紫檀芪通过线粒体途径调控结直肠癌细胞增殖和凋亡_李扬波.pdf

基金项目:湖北省重点研发计划项目(2020BCA066)作者单位:430060武汉大学人民医院消化内科通信作者:董卫国,电子信箱:dongweiguo 紫檀芪通过线粒体途径调控结直肠癌细胞增殖和凋亡李扬波董卫国摘要目的探讨紫檀芪对结直肠癌细胞增殖和凋亡的作用及其机制。方法使用梯度浓度的紫檀芪体外处理结直肠癌细胞,CCK-8 法检测结直肠癌细胞增殖和活性,Hoechst 33258 荧光染色法检测细胞凋亡,DCFH-DA 荧光探针检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平的变化,JC-1 荧光探针检测细胞内线粒体膜电位的变化,Western blot 法检测线粒体途径相关蛋白表达水平。结果与对照组比较,紫檀芪对结直肠癌细胞增殖有抑制作用,且呈剂量和时间依赖性(P 0.05);Ho-echst 33258 染色和流式结果显示,紫檀芪促进结直肠癌细胞凋亡(P 0.05);紫檀芪诱导细胞内 ROS 产生、降低线粒体膜电位水平(P 0.05),增加 Apaf-1、AIF、Bax、Cyt C、cleaved caspase-3 和 cleaved caspase-9 的表达,降低 Bcl-2、PCNA 和 survivin 的蛋白水平(P 0.05)。结论紫檀芪增加结直肠癌细胞内 ROS 水平、降低线粒体膜电位水平,通过线粒体途径抑制结直肠癌细胞增殖,诱导结直肠癌细胞凋亡。关键词紫檀芪结直肠癌细胞线粒体途径中图分类号R73文献标识码ADOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2023.02.009Pterostilbene Regulates Proliferation and Apoptosis through Mitochondrial Pathway in Colorectal Cancer Cells.LI Yangbo,DONGWeiguo.Department of Gastroenterology,Renmin Hospital of Wuhan University,Hubei 430060,ChinaAbstractObjectiveTo investigate the effect and mechanisms of Pterostilbene on proliferation and apoptosis of colorectal cancercells.MethodsColorectal cancer cells were treated with Pterostilbene at gradient concentration in vitro,the proliferation and activity ofcolorectal cancer cells were detected by CCK-8 assay,cell apoptosis was detected by Hoechst 33258 fluorescence staining,the changesof intracellular reactive oxygen species(ROS)were detected by DCFH-DA fluorescence probe,and the changes of intracellular mito-chondrial membrane potential were detected by JC-1 fluorescence probe,the expression levels of mitochondrial pathway-related proteinswere detected by Western blot.ResultsCompared with the control group,Pterostilbene inhibited the proliferation of colorectal cancercells in a dose-and time-dependent manner(P 0.05).The result of Hoechst 33258 staining and flow cytometry showed thatPterostilbene promoted the apoptosis of colorectal cancer cells(P 0.05).Pterostilbene could increase the intracellular ROS and de-crease the mitochondrial