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42 海洋科学/2023 年/第 47 卷/第 6 期 藻蓝蛋白对博来霉素肺纤维化小鼠肠道菌群的影响 臧 帆1,2,李文军2,3,秦 松2,3,林 剑1(1.烟台大学生命科学学院,山东 烟台 264005;2.中国科学院烟台海岸带研究所,山东 烟台 264003;3.中国科学院海洋大科学研究中心,山东 青岛 266071)摘要:博来霉素(bleomycin,BLM)是目前用于治疗头颈癌等多种癌症的药物之一,但会产生一系列副作用,例如肺纤维化(pulmonary fibrosis,PF),这大大降低了患者的生活质量。藻蓝蛋白(phycocyanin,PC)作为一种色素蛋白对包括 PF 在内的多种疾病具有调节作用。研究发现,慢性肠道疾病通常伴有肺部疾病,患者的肠道菌群会发生紊乱。针对上述线索,研究了 PC 对 BLM 诱导的 PF 小鼠肠道菌群的影响。通过尾静脉将 BLM 注入小鼠体内,以构建肺纤维化模型。然后通过 16S rRNA 高通量基因测序技术,分析了 PC 对 BLM 引起的 PF 小鼠肠道菌群的影响。结果表明,PC 降低了 BLM 诱导的 PF 程度并调节了小鼠的肠道菌群。通过尾静脉注射 BLM 后,小鼠肺部受到损伤,肠道菌群发生紊乱。口服藻蓝蛋白干预后,小鼠的肺组织切片显示其胶原蛋白沉积减少,肺泡间隔和炎性细胞浸润减少,小鼠 PF 程度减轻。此时,小鼠肠道菌群中 Alistipes、Lachnospiraceae 等有益菌的丰度增加,Rikenella 等有害菌的丰度降低,肠道菌群趋于正常。推测 PC 可以通过增加肠道中有益细菌的数量并减少肠道中有害细菌的数量来调节尾静脉注射 BLM 引起的肠道菌群失调,从而降低小鼠的 PF 程度。关键词:藻蓝蛋白;博来霉素;肺纤维化小鼠;肠道菌群 中图分类号:Q93 文献标识码:A 文章编号:1000-3096(2023)6-0042-10 DOI:10.11759/hykx20210206001 博来霉素(bleomycin,BLM)是从轮状链霉菌中分离出的一类抗生素1,可以用于治疗头颈癌、鳞状细胞癌、睾丸癌和某些淋巴瘤等癌症2。但是,使用BLM 可能诱使患者发生肺炎样症状以及肺纤维化(fulmonary fibrosis,PF),甚至造成患者死亡3。BLM 通过静脉注射后,迅速与血液中的二价铜离子结合并被转运至细胞中,引起 DNA 损伤4。这会产生一系列的毒副作用,其中主要影响了患者的肺组织和皮肤组织。研究表明,BLM诱导的肺毒性与PF的病理过程非常相似5,其特征均为上皮修复异常和细胞外基质沉积紊乱。患者随着肺功能丧失、呼吸衰竭等病症的出现,逐渐走向死亡6。目前吡非尼酮和尼达尼布等药物已在临床上用于 PF 的长期治疗中,但这些疗法无法有效地阻止其进一步发展,同时经常会引起不良副作用7。为了减轻患病人员的痛苦以及经济压力,亟需寻找可以更好延缓甚至治疗 PF 病程的药物和方法。藻蓝蛋白(phycocyanin,PC)是藻类生物中的一类色素蛋白,主要存在于蓝藻、红藻以及部分隐藻,此外,在极少数甲藻(如蓝裸甲藻 Gymnodinium cyaneum)中也发现了 PC 的存在8。学者们已经研究了 PC 的多种活性,包括抗氧化性以及抗炎性等9。据报道,PC可以通过在早期抑制 TLR2-MyD88-NF-B 信号通路来促进免疫细胞的增殖和分化,从而在减轻肺损伤和纤维化过程中发挥作用10。随着对 PF 研究的深入,“肠-肺”轴的概念开始得到认可,肺组织与肠道微生物之间存在重要串扰,肠道菌群与肺部的免疫调节系统息息相关11。前期的研究表明,当肺部受到刺激时,肠道微生物的功能发生紊乱,促使脂多糖(LPS)的产生12。LPS 通过与 Toll样受体 4 结合进一步诱导肺部疾病13。