miR-21-5p_PDCD4轴对结肠癌的调控机制研究.pdf

论 著 医药前沿 11医药前沿 2023年7月 第13卷第20期 miR-21-5p/PDCD4 轴对结肠癌的调控机制研究陈煌军（浏阳市人民医院胃肠外科 湖南 长沙 410300）【摘要】目的：探究 miR-21-5p/PDCD4 轴对结肠癌的调控机制。方法：采用生物信息学分析检测 miR-21-5p 和PDCD4 在结肠癌组织和正常组织中的相对表达量、相关性以及潜在靶向结合点；采用 qRT-PCR 和 Western blot 实验检测 miR-21-5p 和 PDCD4 的表达；采用双荧光素酶实验验证 miR-21-5p 与 PDCD4 的靶向关系；采用细胞增殖实验、克隆形成实验、划痕实验以及 Transwell 实验检测结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力；采用流式细胞术实验检测细胞凋亡率。结果：miR-21-5p在结肠癌细胞中表达上调，且miR-21-5p过表达后结肠癌细胞的增殖能力明显增强，迁移速度提高，侵袭细胞数目增多；miR-21-5p 靶向下调 PDCD4 表达；miR-21-5p 通过下调 PDCD4 表达促进结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并且抑制细胞凋亡。结论：在结肠癌细胞中，miR-21-5p 表达上调，PDCD4 表达下调；miR-21-5p 通过靶向下调 PDCD4 的表达，从而促进结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭并抑制细胞凋亡。【关键词】结肠癌；miR-21-5p；PDCD4；增殖；迁移；侵袭【中图分类号】R735.3【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2023）20-0011-08Targeting PDCD4 with miR-21-5p promotes malignant progression of colon cancerCHEN HuangjunDepartment of Gsatical-Intestinal Surgery,Liuyang Peoples Hospital,Changsha,Hunan 410300,China【Abstract】Objective To explore the regulatory mechanism of miR-21-5p/PDCD4 axis on colon cancer.Methods The relative expression levels,correlation and potential target binding points of miR-21-5p and PDCD4 in colon cancer and normal tissues were detected by bioinformatics analysis.The expressions of miR-21-5p and PDCD4 were detected by qRT-PCR and Western blot assay.Dual luciferase assay was used to verify the targeting relationship between miR-21-5p and PDCD4.The proliferation,migration and invasion ability of colon cancer cells were detected by cell proliferation,clonogenesis,scratch and Transwell tests.The apoptosis rate was detected by flow cytometry.Results The expression of miR-21-5p in colon cancer cells was upregulated,and after miR-21-5p overexpression,the proliferation ability of colon cancer cells was significantly enhanced,the migration rate was increased,and the number of invading cells increased.miR-21-5p targets downregulate PDCD4 expression;miR-21-5p promotes proliferation,migration and invasion of colon cancer cells by downregulating PDCD4 expression and inhibits apoptosis.Conclusions In colon cancer cells,miR-21-5p expression is upregulated and PDCD4 expression is downregulated;miR-21-5p downregulates the expression of PDCD4 by targeting,thereby promoting the proliferation,migration,and invasion of colon cancer cells and inhibiting cell apoptosis.