紫斑牡丹花粉复合酶解破壁工艺的研究_王新娣.pdf

甘肃医药 2023 年 42 卷第 6 期Gansu Medical Journal，2023，Vol.42，No.6花粉是高等植物的雄配子体，是植物生命的精华，营养成分丰富。花粉被誉为“微型营养宝库”“全能营养食品”“植物黄金”1。文献报道2，牡丹花粉中富含有多种营养素、维生素和矿物质及含有大量可以促进健康、增加肌体防御能力天然活性物质，包括八十多种酶、黄酮类化合物、激素、核酸和有机酸等。在紫斑牡丹花粉的利用过程中，由于花粉壁具有异常耐酸耐碱耐腐蚀的坚硬外壁，影响其所含营养成分充分地释放出来，就要求将其细胞壁进行破碎。目前尚未见紫斑牡丹花粉破壁的相关报道。因此本研究对紫斑牡丹花粉的破壁进行试验研究。文献报道花粉破壁方法温差破壁3、单一酶解破壁4-8、发酵破壁9、液氮淬冷法10、超临界二氧化碳11、超微粉碎12等，每种方法均存在不足之处。本文根据花粉的细胞特征，采用多种生物酶混合的多酶体系对紫斑牡丹花粉进行酶解破壁，筛选出了花粉破壁条件，为紫斑牡丹花粉破壁提供科学依据，同时也为紫斑牡丹花粉的深加工和应用奠定基础。1材料与方法1.1材料与仪器AE260 万分之一电子天平（瑞士Mettler）、HWCL-3 集成恒温加热磁力搅拌浴（郑州长城科工贸有限公司）、BH-2 电子显微镜（日本 OLYMPUS）、紫斑牡丹花粉（甘肃中川牡丹产业有限公司，批号（20170501），纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶均由天津市诺奥科技公司提供、PT-10 pH 计（德国 Sartorius）。1.2实验方法1.2.1酶解法破壁工艺流程。干燥花粉加酶水浴搅拌冷却破壁检测。1.2.2破壁率的测定。将破壁后花粉搅拌均匀后，用玻璃棒蘸取一滴花粉溶液，用蒸馏水稀释，制片，在（1040）电子显微镜下进行镜检。重复制三片张，每张随机观察视野中央附近 100 个花粉粒，计算破壁率（破壁：细胞壁破膜；没有破壁：外形无明显变化、内膜膨胀不破膜）。破壁率（%）=观察到的破壁花粉粒数观察到的总花粉粒数100%1.3单因素实验1.3.1复合酶体系中各种酶制剂的配比试验。纤维素酶加入量对紫斑牡丹花粉破壁率的影响：加入 1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%不同量的纤维素酶对紫斑牡丹花粉破壁率的影响。果胶酶加入量对紫斑牡丹花粉破壁率的影响：在纤维素酶加入量的基础上，研究加入 0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%不同量的果胶酶对紫斑牡丹花粉破壁率的影响。木聚糖酶加入量对紫斑牡丹花粉破壁率的影响：确定最佳纤维素酶和果胶酶加入量的基础上，研究加入 0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%不同量的木聚糖酶量对紫斑牡丹花粉破壁率的影响。1.3.2单因素的影响。液料比的影响：在 pH 为 5.0，酶解温度为 50，加入定量复合酶，分别在液料比为5 1、10 1、15 1、20 1、25 1、30 1 的条件下，对紫斑牡丹花粉酶解 6h，研究液料比对花粉破壁率的影响。酶解时间的影响：在 pH 为 5.0，酶解温度为紫斑牡丹花粉复合酶解破壁工艺的研究王新娣1马佰菁1王信2刘东彦1石晓峰11.甘肃省医学科学研究院，甘肃 兰州 730050；2.甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州 730000【摘要】目的：研究紫斑牡丹花粉酶解破壁工艺。方法：通过单因素试验确定纤维素酶果胶酶木聚糖酶 3 种酶制剂的浓度。在单因素试验基础上，采用响应面分析法优化紫斑牡丹花粉酶解破壁工艺条件，研究酶解温度、酶解 pH、酶解时间及液料比四个因素对酶解工艺条件的影响。结果：在纤维素酶浓度为 5.0%、果胶酶浓度为 1.0%、木聚糖酶浓度为 1.0%的基础上，以紫斑牡丹花粉的破壁率为响应值，确定酶解破壁工艺的最佳条件为：酶解时间 8h，酶解 pH 4.65，液料比 18 1（mL/g）和酶解温度 52，在此条件下破壁率为81.8%。结论：优化得到牡丹花粉复合酶解破壁工艺，合理可行，相关研究结果为紫斑牡丹花粉的开发应用奠定基础。【关键词】紫斑牡丹花粉；破壁；响应面分析法中图分类号：R281.5文献标志码：A文章编号：1004-2725（2023）06-0533-04药学基金项目：1.兰州市科技发展指导性计划项目（编号：2019-ZD-132）；2.甘肃省医学科学研究院中青年科技人才创新工程项目（编号：ykz-2018-2）；3.兰州市人才创新创业项目（2021-RC-112）第一作者：王新娣，女，助理研究员，从事中药药效物质基础研究工作通信作者：石晓峰，男，教授，博士生导师，中药药效物质基础及质量控制研究工作。