PC 干预可以影响肠道菌群的组成,通过增加肠道微生物中双歧杆 收稿日期:2021-02-06;修回日期:2021-02-27 基金项目:烟台市重点研发项目(2019XDHZ101,2020MSGY084);国家重点研发专项(2018YFD0901102)Foundation:Yantai Key R&D Project,Nos.2019XDHZ101,2020MSGY08;National Key Research and Development Project of China,No.2018YFD0901102 作者简介:臧帆(1995),女,汉族,山东烟台人,硕士研究生,研究方向为海洋藻类学,E-mail:;秦松(1968),通信作者,男,汉族,山东烟台人,研究员,博士生导师,研究方向为海洋藻类学、海岸带生物工程,E-mail:;林剑(1963),通信作者,男,汉族,山东烟台人,教授,硕士导师,研究方向为生物工程、微生物发酵,E-mail: Marine Sciences/Vol.47,No.6/2023 43 菌和乳酸菌等有益细菌的相对丰度,提高菌群的免疫力14。同时证明了 PC 干预能够增加与短链脂肪酸生产相关细菌的含量,例如费氏杆菌和拉氏梭菌,其通过促进短链脂肪酸的合成,增强了对 G 蛋白偶联受体的抑制作用,从而引起肺部的免疫调节15。基于以上研究,本研究采用尾静脉注射 BLM 诱导小鼠 PF,并通过肺部病理切片染色及肠道微生物水平来评估 PC 对 PF 的影响。1 材料与方法材料与方法 1.1 伦理声明伦理声明 该研究所涉及的所有动物实验方法均按照滨州医学院动物实验保护指南制定,实验方案经过了山东国际生物技术园动物保养委员会的批准。1.2 实验材料和动物实验材料和动物 30只雄性 ICR小鼠,68周龄,体重 1822 g,购自济南朋悦实验动物繁育中心许可证号:SCXK(鲁)20140007。动物房严格控制 12 h/12 h 明/暗循环,环境温度在(232),环境湿度在 50%60%,小鼠自由饮食,适应性培养 1 周。PC 从螺旋藻中提取,购自新大泽螺旋藻有限公司(中国福清)。小鼠饲料购自济南朋悦动物繁育中心(中国济南)。HE 和 masson 染色试剂盒购自 solarbio(中国北京)。1.3 实验设计实验设计 小鼠常规饲养 1 周后,根据体重按 SPSS 随机分为3 组:对照组(Con 组)、多次静脉注射组(R 组)、多次静脉注射+藻蓝蛋白组(RPC 组),每组 10 只。R 组和 RPC组小鼠经尾静脉注射博来霉素10 mg/kg,每周2次,共8次;RPC 组每天灌胃 50 mg/kg 藻蓝蛋白;Con 组小鼠通过尾静脉注射等量0.9%NaCl 溶液,每周2次,共8次。在实验期间,检测小鼠的活动状态、饮食、体重和死亡情况。1.4 样品采集与处理样品采集与处理 在第一次 BLM 处理后的第 14、28 d,每组随机选取 5 只小鼠进行处死,取出其左肺置于 4%多聚甲醛中固定48 h;在第28 d时,早6点将每只小鼠置于单独的无菌笼中,同时采用无菌冻存管收集约 150 mg 新鲜的粪便样品,并立即保存在80 中直至使用。1.5 肺组织的病理学观察肺组织的病理学观察 肺部组织进行石蜡包埋,制成切片后分别进行HE和 masson 染色;使用 BX-51M 荧光显微镜(Olympus,Japan)观察切片。参照 ashcroft 评分来确定肺泡炎及肺间质纤维化的程度16。1.6 肠道微生物的高通量测序肠道微生物的高通量测序 1.6.1 粪便中粪便中 DNA 的提取和测序的提取和测序 从小鼠粪便样本中分离细菌基因组 DNA,采用TransStart Fastpfu DNA 聚合酶反应体系在 V3-V4 可变区内使用特异性引物 338F 和 806R 进行 PCR 扩增(ABI GeneAmp 9700 型 PCR 仪)(表 1)。通过 2%的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物并进行回收(axygen公司)。使用 DNA 样品制备试剂盒(illumina 公司)构建 MiSeq 文库,并根据测序流程利用 illumina MiSeq测序平台进行测序。通过美吉生物云平台(https:/)进行生物信息学分析。表 1 实验中使用的引物序列 Tab.1 Primer sequences used in the experiment 测序区域引物名称引物序列 338F ACTCCTACGGGAGGCAGCAGV3-V4 可变区 806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT 1.6.2 序列数据分析序列数据分析 对原始序列进行质量过滤,并使用 QIIME 平台的默认参数根据其条形码将其分配给样品,使用usearch 软件平台提取优化序列的非重复序列,取出不重复的单个序列。