【Key words】Colon cancer;miR-21-5p;PDCD4;Proliferation;Migrate;Invasion结肠癌是全球第三大常见癌症，也是癌症相关死亡的主要原因之一1。研究表明，结肠癌的发病机制是一个多步骤的过程，包括癌症相关基因或分子的变化2-3，因此对结肠癌发病分子机制相关研究依然十分有价值。程序性细胞死亡因子 4（programmed cell death protein 4,PDCD4）是一种定位在 10q24 染色体上的细胞核抗原基因，其表达受白介素如 IL-2、IL-12 和 IL-15 的调控4，并且在细胞凋亡过程中起调控作用5-6。有研究发现，PDCD4 通常起抑癌作用，其表达在肿瘤中被下调，如肺癌7、肝细胞癌8、胶质瘤9、胃腺癌10。但目前PDCD4 在结肠癌中的研究并不深刻。已知 miRNA 能够影响多种生物学过程，据统计分析，miRNA 调控着大约30%的人类基因11。并且多项研究已经报道了 miRNA在许多癌症中表达失调12，这在肿瘤的转移发展以及疗效中起着重要作用13。已有研究深入探讨了 miR-21-5p 的调控机制，以及其在某些癌症中的致癌作用，例如miR-21-5p 的表达增加与非小细胞肺癌患者预后不良相关14。此外，miR-21-5p 通过靶向 SMAD7 基因，诱导人腹膜间皮细胞从间皮向间充质转变，并促进胃癌的扩散15。有研究发现，miR-21-5p 在期和期结肠癌患者中的表达差异16，然而，关于 miR-21-5p 在结肠癌分子机制中的作用研究尚未深入。本研究旨在探究 miR-21-5p/PDCD4 轴在结肠癌的发生发展中的调控机制，通过一系列细胞实验以及生物信息学分析检测两者对结肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭以及细胞凋亡的调控机制，为结肠癌靶向治疗的新方案提供参考。现报道如下。1 方法1.1 生物信息学分析采用 miRTarBase（http:/mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）预测 miR-21-5p 和 PDCD4 在结肠论 著12 医药前沿医药前沿 2023年7月 第13卷第20期 癌组织和正常组织中的相对表达量以及相关性，并采用 Pearson 相关性分析验证 miR-21-5p 和 PDCD4 的相关性。在 TargetScan 数据库（http:/www.targetscan.org/vert_72/）预测miR-21-5p与PDCD4的靶向结合位点。1.2 细胞培养人正常结肠细胞系 HCoEpiC（XY-XB-1616）和人结肠癌细胞系 SW1417（XY-XB-1907）购自美国 ATCC 公司。人结肠癌细胞系 LoVo（BNCC338601）和 HCT 116（BNCC287750），均购买于北纳生物。人正常结肠细胞系HCoEpiC的培养基为90%EMEM+10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）。结肠癌细胞系 SW141 的培养基为90%L15+10%FBS 培养液；结肠癌细胞 LoVo 的培养基为CM7-1 培养液。CM7-1 培养液：90%F-12K+10%FBS。F-12K：F-12K 培养液；HCT 116 培养于 37、5%CO2 条件下，培养基为 CM2-1 培养液。上述细胞系均培养于37、5%CO2条件的培养箱中。1.3 细胞转染根 据 制 造 商 的 方 案，使 用 Lipofectamine 2000（Invitrogen，美国）将 miR-21-5p 模拟物（miR-mimics）和 阴 性 对 照 模 拟 物（NC-mimics）以 及 pcDNA3.1-PDCD4 质粒（oe-PDCD4）和空的 pcDNA3.1 质粒（oe-NC）按照实验需要分别转染或共转染至结肠癌细胞系中。6 h 后更换培养基，转染 48 h 后采用 qRT-PCR 实验检测转染效率。1.4 qRT-PCR将结肠癌细胞以 5105个细胞/孔的密度接种在 6 孔板中，在 37 下孵育 24 h。根据制造商的方案，使用 TRIzol（Invitrogen，美国）从细胞中提取总RNA。然后使用 PrimeScript RT 试剂盒（Takara，日本）将 RNA 反转录为 cDNA。使用 QuantiTect SYBR-Green PCR 试剂盒（Qiagen China Co.，Ltd.，中国），在 Applied Biosystems ABI Prism 7000 序列检测系统上进行 PCR 分析。PCR 条件如下：95 5 min，进行 35 个循环，分别是 95 30 s，58 30 s 和 72 30 s。使用 2-Ct方法对目的基因的相对表达水平进行定量，U6 和 GAPDH 作为内部对照。