membrane potential(P 0.05),increase the expressions of Apaf-1,AIF,Bax,Cyt C,cleaved caspase-3and cleaved caspase-9,and decrease the protein levels of Bcl-2,PCNA and survivin(P 0.05).ConclusionPterostilbene can in-crease the level of intracellular ROS,decrease the level of mitochondrial membrane potential,which can inhibit the proliferation of color-ectal cancer cells and induce apoptosis of colorectal cancer cells through the mitochondrial pathway.Key wordsPterostilbene;Colorectal cancer cells;Mitochondrial pathway结直肠癌是最常见的胃肠道恶性肿瘤之一,根据世界卫生组织 2020 年发表的数据,结直肠癌发生率在世界恶性肿瘤排行表中居第 3 位,而且全球死亡病例数超 93 万例,仅次于肺癌1。中国仍是结直肠癌高发国家,2015 年新发病例数和死亡病例数分别为388000 和 187000 例2。尽管现代诊疗技术在癌症治疗领域取得了巨大进展,但是结直肠癌容易转移,86%的终末期结直肠癌患者会在确诊 5 年内死亡3。目前,结直肠癌的主要治疗方式是手术和联合放化疗,但是由于化疗药物如 5-氟尿嘧啶耐药性问题日益严重,导致治疗效果不尽人意。因此,有必要寻找新型低毒且高效的天然抗癌药物,构建新的化疗方案,避免结直肠癌耐药性问题的进一步恶化。紫檀芪是最初从紫檀心材中分离出来的植物代谢产物,广泛存在于蓝莓、葡萄等浆果中。紫檀芪是白藜芦醇的天然类似物,但是比白藜芦醇具有更强的亲脂性和更高的细胞摄取潜力4。紫檀芪具有广泛的药理作用,如抗炎、降低血糖血脂以及营养神经等作用。既 往 研 究 证 实,紫 檀 芪 可 对 乳 腺癌、膀胱癌、胰腺癌等多种肿瘤发挥治疗作用,但对14医学研究杂志 2023 年 2 月第 52 卷第 2 期论著结直肠癌的抗癌作用机制尚不明确5 8。本研究探讨了紫檀芪在结直肠癌细胞增殖和凋亡过程中的作用及其机制。材料与方法1.实 验 材 料:人 结 直 肠 癌 细 胞 株 SW480、HCT116、DLD-1 和人结肠上皮细胞 NCM460 购自中国典型培养物保藏中心;紫檀芪购自美国 Selleck 公司;胎牛血清、RPMI-1640 培养基购自美国 Gibco 公司;青霉素、链霉素、CCK-8 试剂盒、Hoechst 33258染色试剂盒、ROS 检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;Annexin V-PE/7-AAD 细胞凋亡检测试剂盒购自美国 BD 公司;Apaf-1、AIF、Bax、Bcl-2、Cyt C、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、GAP-DH、PCNA、survivin 兔单克隆抗体购自美国 Cell Sig-naling Technology 公司。2.细胞培养和分组:人结直肠癌细胞株(SW480、HCT116、DLD-1)和人结肠上皮细胞 NCM460 在质量浓度为 100g/L 胎牛血清、1%抗生素溶液(青霉素100U/ml 和链霉素 100g/ml)的 RPMI-1640 培养基,37、体积分数为 5%的 CO2加湿培养箱中培养。选用处于对数生长期的细胞进行实验,分为梯度浓度紫檀芪处理组和阴性对照组,阴性对照组加入同浓度的DMSO。3.细胞增殖实验:用 CCK-8 试剂盒检测细胞活力。将细胞(5 103个/孔)接种在 96 孔培养板中,第 2 天更换上清液,在含有紫檀芪(0、10、20、40、60、80、120、160mol/L)的 新 鲜 培 养 基 中 培 养 12、24、48h。每孔加入 CCK-8 溶液 10l,再孵育 2h,用酶标仪测定 450nm 处的吸光度(A)值。4.Hoechst 33258 荧 光 染 色 法:利 用 Hoechst33258 染色试剂盒检测细胞凋亡。将处于指数生长期的细胞种植于 6 孔板,培养 24h。用含有紫檀芪(0、20、40、80mol/L)的新鲜培养基培养 24h,然后固定细 胞,用 PBS 冲 洗 3 次,按 照 说 明 书 用 Hoechst33258 染色液染色。