在 97%的相似性下,对非重复序列进行 OTU 聚类。通过 alpha 多样性分析,反应肠道菌群的丰富度和多样性,包括以下几种统计学分析指数:sobs、chao、shannon、simpson、coverage。使用 R 语言 PCoA 统计分析和作图软件进行 UniFrac PCoA 分析,基于所选距离矩阵进行作图,分析不同组之间的差异,并通过 SPSS 分析 LPS 与肠道菌群的相关性。进行组件显著性差异检验,根据得到的群落丰度数据,对不同组微生物群落之间的物种进行假设检验。评估物种丰度差异的显著性水平,并获得各组之间具有显著性差异的物种。2 结果与讨论结果与讨论 2.1 一般情况及小鼠体质量变化一般情况及小鼠体质量变化 实验过程中,每周对小鼠称重两次。如图 1 所示,Con组小鼠的平均体重呈上升趋势,在第22 d时,平均体重达到最大 39.44 g,而后平均体重降低至 38.76 g,整个 44 海洋科学/2023 年/第 47 卷/第 6 期 实验过程中小鼠的平均体重增长了 4.83 g。与 Con 组比较,R 组和 RPC 组体重明显下降(*P0.05)。R 组小鼠的体重呈缓慢降低再升高的趋势,在给药第 15 d 时,平均体重降至最低31.37 g,这可能是由于多次静脉注射BLM后对小鼠的肠、胃等器官造成了影响,而后平均体重有所上升,增长至33 g,整个实验过程中,体重降低了0.87 g。与R组相比,RPC组平均体重的变化趋势与其相似,但最终结束时,小鼠平均体重降低了 1.75 g,略低于 R 组。图 1 实验开始后各组小鼠的平均体重变化 Fig.1 Changes in the average weight of mice in each group after the start of the experiment 注:Con:对照组;R:多次静脉注射BLM组;RPC:多次静脉注射BLM加 PC 干预组。数据表示为XSD,n=5,与 Con 组比较,*P0.05)2.2 PC 干预可以减轻干预可以减轻 BLM 诱导的诱导的 PF 为了验证 PC 的抗纤维化水平,本课题组采用尾静脉注射 BLM 的方法建立 PF 模型。而后通过组织学分析,包括 masson 染色和 HE 染色,评估 PC 的抗纤维化作用。HE 染色和 ashcroft 评分16用于评估 PF 程度。如图2a所示,PF建模第14 d,R组小鼠的肺组织有明显的淋巴细胞和中性粒细胞浸润(如图 2a 橙色箭头),肺泡隔和肺泡出现炎性渗出增加,肺泡隔增宽,此时 PC 给药组肺泡隔毛细血管扩张且肺泡巨噬细胞稍微增加。ashcroft评分显示,与Con组相比,R组的肺纤维化评分显著升高(P0.05),纤维化等级处于 1 和 2 之间;口服PC 后,RPC 组小鼠肺纤维化程度减轻(P0.05)。在建模第 28 d,R组小鼠肺组织的肺泡隔和肺泡中的炎性细胞浸润有所减少,但肺泡隔进一步增宽,并出现大量成纤维细胞增生结节(图 2b 绿色箭头),此时 RPC 组小鼠的肺泡隔宽度稍微增加。ashcroft 评分显示,与 Con 组相比,R 组小鼠肺纤维化评分显著增加(P0.01),为50.5,小鼠肺部受累面积大于 50%,肺泡系统紊乱,与R组相比,RPC组的肺纤维化评分显著降低(P0.05),小鼠肺部的受累面积在20%50%(图2c)。结果表明,小鼠经过尾静脉注射 BLM 后,肺组织受到了严重破坏,而 PC 给药显著保护了肺泡组织的结构并改善了炎症细胞的浸润,肺纤维化程度降低。图 2 PC 对尾静脉注射 BLM 诱导的肺组织损伤和纤维化的影响 Fig.2 Effects of phycocyanin on lung tissue injury and fibrosis induced by tail vein injection of bleomycin 注:Con:对照组;R:多次静脉注射 BLM 组;RPC:多次静脉注射 BLM 加 PC 干预组。比例尺长度为 100 m。