miR-21-5p 上游引物为 5-GCGGCAACACCAGTCGATG-3，下游引物为 5-TGCGTGTCGTGGAGTC-3；PDCD4 上游引物为5-AGGCCGAGGTGGGCGGATCACTTGA-3，下游引物为 5-GCCACCATGCCTGGCTACT-3；U6 上游引物为 5-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3，下游引物为 5-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3；GAPDH上游引物为 5-CCTCTGACTTCAACAGCGACAC-3，下游引物为 5-TGGTCCAGGGGTCTTACTCC-3。1.5 Western Blot使用细胞裂解液（Beyotime，中国）提取细胞裂解产物。根据制造商的说明，使用 Lowry 方法定量蛋白质浓度。将蛋白质（每泳道 10 20 g）进行 12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）并转移到杂化聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride,PVDF）膜上（Millipore，美国）。用 5%脱脂奶粉封闭 1 h，然后在4 下加入一抗 PDCD4（1/20000，ab80590，Abcam，英国）孵育过夜，用 TBST（含 50 mM Tris/HCl，pH8.8、125 mM NaCl 和 0.05%Tween-20 的 Tris 缓冲盐水）PVDF膜洗涤3次，室温下各15 min。然后加入IgG H&L（1/2000，ab205718，Abcam，英国）在室温下孵育 30 min，再用TBST 洗 3 次。使用凝胶成像系统（Kodak，美国）对印迹进行条带密度分析。GAPDH（1/2500，ab9485，Abcam，英国）用作标准化的内部参考。所有步骤重复3次。1.6 CCK8 实验首先利用胰蛋白酶消化转染后的结肠癌细胞使其成为细胞悬液，将细胞以 5 000 个细胞/孔的密度接种在 96 孔板中，分别在 0 h、24 h、48 h、72 h、96 h 每孔加入 10 L 结肠癌 K8（1 100），并在 37 下孵育1 h，随后在 450 处检测到光密度（OD）值。使用微孔板分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）进行检测。实验重复进行 3 次。1.7 克隆形成实验利用胰酶消化转染后的结肠癌细胞，并将浓度调整为 1 000 个细胞/mL，取 2 mL 接种至 6 孔板中，培养基为含 30%FBS 的完全培养基。当细胞形成明显的克隆时终止培养，弃去培养基，用 PBS 清洗 2 次，4%多聚甲醛固定细胞 15 min，0.1%结晶紫染色 10 min，最后使用无菌水清洗1次，自然风干。使用配备有MicroPublisher 3.3RTV 相机的光学显微镜捕获图像，计算每孔的克隆数，取均值。1.8 划痕愈合实验将转染后的结肠癌细胞接种到 6 孔板中，培养至大部分细胞覆盖整个孔表面，然后使用 200 L 移液枪枪头垂直平面通过孔中心划一条直线，用 PBS 洗细胞 2 次以除去破碎细胞，然后向孔中补充不含 FBS 的培养基，在 37、5%CO2条件下继续培养细胞。在划痕刚完成时论 著 医药前沿 13医药前沿 2023年7月 第13卷第20期（0 h）和划后 48 h 时拍照。细胞迁移距离表示为 1-（划后 48 h 细胞间隙距离/0 h 细胞划痕距离）100%。3 次实验确定平均值。1.9 Transwell 实验使用 Transwell 试纸（BD Biosciences，美国）进行细胞侵袭测定。在侵袭试验中，将无血清培养基中的2104个转染细胞接种到顶部室中，该室预先用 Matrigel（BD Biosciences，美国）包被，下室添加含有血清的培养基作为化学吸引剂。在 37 培养 24 h 后，将侵袭至下室的细胞用甲醇（100%）固定 20 min，然后用 0.1%的结晶紫染色 30 min。在光学显微镜下计数通过膜的细胞数目，测定进行 3 次。1.10 双荧光素酶实验使用 Lipofectamine 2000（Invitrogen，美国）将构建的 PDCD4-3UTR 野生型（3UTR WT）或 PDCD4-3UTR 突变型（3UTR MUT）双荧光素报告质粒（Promega，美国）和 miR-21-5p（miR-mimics）或阴性对照（NC-mimics）共转染至结肠癌细胞中。转染 48 h后，根据制造商的要求，使用荧光素酶报告基因系统（Promega，美国）分析荧光素酶活性，其中海肾荧光素酶作为内参，标准化荧光素酶活性。1.11 流式细胞术通过 800 rpm 离心 5 min 收集细胞并吸除上清液，用0.5 1 mL PBS 重悬细胞，添加甲醛并使其最终浓度为4%，在室温下固定 15 min。然后用 PBS 再次离心洗涤，弃上清液，在 0.5 1 mL PBS 中重悬细胞。根据制造商的方案用膜联蛋白-FITC/PI 试剂处理细胞。在 1 h 内，通过流式细胞仪（BDBiosciences，美国）分析细胞凋亡。1.12 统计学方法使用 SPSS 25 统计软件进行数据分析。