在荧光显微镜下观察和捕捉细胞凋亡的形态学特征。5.Annexin V-PE/7-AAD 双染流式细胞术:利用 Annexin V-PE/7-AAD 细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。将处于指数生长期的细胞种植于 6 孔板,培养 24h。用含有紫檀芪(0、20、40、80mol/L)的新鲜培养基培养 24h,收集每孔细胞,PBS 冲洗两遍,离心收集细胞沉淀,按照说明书设置单染组和双染组,单染组只加 5l Annexin V-PE 或 7-AAD,双染组两者均加,置于室温避光孵育 15min,随后用流式细胞仪检测。6.ROS 测定实验:利用 ROS 检测试剂盒测定细胞内 ROS 水平。将细胞接种于 6 孔培养板,培养 24h后用不同浓度的紫檀芪(0、20、40、80mol/L)再培养24h。细胞在含 10mol/L DCFH-DA 的 1ml 培养基中 37 培养 20min,用 PBS 洗涤 3 次。然后用荧光显微镜观测。7.线粒体膜电位测定实验:利用带有 JC-1 探针的线粒体膜电位检测试剂盒测定细胞线粒体膜电位。将细胞接种于 6 孔培养板,培养 24h 后用不同浓度的紫檀芪(0、20、40、80mol/L)再培养 24h。次日去除上清液,并用 JC-1 染料处理细胞 1h,最后使用流式细胞仪检测和分析细胞。8.Western blot 法检测:经上述紫檀芪处理后,提取细 胞 总 蛋 白,测 定 蛋 白 浓 度。蛋 白 质 经 10%SDS-PAGE 电泳分离后,转膜,含浓度为 5%的脱脂牛奶 TBST 中 室 温 封 闭 1h,TBST 清 洗 4 次,每 次5min。随后 4 下一抗孵育过夜,TBST 清洗 4 次后,在室温黑暗条件下二抗孵育 1h,再用 TBST 洗涤 4次,最后用 Odyssey 红外荧光扫描成像系统扫描。9.统计学方法:应用 SPSS 21.0 统计学软件对数据进行统计分析。数据以均数 标准差(x s)表示,组间比较采用方差分析,以 P 0.05 为差异有统计学意义。结果1.紫檀芪抑制结直肠癌细胞的增殖:将 3 株结直肠癌细胞暴露于不同浓度的紫檀芪,CCK-8 实验结果显示,紫檀芪能抑制结直肠癌细胞的增殖,且呈剂量和时间依赖性,而在正常人结肠上皮细胞 NCM460中,紫檀芪对其增殖的抑制作用较弱(图 1)。此外,可观察到 SW480 对紫檀芪最敏感,因此选 SW480 进行以下的实验。2.紫 檀 芪 促 进 结 直 肠 癌 细 胞 的 凋 亡:Hoechst33258 染色用于评估暴露于紫檀芪的结直肠癌细胞的细胞核,正常细胞核呈蓝色荧光,而凋亡细胞核呈明亮的蓝色荧光,伴有碎裂和染色质浓缩。随机选择的视野显示,经紫檀芪处理后,结直肠癌细胞的细胞核凋亡水平增加,且呈剂量依赖性。流式细胞术的结果进一步显示,紫檀芪处理组与对照组比较,结直肠癌细胞凋亡率增加,差异有统计学意义(P 0.05,图 2)。24论著J Med Res,February 2023,Vol.52 No.2图 1紫檀芪对细胞增殖的影响A.不同浓度的紫檀芪处理结直肠癌细胞(HCT116、SW480、DLD-1)24h;B.不同浓度的紫檀芪对 NCM460 细胞的影响;C.不同浓度的紫檀芪处理 SW480 细胞 12、24 和 48h图 2紫檀芪对结直肠癌细胞凋亡的影响A.Hoechst 33258 染色观察凋亡细胞(100);B.流式细胞术检测凋亡率。与对照组比较,P 0.05 3.紫檀芪通过线粒体途径促进结直肠癌细胞凋亡:为了确定紫檀芪是否通过线粒体凋亡途径促进结直肠癌细胞凋亡,评估了 ROS 水平和线粒体膜电位水平的变化。结果表明,与对照组比较,紫檀芪提高了结直肠癌细胞内 ROS 水平,降低了线粒体膜电位水平,且呈剂量依赖性(P 0.05,图 3)。Westernblot 法检测用于评估线粒体凋亡途径相关蛋白的水平。结果显示,与对照组比较,紫檀芪处理结直肠癌细胞 24h 后,AIF、Apaf-1、Bax、Cyt C、cleaved caspase-3和 cleaved caspase-9 蛋白表达量增加,Bcl-2、PC-NA、survivin 表达量减少,且呈剂量依赖性,差异有统计学意义(P 0.05,图 4)。34医学研究杂志 2023 年 2 月第 52 卷第 2 期论著图 3紫檀芪对结直肠癌细胞内 ROS 及线粒体膜电位的影响A.DCFH-DA 探针染色观察胞内 ROS 水平(200);B.流式细胞术检测线粒体膜电位水平图 4紫檀芪对结直肠癌细胞线粒体途径的影响与 0mol/L 比较,P 0.05讨论抗癌药物主要通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥作用,而细胞凋亡途径主要有两种:外源性凋亡途径和内源性凋亡途径9。