n=5,*P0.05,*P0.01 Marine Sciences/Vol.47,No.6/2023 45 Masson 三色染色显示,BLM 静脉注射第 14 d,R组小鼠有少量胶原纤维沉积,肺泡隔成纤维细胞局限性增生且结节增多,同时结节内有少量胶原纤维沉积(图2b黑色箭头),PC给药组的肺组织结节增多但无明显胶原纤维沉积(图 2b)。实验进行至第 28 d,R 组小鼠在肺血管外膜的外部区域观察到蓝色染色逐渐增加,肺泡隔和结节内有大量胶原纤维沉积,表明胶原蛋白在肺组织和周围的分泌和沉积逐渐增加,此时 PC 给药组明显减少了胶原纤维的沉积(图 2b)。结果表明BLM 诱导导致大量胶原蛋白沉积在肺组织,通过 PC给药可以抑制胶原沉积,进而减轻 BLM 引起的 PF。2.3 PC 对对 BLM 诱导的肺纤维化小鼠肠道菌群的调节诱导的肺纤维化小鼠肠道菌群的调节 2.3.1 多样性分析多样性分析 对 15 只小鼠的粪便样品(每组 5 个)进行 16S rRNA测序,总共得到 359 970 个序列。其中包括 345 个操作生物分类单位(OTU),共分为 9 个门和 85 个属。随着样本数量的增加,Pan(图 3a)/Core(图 3b)曲线趋于平缓,说明实验的数据量足够反映出小鼠肠道微生物组成的真实情况。图 3 OTU 水平的 Pan(a)和 Core(b)曲线图 Fig.3 Pan(a)and Core(b)curves of the OUT level 注:Con:对照组;R:多次静脉注射 BLM 组;RPC:多次静脉注射 BLM 加 PC 干预组 2.3.1.1 alpha 多样性 通过 alpha 多样性分析反映小鼠肠道微生物群的丰富度和多样性。sobs 指数显示了菌群丰富度的实际观测值。与 Con 组相比,BLM 诱导显著降低了菌群丰富度的实际观测值。口服 PC 后,RPC 组菌群丰富度的实际观测值增加(图 4a)。chao 和 ace 指数被用于反应群落丰富度。如图 4b 和 c 所示,与 Con 组相比,BLM诱导显著降低了chao和ace指数,而口服PC改善了这些指标,chao和ace指数相对于Con组和R组均显著升高(P0.05),进一步印证 BLM 静脉注射后降低了小鼠粪便群落的丰富度,而服用PC使粪便中的菌群丰富度增加。在群落多样性分析中,Shannon 和 Simpson 指数被用作反映群落的多样性,它们的变化趋势成反比。相较于 R 组,RPC 组的 Shannon 指数显著增加,Simpson指数显著降低(图 4d 和 e),这表明口服 PC 对肠道菌群多样性产生正面影响,相比于其他两组均能增加小鼠粪便中的群落多样性(P0.05)。肠绒毛是位于肠上皮上的手指状突起,肠绒毛长度增加有利于营养物质的吸收。因此推测口服 PC 后,RPC 组的肠绒毛的长度增加,保护了肠黏膜,从而促进食物的吸收和利用,同时增加了到达下消化道的可微生物利用的物质的数量,从而增加了小鼠肠道菌群的丰富度和多样性14。2.3.1.2 beta 多样性 beta 多样性分析用于比较各组样品之间的物种多样性差异17。为了评估各组小鼠细菌的差异,本课题组进行了 beta 多样性中的主坐标分析(weighted_ unifrac_full_free 距离算法的 PCoA 分析)18。结果显示 Con、R 和 RPC 组沿着主纵坐标轴形成明显的微生物种类群集,R 组小鼠粪便中的菌群类型主要聚集在对照组的右侧,而 PC 给药后,差异向 Con 组的左侧方向发展,口服 PC 后 RPC 组的肠道菌群向 Con组左侧偏移(图 4f)。由此本课题组推测,口服 PC 后,PF小鼠的肠道菌群中的物种分布趋于正常,PC对 PF的干预是起积极作用的。46 海洋科学/2023 年/第 47 卷/第 6 期 图 4 各组小鼠肠道菌群的 alpha 和 beta 多样性指数 Fig.4 Alpha and beta diversity indices of mice intestinal flora in each group 注:Con:对照组;R:多次静脉注射 BLM 组;RPC:多次静脉注射 BLM 加 PC 干预组。*P4)的结构总共发现了 15 个具有统计意义的分类单元,其中 R 组中差异丰富的分类单元的数量是 Con 组的4 倍,其显著增加了 Bacilli、Lactobacillaceae 等有害菌群。