计量资料用平均数 标准差（x-s）表示，采用 t 检验和单因素方差分析。P 0.05 表示差异具有统计学意义。2 结果2.1 miR-21-5p 在结肠癌中表达情况生物信息学分析预测 miR-21-5p 在正常组织和结肠癌细胞中的表达情况，结果显示，miR-21-5p 在结肠癌中均显著上调（图 1a）。qRT-PCR 实验验证 miR-21-5p 在结肠癌细胞系 SW1417、LoVo 和 HCT 116 中的相对表达量明显高于 HCoEpiC 细胞（图 1b）。2.2 miR-21-5p 促进结肠癌的增殖、迁移和侵袭本研究选择了 miR-21-5p 表达水平相对较低的SW1417 细胞进行后续实验。CCK8和克隆形成实验结果显示，miR-21-5p 过表达处理后 SW1417 细胞增殖数量明显高于 NC-mimics 组（图 2a、2b）。划痕愈合实验结果显示，培养 48 h 后过表达 miR-21-5p 的细胞迁移距离相比 NC-mimics 组显著提高（图 2c）。Transwell 实验结果显示相较于 NC-mimics 组，miR-21-5p 过表达后侵袭至下室的细胞数目明显增多（图 2d）。（a）（b）注：（a）生物信息学分析 miR-21-5p 在正常组织和结肠癌中的表达情况；（b）qRT-PCR 实验检测不同细胞系中 miR-21-5p 的表达水平。P 0.05。图 1 miR-21-5p 在结肠癌中表达情况论 著14 医药前沿医药前沿 2023年7月 第13卷第20期 0 h24 h48 h72 h96 h NC-mimics806040200集落数miR-mimics（a）（b）NC-mimicsmiR-mimics 0 hNC-mimicsmiR-mimics48 h（c）NC-mimicsNC-mimicsmiR-mimicsmiR-mimics细胞侵袭数（个）（d）注：（a）结肠癌 K8 增殖实验检测不同处理组细胞的增殖能力；（b）细胞克隆实验检测不同处理组细胞的克隆形成情况；（c）划痕愈合实验检测不同处理组细胞的迁移能力；（d）Transwell 实验检测不同处理组细胞的侵袭能力。P 0.05。图 2 过表达 miR-21-5p 促进结肠癌的增殖、迁移和侵袭2.3 miR-21-5p 靶向下调 PDCD4 表达miRTarBase 数据库预测了 PDCD4 在结肠癌与正常组织中的表达情况（图 3a），在 TargetScan 数据库分析预测并得到 miR-21-5p 与 PDCD4 的潜在靶向位点（图 3b），并且利用双荧光素酶实验验证了两者的靶向关系（图 3c）。通过 miR-21-5p 与 PDCD4 的相关性分析发现 miR-21-5p 和 PDCD4 表达呈负相关（图 3d）。qRT-PCR 实验和 Western blot 实验发现 PDCD4 在结肠癌中显著下调（图 3e、3f）。当转染过表达 miR-21-5p 时，PDCD4 的表达水平明显降低（图 3g、3h）。论 著 医药前沿 15医药前沿 2023年7月 第13卷第20期 （a）（b）（c）（d）（e）（f）（g）（h）注：（a）miRTarBase 数据库预测 PDCD4 在结肠癌与正常组织中的表达情况；（b）TargetScan 数据库预测的 miR-21-5p 与 PDCD4 的潜在结合位点；（c）双荧光素酶实验验证 miR-21-5p 与 PDCD4 的靶向关系；（d）miR-21-5p 与 PDCD4 的相关性分析；（e）qRT-PCR 实验检测 PDCD4 在结肠癌中的表达；（f）Western blot 实验检测 PDCD4 在结肠癌中的表达；（g）qRT-PCR 实验检测过表达 miR-21-5p 后 PDCD4 在结肠癌中的表达；（h）Western blot 实验检测过表达 miR-21-5p 后 PDCD4 在结肠癌中的表达。P 0.05。图 3 miR-21-5p 靶向下调 PDCD4 表达2.4 miR-21-5p 通过靶向下调 PDCD4 促进结肠癌发生发展本研究设置的回复实验分组如下：NC-mimics+oe-NC、NC-mimics+oe-PDCD4 和 miR-mimics+oe-PDCD4。qRT-PCR 实验和 Western blot 实验验证各处理组 PDCD4 的表达情况（图 4a、4b），结果显示过表达PDCD4 后，PDCD4 的表达水平明显上升，miR-21-5p 和PDCD4 同时过表达后，PDCD4 表达水平被抑制。CCK8实验和克隆形成实验结果均显示 PDCD4 过表达处理的结肠癌细胞增殖数量显著少于对照组，而 miR-21-5p 与论 著16 医药前沿医药前沿 2023年7月 第13卷第20期 PDCD4 同时过表达后细胞增殖能力明显增强（图 4c、4d）。通过划痕愈合实验发现只过表达 PDCD4 的结肠癌细胞迁移能力明显被抑制，而miR-21-5p同时过表达后，细胞的迁移能力显著提高（图 4e）。Transwell 实验结果显示，过表达 PDCD4 的细胞侵袭能力显著减弱，miR-21-5p 与 PDCD4 同时过表达的处理组侵袭能力再次增强（图 4f）。另外，基于 PDCD4 对细胞凋亡的重要作用17，本研究利用流式细胞术对各处理组的细胞凋亡情况进行探究，实验结果显示，相比于对照组，过表达 PDCD4的处理组细胞凋亡率提高，miR-21-5p 同时过表达后的结肠癌细胞凋亡率明显下降（图 4g）。