内源性细胞凋亡主要通过线粒体途径来实现,是一种进化上高度保守的细胞凋亡形式,对多细胞生物的发育和内环境稳定中起着举足轻重的作用10。线粒体通透性转换孔(mitochondrial per-meability transition pore,MPTP)的开放是维持线粒体动态稳定的核心环节,特殊刺激施加于线粒体可以使MPTP 的开闭状态改变,实现线粒体通透性的变化,从而在线粒体途径中发挥着关键作用11。ROS 主要来源 于 线 粒 体,而 线 粒 体 又 是 ROS 的 靶 标 之 一,MPTP 短期且可逆地开放会释放少量 ROS,有利于细胞生长;然而,持续且不可逆地打开 MPTP 会导致44论著J Med Res,February 2023,Vol.52 No.2ROS 的爆炸性释放,从而导致氧化应激反应损伤线粒体膜完整性甚至细胞12。ROS 的积累会损伤线粒体膜,导致氧化应激损伤线粒体膜,随后 MPTP 持续开放,从而使得细胞内具有促进凋亡的蛋白 Cyt C 和AIF 从线粒体释放,在细胞质中不断累积13,14。紧接着,Cyt C 与半胱氨酸蛋白酶家族因子 Apaf-1 相互作用,Bcl-2 家族蛋白被释放到细胞质中,加速细胞凋亡过程15。传统化疗药物随着耐药性的增加,对癌症的治疗效果有限,且细胞毒性等不良反应影响了患者的生活质量16。目前,开发新型低毒、高效的抗结直肠癌药物,探索其作用机制成为研究热点17。紫檀芪作为植物产生的天然代谢产物,在多种肿瘤中已证明具有高效的抗癌作用。既往研究发现,紫檀芪诱导肝癌细胞氧化应激,通过线粒体途径抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡18。然而,紫檀芪对结直肠癌细胞的抑制作用机制暂不明确,本研究探讨了紫檀芪对结直肠癌细胞的抑制作用机制。经不同浓度的紫檀芪处理结直肠癌细胞后,结果显示,紫檀芪显著抑制了结直肠癌细胞的增殖,并且抑制作用呈剂量和时间依赖性。此外,DCFH-DA探针染色和流式细胞术结果分别表明了紫檀芪可以提高结直肠癌细胞的 ROS 水平、降低线粒体膜电位水平。同时,Hoechst 33258 染色和 Annexin V-PE/7-AAD 双染流式结果表明紫檀芪能够显著促进结直肠癌细胞凋亡,提示紫檀芪可能激活氧化应激、通过线粒体途径诱导结直肠癌细胞凋亡。因此,笔者进一步通过 Western blot 法测定线粒体凋亡途径相关蛋白的表达水平。结果显示,与对照组比较,紫檀芪处理组细胞的 Apaf-1、AIF、Bax、Cyt C、cleaved caspase-3 和 cleaved caspase-9 的水平显著升高,Bcl-2、PC-NA 和 survivin 的水平显著降低。综上所述,紫檀芪可增加结直肠癌细胞内 ROS 水平、降低线粒体膜电位水平,通过线粒体途径促进结直肠癌细胞的凋亡,并且抑制细胞增殖、迁移和侵袭,提示紫檀芪具有治疗结直肠癌的潜在应用价值。参考文献1 Sung H,Ferlay J,Siegel RL,et al.Global cancer statistics 2020:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36cancers in 185 countriesJ.CA Cancer J Clin,2021,71(3):209-2492 郑荣寿,孙可欣,张思维,等.2015 年中国恶性肿瘤流行情况分析J.中华肿瘤杂志,2019,41(1):19-283 Siegel RL,Miller KD,Fedewa SA,et al.Colorectal cancer statistics,2017J.CA Cancer J Clin,2017,67(3):177-1934 Kim H,Seo KH,Yokoyama W.Chemistry of Pterostilbene and itsmetabolic effectsJ.J Agric Food Chem,2020,68(46):12836-128415 Liu Y,You Y,Lu J,et al.Recent advances in synthesis,bioactivi-ty,and pharmacokinetics of Pterostilbene,an important analog of Res-veratrolJ.Molecules,2020,25(21):51666 Kumar V,Haldar S,Das NS,et 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