而口服 PC 后,增加了包括 Oscillospiraceae、Lachnospiraceae 等有益菌的含量,该结论与上述门和属水平上的小鼠肠道菌群的结构相对应。图 6 不同组小鼠肠道菌群的比较 Fig.6 Differences in the fecal bacterial composition in the three groups 注:Con:对照组;R:多次静脉注射 BLM 组;RPC:多次静脉注射 BLM 加 PC 干预组。通过 LEfSe 分析生成的线性判别分析,LSA 阈值4 48 海洋科学/2023 年/第 47 卷/第 6 期 表 3 三组小鼠的主要肠道菌群在属水平的相对丰度 Tab.3 Relative abundance of the main intestinal flora at the genus level in the three groups 丰度/%Con R RPCnorank_f_Muribaculaceae 20.76 15.5712.52Lachnospiraceae_NK4A136_group 7.21 2.740 26.850Lactobacillus 13.68 20.6901.510Odoribacter 6.44 7.7308.430unclassified_f_Lachnospiracea 4.58 3.6708.580Rikenella 2.76 11.540.92Helicobacter 8.26 4.332.27Bacteroides 5.13 7.582.11Alloprevotella 4.33 2.650.77Alistipes 1.56 1.224.35总占比/%74.71 77.7268.31注:Con:正常对照组;R:多次静脉注射组;RPC:多次静脉注射+口服 PC 组 PC 可以通过增加有益细菌并减少有害细菌的含量来改善由于尾静脉注射 BLM 造成的小鼠肠道菌群失衡。主要的有害细菌包括 Rikenella,其含量增加通常发生在肠炎类疾病的发展过程中,这表明BLM静脉注射过程中不仅对肺部造成了损伤,还可能影响肠组织的功能,而口服 PC 可以减轻 BLM 引起的肠损伤21。同时研究表明,有益菌可以通过杀死病原细菌,定植和拮抗有害细菌,与有害细菌竞争氧气和营养,为肠道提供微生物屏障以及维持或恢复宿主与肠道微生物之间的平衡18。Alistipes 是一类有益细菌,它可以通过赖氨酸发酵产生丁酸,在鼠模型和人类中已分别显示出与结肠炎和肝病密切相关22。它是具有与双歧杆菌相似功能的益生菌,可以调节小鼠的能量代谢并帮助其适应周围环境23。Lachnospiraceae_NK4A136_ group 和 unclassified_f_Lachnospiracea 均属于 Lach-nospiraceae 科,研究认为 Lachnospiraceae 科细菌在肠道中用于丁酸盐的生产,其中丁酸酯可以与其他短链脂肪酸(SCFA)通过不同的机制抑制肠道炎症,维持肠道屏障并调节肠蠕动24-25。PC 对肺纤维化小鼠的肠道菌群起到恢复作用,本课题组猜测可能是由于 PC 经过消化道被胃、肠内的消化酶降解,进而产生了氨基酸、小肽、藻胆素等小分子,这些小分子参与调节肠道菌群的结构,增加了有益细菌的数量,并起到增强 SCFA 合成提高机体免疫力的作用26。同时这些益生细菌可能通过抑制病原微生物对肠上皮细胞的黏附和侵袭并在肠道定植后与病原微生物竞争而有效地抑制病原微生物的生长。2.4 LPS 与优势菌群之间的相关性与优势菌群之间的相关性 通过相关性热图分析 LPS 含量与 RPC 组粪便中优势菌群的相关性,在属水平上评估分类水平在总丰度前20的物种,以找到在PF疾病发生过程中起作用的关键性微生物群。如图 7 所示这些菌属与至少一项 LPS 的指标呈正相关或负相关。大量研究表明,肠道菌群中的许多细菌与炎症相关。例如,Muribaculaceae 代表的拟杆菌门中的菌群,一般情况下它的含量与 LPS 含量成正比,它可以参与自然杀伤细胞和 NF-B 信号传导,同时其可以通过IgA与先天性和适应性免疫反应相互作用27。Lachnospiraceae_NK4A136_group、Akkermansia、Blautia 等有益菌与小鼠肺组织、肠组织以及血清中的 LPS 含量成反比。