0 h24 h48 h72 h96 h（a）（b）（c）NC-mimics+oe-NCNC-mimics+oe-PDCD4miR-mimics+oe-PDCD4 NC-mimics+oe-NC集落数NC-mimics+oe-PDCD4miR-mimics+oe-PDCD4（d）0 h48 hNC-mimics+oe-NCNC-mimics+oe-PDCD4miR-mimics+oe-PDCD4 NC-mimics+oe-NCNC-mimics+oe-PDCD4miR-mimics+oe-PDCD4（e）图 4 miR-21-5p 通过靶向下调 PDCD4 促进结肠癌发生发展论 著 医药前沿 17医药前沿 2023年7月 第13卷第20期 NC-mimics+oe-NCNC-mimics+oe-PDCD4miR-mimics+oe-PDCD4 NC-mimics+oe-NCNC-mimics+oe-PDCD4miR-mimics+oe-PDCD4细胞侵袭数（f）NC-mimics+oe-NCNC-mimics+oe-PDCD4miR-mimics+oe-PDCD4 NC-mimics+oe-NCNC-mimics+oe-PDCD4miR-mimics+oe-PDCD4死亡率（%）（g）注：（a）qRT-PCR 实验检测转染处理后各处理组 PDCD4 的表达；（b）Western blot 实验检测转染处理后各处理组 PDCD4 的表达；（c）结肠癌 K8 实验检测转染处理后各处理组细胞的增殖能力；（d）细胞克隆实验检测转染处理后各处理组细胞的克隆形成情况；（e）划痕愈合实验检测转染处理后各处理组细胞的迁移能力；（f）Transwell 实验检测转染处理后各处理组细胞的侵袭能力；（g）流式细胞术分析转染处理后各处理组的细胞凋亡情况。P 0.05。图 4（续）3 讨论已知许多 miRNA 在各种类型的肿瘤调节中起关键作用18。本研究发现 miR-21-5p 通过靶向下调 PDCD4的表达，从而促进结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭并抑制细胞凋亡。本研究利用生物信息学分析以及 qRT-PCR实验检测发现 miR-21-5p 在结肠癌中显著高表达，这与 Yu 等19的研究结果一致。随后进行一系列细胞实验以探究 miR-21-5p 对结肠癌细胞表型的影响，结果显示 miR-21-5p 过表达处理后结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力明显提高。miR-21-5p 在其他癌症中同样起到促癌作用，例如 Tian 等20研究发现 miR-21-5p 能够促进肝细胞癌细胞恶性表型。本研究实验证明了 miR-21-5p 在结肠癌中高表达，且作为促癌因子在结肠癌中发挥作用。有多项研究发现，在肿瘤细胞中 miR-21-5p 会靶向下调 PDCD4 的表达21。本研究中通过生物信息学分析预测得到 miR-21-5p 和 PDCD4 的结合位点，两者呈负相关，并且双荧光素酶实验验证了两者的靶向关系，qRT-PCR 和 western blot 实验结果显示 miR-21-5p 靶向下调PDCD4。miR-21-5p 和 PDCD4 在结肠癌相关的研究结果较少，然而有研究报道表明 miR-21-5p 通过下调 PDCD4抑制心肌细胞凋亡5，另外卵巢干细胞中 miR-21-5p 可以通过靶向 PDCD4 抑制颗粒细胞凋亡22。本研究实验结果显示，PDCD4 过表达处理后结肠癌细胞增殖、迁移论 著18 医药前沿医药前沿 2023年7月 第13卷第20期 与侵袭能力受到抑制，而 miR-21-5p 与 PDCD4 同时过表达后处理组增殖、迁移与侵袭能力明显提高。以上结果说明 miR-21-5p 可以靶向下调 PDCD4 以促进结肠癌的恶性进展。综上所述，在结肠癌细胞中，miR-21-5p 表达上调，PDCD4 表达下调；miR-21-5p 通过靶向下调 PDCD4 的表达，从而促进结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭并抑制细胞凋亡，以上研究结果可为结肠癌靶向治疗方案提供理论依据。【参考文献】1 SIEGEL R L,MILLER K D,JEMAL A.Cancer statistics,2018 J.CA Cancer J Clin,2018,68(1):7-30.2 FEARON E R.Molecular genetics of colorectal cancer J.Annu Rev Pathol,2011,6:479-507.3 CHEN W,SWANSON B J,FRANKEL W L.Molecular genetics of microsatellite-unstable colorectal cancer for pathologists J/OL.Diagn Pathol,2017,12(1):24.https:/doi.org/10.1186/s13000-017-0613-8.4 AZZONI 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