀后室温避光 即得 测定液 清除能力的测定:采用紫外可见分光光度法于 波长测定样品溶液吸光度()、空白组吸光度()和无水乙醇对照组吸光度()依据“公式”计算得标准曲线回归方程采用 .版软件计算 得 半 数 抑 制 浓 度()结果见表 和图 自由基清除率()()/(公式)表 柴胡 种活性成分的 自由基清除能力.样品回归方程柴胡多糖.柴胡黄酮.柴胡皂苷.柴胡挥发油.柴胡 种活性成分对 自由基清除能力随一定浓度升高而增强值分别为.(柴胡多糖)、.(柴胡黄酮)、.(柴胡皂苷)和.(柴胡挥发油)而柴胡挥发油的最大提取浓度.无法达到其 值表明柴胡挥发油对 清除能力不足 由此得图 种活性成分的浓度与 自由基清除能力的关系.出柴胡 种成分 自由基清除能力与柴胡多糖、黄酮和皂苷密切相关.法测定自由基清除能力 测定液配置:取等体积 溶液和过硫酸钾溶液混匀得 工作液 分别量取等倍稀释浓度的柴胡多糖、黄酮、皂苷和挥发油溶液各.依次加入 工作液.混匀后室温避光 即得 测定液 清除能力的测定:采用紫外可见光分光度法于波长 处测定样品溶液吸光度()空白组吸光度()依据“公式”计算得标准曲线回归方程采用.版统计软件计算得 结果见表 和图 自由基清除率()()/(公式)表 柴胡 种活性成分的 自由基清除能力.样品回归方程柴胡多糖.柴胡黄酮.柴胡皂苷.柴胡挥发油.柴胡 种活性成分对 自由基清除能力随一定浓度范围升高而增强值分别为.(柴 胡 多 糖)、.(柴 胡 黄 酮)、.(柴胡皂苷)和.(柴胡挥发油)而柴胡挥发油的最大提取浓度.时对 自由基清除率仅为.无法达到其 值表明柴胡挥发油对 清除能力不足 由此得出柴胡发挥 自由基清除能力与柴胡多糖、黄酮和皂苷密切相关.柴胡 种活性成分体外抗氧化活性的测定.诱导 氧化损伤模型的建立 采用噻唑蓝法检测不同浓度 诱导 细胞的存活率 培养 细胞制备成单细胞悬液按每孔(含细胞 个)接种于 孔板中设模型组()、对照组(、)和空白组(只加入培养液)每组设置 个复孔于 、下培养 弃去培养液每孔加入含有 噻唑蓝(.)的培养液 培养箱中孵育 后加入二甲亚砜 摇床溶解 于酶标仪 处测定 值根据“公式”计算细胞存活率结果见图 图 种活性成分的浓度与 自由基清除能力的关系.医药导报 年 月第 卷第 期 细胞存活率()(模型组 值空白组 值)/(对照组 值空白组 值)(公式)与 组比较.图 不同浓度 对 细胞存活率的影响().()细胞存活率随 浓度增加而降低当 浓度为 时细胞存活率降低至 因此实验选取 作用 作为后续诱导 细胞氧化损伤模型的条件.柴胡多糖、黄酮、皂苷的细胞毒性实验 采用噻唑蓝法测定柴胡多糖、黄酮、皂苷对 的细胞毒性培养 细胞制备成单细胞悬液按每孔 (含细胞 个)接种于 孔板中设正常对照组(不做任何处理)给药组(给予不同浓度的柴胡多糖、黄酮、皂苷二甲亚砜为溶媒)和空白对照组(只加入培养液)每组设置 个复孔细胞存活率检测依据“.节”结果见图 细胞存活率随药物浓度增加而降低与正常对照组比较当给予柴胡多糖(.)、柴胡黄酮()、柴胡皂苷()时细胞存活率下降至 (.)因此实验分别选取柴胡多糖的低中高浓度(.、.、.)