Akkermansia 可以增强肠壁屏障,其通过在肠壁屏障中摄取黏蛋白并将其转变为 SCFA,包括乙酸盐28。因此猜测 PC 口服后经过胃、肠内的消化酶降解,产生了氨基酸、小肽、藻胆素等小分子,这些小分子促进了有益菌生长并进一步生成丁酸、丙酸盐等 SCFA 的生物合成。本课题组推测口服 PC 后可能通过抑制 LPS 的含量来抑制 TLR4 途径的活化,同时增加肠道菌群中有益细菌的含量,降低有害细菌的含量。与此同时,本课题组的数据强调小鼠口服 PC后观察到的 LPS 的降低可能与毛螺菌科细菌的水平有关,这与 2.3.2 节的结论相符。因此猜测肠道菌群可能与小鼠的炎症有关,而 PC 的抗炎作用在一定程度上与特定的肠道菌群有关。PC 可以促进肠道细菌的生长,相反,肠道细菌也可以利用未消化的蛋白质,然后通过发酵这些饮食营养以产生代谢产物,例如SCFA,它们可以用作结肠上皮细胞的养料并诱导肠道细胞增殖。因此,PC 有益于人体健康。3 结论结论 本研究采用多次静脉注射 BLM 的方式诱导 ICR小鼠肺纤维化,证实了口服 PC 可以减轻小鼠肺纤维化程度。PF 小鼠口服 PC 后,增加了肠道菌群的丰富度和多样性,这可能是由于 PC 能够促进肠道绒毛的生长,这对肠黏膜起到了保护作用,进而增强了小鼠本身对食物的消化吸收能力,从而增加了肠道菌群可利用的营养。同时 BLM 诱导后,小鼠肠道菌群中的有益菌群减少,有害菌群增加,PC处理可以通过增加肠道菌群中 Akkermansia,Lachnospiraceae 等有益 Marine Sciences/Vol.47,No.6/2023 49 图 7 口服 PC 后肠道菌群在属水平的丰度与小鼠肺组织、肠组织和血清中 LPS 含量的相关性分析 Fig.7 Correlation analysis of the abundance of intestinal flora in the RPC group at the genus level and the LPS content in lung tissue,intestinal tissue,and serum 注:红色表示正相关,蓝色表示负相关,属丰度与环境因子之间的相关程度由颜色的强度表示。数据表示为平均值SD(n=5);*P0.05,*P0.01,*P0.001 细菌的数量并减少有害细菌的数量来调节肠道菌群,这为研究疾病和微生态学提供了一些基础数据。为PC 减轻小鼠 PF 的潜在功能和机制提供了新的线索(图 8)。随后的研究需要进一步阐明 PC 的活性是由蛋白质本身还是由其代谢产物决定的,以及蛋白质的代谢产物如何在体内不同的菌群中发挥不同的作用。图 8 藻蓝蛋白对 BLM 诱导的肺纤维化的潜在机制 Fig.8 Potential mechanism of phycocyanin on bleomycin-induced pulmonary fibrosis 50 海洋科学/2023 年/第 47 卷/第 6 期 参考文献:1 HECHT S M.Bleomycin:New perspectives on the mechanism of actionJ.Journal of Natural Products,2000,63(1):158-168.2 YU L,SUN D Y,LIANG F,et al.Ion-pair LCUV method for the determination of boanmycin in mouse plasma and its application to a pharmacokinetic studyJ.Chromatographia,2010,72(s3/4):357-359.3 余林,苟宝迪.博来霉素的抗肿瘤活性及诱导肺纤维化毒性的研究进展J.包头医学院学报,2018,34(11):126-129.YU Lin,GOU Baodi.Research progress on the antitu-mor activity of bleomycin and the toxicity of induced pulmonary fibrosisJ.Journal of Baotou 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