、柴胡黄酮的低中高浓度(、)和柴胡皂苷的低中高浓度(、)作为 细胞氧化损伤的作用浓度.柴胡多糖、黄酮、皂苷对 诱导 氧化损伤模型存活率 采用噻唑蓝法测定不同浓度柴胡多糖、黄酮和皂苷对细胞存活率的影响设置正常对照组(不做任何处理)模型对照组(采用 诱导)实验组(分别同时用低、中、高浓度的柴胡多糖、黄酮、皂苷预处理 细胞 后 诱导 )检测方法与“.节”相同结果见图 与正常对照组比较模型对照组 细胞存活率显著下降至.(.)与模型对照组比较柴胡多糖、黄酮和皂苷呈剂量依赖提高 细胞存活率柴胡多糖(.)、柴胡黄酮()和柴胡皂苷()分别显著提高 细胞存活率至.、.和.(.)因此实验分别选取 柴 胡 多 糖(.)、柴 胡 黄 酮()和柴胡皂苷()作为 细胞氧化损伤的作用浓度.谷胱甘肽过氧化物酶()、超 氧 化 物 歧 化 酶()活性及丙二醛()含量测定试剂盒检测柴胡 种活性成分对模型细胞中、活性及 含量的影响 将 细胞接种于 孔培养板中设正常对照组(不做任何处理)、模型与正常对照组比较.图 柴胡 种活性成分对 细胞增殖能力的影响().()与正常对照组比较.与模型对照组比较.图 柴胡 种活性成分对 细胞氧化损伤的保护作用().()对照组(诱导 )、实验组(柴胡多糖、黄酮、皂苷预处理细胞 后 诱导)弃去上清液加入细胞裂解液冰上裂解 后 下离心()弃去沉淀试剂盒检测 酶活性、酶活性和 含量结果见图 与正常对照组比较模型对照组、酶活性下降至.(.)含量提高至.(.)给 予 柴 胡 多 糖(.)、柴胡黄酮()和柴胡皂苷()后细胞内 酶活性显著增加至.和.(.)酶活性显著增加至.和.(.)含量显著降低至.和.(.)结果表明柴胡多糖、黄酮、皂苷能显著提高 诱导 细胞氧化损伤的 和 酶活性降低 含量其中柴胡皂苷作用最显著 讨论氧化应激是指机体或细胞暴露于氧化因子引起的损伤同时机体自由基异常升高导致氧自由基累积诱导细胞衰老、凋亡或坏死 和 法是体外评价自由基清除能力的常用方法本实验通过该方法测定并比较柴胡 种活性成分清除自由基作用的强弱结果表明柴胡多糖、黄酮和皂苷具有较好的自由基清除能力 酶、酶和 是反映机体氧化和抗氧化水平的重要指标当肝细胞受到 诱导时氧化与抗氧化水平失衡引起 酶和 酶表达水平下降 表达水平升高 本实验构建了 诱导 模型分别给予柴胡多糖、黄酮和皂苷干预并测定 酶、酶和 的水平结果显示柴胡皂苷的抗氧化作用最显著为柴胡基于抗氧化治疗慢性肝病提供理论依据.实验结果与柴胡常用制剂的作用和用途相互印证 小柴胡汤、护肝片等均是以柴胡为君药制成的制剂主要成分为柴胡多糖、黄酮和皂苷等具有抗氧化、提高免疫力等药理作用在临床上主要用于治疗慢性肝炎、肝硬化等肝脏疾病柴胡注射液是柴胡经水蒸气蒸馏法制成的溶液主要成分为挥发油具有解热、镇痛等药理作用在临床上用于治疗感冒及疟疾等疾病引起的发热 本实验结果提示柴胡 种活性 .正常对照组.模型对照组.柴胡多糖组.柴胡黄酮组.柴胡皂苷组 与正常对照组比较.与模型对照组比较.图 柴胡 种活性成分对 细胞中 酶、酶和 含量的影响().()医药导报 年 月第 卷第 期成分中柴胡多糖、黄酮和皂苷强于柴胡挥发油因此本实验印证了柴胡不同制剂发挥不同药理作用与其活性成分密切相关.对柴胡产品开发的启示柴胡具有植物抗生素的称谓挥发油是发挥解热镇痛作用的物质基础而柴胡注射液在临床应用中风险高成分复杂易引起不良反应 岁以下儿童禁用但这类人群又是呼吸道感染的好发群体 王莉博等将挥发油制成栓剂为治疗 岁以下儿童治疗呼吸道感染提供了安全、可靠的治疗方案 临床上常将柴胡煎煮成汤剂此过程中挥发油部分挥发较多若将柴胡提取成解热和抗氧化两大物质群分为挥发油和多糖、黄酮和皂苷等以颗粒剂的方式供应市场将有利于合理运用中药柴胡资源.对柴胡种植业的启发不同产地、采收时间柴胡的活性成分不尽相同鄂西北地区柴胡多糖、黄酮和皂苷的含量与柴胡不同采收期密切相关分别在种子成熟、月份采收最佳产地甘肃、山西的柴胡皂苷的含量较高 因此可以根据使用柴胡的不同活性成分选取不同产地及适宜采收时间获取柴胡最大利用价值本实验仅对柴胡单一活性成分抗氧化保肝作用进行探讨后期研究主要以柴胡皂苷为主分析其关键活性成分和结构在体内外探究其抗氧化改善慢性肝病的作用及分子机制进一步探究柴胡 种成分在体内外协同抗氧化保肝作用及机制为综合开发和应用柴胡中药资源奠定理论基础参考文献 .():.蓝绍航唐秋媛李娜娜等.基于网络药理学研究小柴胡汤治疗乙型肝炎的作用机制.临床肝胆病杂志():.师建茹高耀赵慧亮等.基于疏肝解郁功效的逍遥散寒苦肝和温辛肝性效关系研究.山东科学():.刘欢乐卫拂晓范毓慧等.逍遥散治疗 种肝郁气滞型妇科疾病的网络药理学作用机制研究.中国药学杂志():.:.():.():.谢志明吴春梅陈少元等.柴胡多糖通过抑制氧化应激和炎症反应减轻铅诱导小鼠肝肾损伤的研究.畜牧兽医学报():.张娜李勇.柴胡皂苷 对人肝细胞损伤的保护作用研究及抗肝纤维化机制探讨.中华中医药学刊():.():.():.():.谢维宁彭红兵李烨等.柴胡疏肝散对肝郁脾虚型非酒精性脂肪肝患者的临床疗效及肠道菌群的影响.中国实验方剂学杂志():.刘静孙蓉.小柴胡汤对非酒精性脂肪性肝炎模型小鼠的保护作用研究.中草药():.邓寒霜杨丽娜.响应面法优化柴胡多糖提取工艺.中国现代中药():.李棣华刘俊红伍孝先.紫外可见分光光度法测定不同产地柴胡中多糖含量.天津中医药():雷燕妮李多伟李银芳等.柴胡茎叶总黄酮提取工艺的优化.陕西农业科学():.柯江环诸凯凯李晓萍等.铁皮石斛总黄酮碳苷含量测定方法的建立及其在不同产地药材中的含量分析.时珍国医国药():.彭依晴刘爽康泽鹏等.柴胡皂苷提取工艺及其含量测定研究.化学试剂():.王莉博刘泽干雷攀等.小儿柴胡退热栓的制备及质量标准研究.中国药业():.陈淑芳黎庆涛黄凯等.篱栏网多糖的提取工艺优化及抗氧化活性.应用化工():.陈蓉徐俊陈华林等.俄色果不同极性部位的抗氧化、降血糖活性.中成药():.韦卫宁许立拔王孝勋等.对叶百部总生物碱保护诱导 细胞损伤的作用及机制研究.陕西科技大学学报():.姚娟林佳吴平安等.基于抗氧化研究三七提取物对 损伤 细胞的保护作用.中药药理与临床():.宋晓娟卢晓莹曾唯雅等.凉粉草不同极性部位抗氧化及对 葡萄糖苷酶抑制作用研究.医药导报 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