E-mail：533DOI:10.15975/ki.gsyy.2023.06.015甘肃医药 2023 年 42 卷第 6 期Gansu Medical Journal，2023，Vol.42，No.6图 2花粉破壁后50，加入定量复合酶，液料比为 20 1，分别在酶解时间 2h、4h、6h、8h、10h 的条件下，研究酶解时间对破壁率的影响。酶解 pH 的影响：在酶解温度为 50，加入定量复合酶，液料比为 20 1，分别在 pH 为 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5 的条件下，对牡丹花粉酶解 6h，研究pH 对花粉破壁率的影响。酶解温度的影响：在 pH为 5.0，加入定量复合酶，液料比为 20 1，分别在温度为 35、40、45、50、55的条件下，对牡丹花粉酶解 6h，研究酶解温度对花粉破壁率的响。1.4响应面试验据单因素试验结果，在选取对破壁率影响较大的四个因素：pH、酶解时间、酶解温度、液料比，以紫斑牡丹花粉的破壁率为响应值，利用软件DesignExpert 8.0.6 进行四因素三水平的酶解工艺优化试验。2结果与分析2.1紫斑牡丹花粉破壁前后的特征将破壁前后的紫斑牡丹花粉分别置 1040 电子显微镜下观察，发现破壁前花粉均被一层完整的膜包裹，破壁的花粉其包裹的膜层破裂、内容物散在。见图 1，图 2。2.2复合酶体系中各种酶制剂的配比试验2.2.1纤维素酶加入量对紫斑牡丹花粉破壁率的影响。随着纤维素酶加入量的增多，花粉破壁率显著升高。当纤维素酶的加入量为 5.0%和 6.0%时，花粉的破壁率达到最大值，花粉破壁率变化较小，故纤维素酶最适加量为 5.0%。2.2.2果胶酶加入量对紫斑花粉破壁率的影响。当加入果胶酶 0.2%时，花粉的破壁率最低，随着果胶酶加入量的增加，花粉的破壁率在增加。当果胶酶加入量为0.8%时，花粉的破壁率最高，为 70.3%。可能的原因是酶添加量和底物浓度达到饱和状态，花粉细胞壁能够完全被酶解，所以选择果胶酶添加量为 0.8%。2.2.3木聚糖加入量对花粉破壁率的影响。固定纤维素酶的加入量为 5.0%和果胶酶的加入量 0.8%时，木聚糖酶加入量为 0.2%0.8%时花粉的破壁率明显提高；而当木聚糖酶加入量大于 0.8%后，花粉破壁率基本不变，选择 0.8%为木聚糖酶的最适加入量。因此 3种酶制剂的最适加入量配比为纤维素酶 5.0%，果胶酶0.8%，木聚糖酶 0.8%。2.3pH 值对花粉破壁率的影响pH 是影响酶促反应的重要因素，只有在最适 pH 值范围内，酶的活力较高。当 pH 在 3.05.0 时，花粉的破壁率随着 pH 增加而上升；当 pH5.0 时，破壁率下降。当 pH 为 5.0 时，花粉破壁率达到最高值 78.9%。pH 为 5.0 时是复合酶的最适 pH。2.4液料比对紫斑牡丹花粉破壁率的影响当液料比为 10 1 和 15 1 时，花粉的破壁率均在 70.0%以上。但随着料液比的增加，破壁率呈先增加后降低的趋势。当料液比为 201 时，花粉的破壁率达到最高值 78.8%，破壁效果较好，细胞形态较为明显。因此最佳的料液比为 20 1。2.5酶解时间对紫斑牡丹花粉破壁率的影响随酶解时间增加花粉的破壁率先增大后趋于稳定。可能是因为，酶解时间较短时，酶解反应不完全，增加酶解时间，有利于酶解的进行。当酶解时间为 6h 时，花粉破壁率已达到最大，过长时间对破壁率变化不明显。2.6酶解温度对花粉破壁率的影响随着酶解温度的升高，花粉的破壁率逐渐增加，当酶解温度为 50时达到了最大值，之后花粉破壁率呈下降的趋势。这是因为酶解温度过高，则易使酶失活，并且在试验中能发现花粉当温度升高时花粉溶液色泽加深。因此当酶解温度为 50时，花粉的破壁率最高。2.7响应面设计利用 DesignExpert 8.0.6 软件对表 1实验数据进行回归拟合，得到以破壁率为（Y）为响应值的回归方程：Y=-1980.9372+368.92667X1+38.46933X2+36.01450X3+12.35103X4-2.310X1X2-2.11200X1X3+2.12200X1X4+0.0365X2X3-0.36525X2X4-0.0887X3X4-29.82800X12-1.43019X22-0.23813X32-0.41468X42对回归模型进行方差分析，结果见表 2，改实验模型的 P0.05，不显著，说明该模型失拟项相对于绝对误差不显著。回归决定系数 R2=0.9742，修正回归决定系数R2adj=0.9484，说明预测值与试验值具高度相关性，该回归方程对试验拟合度较好。因此，可以用回归模型对试验结果进行分析和预测。方差分析表 2 可知，一次项中酶解时间，酶解 pH对破壁率有极显著影响，酶解温度，液料比对破壁率影响不显著，交互项中 X1X3、X1X4、X2X4对破壁率影响显著，X1X2、X2X3、X2X4、X3X4对破壁率影响不显著。二次项图 1花粉破壁前534甘肃医药 2023 年 42 卷第 6 期Gansu Medical Journal，2023，Vol.42，No.6图 3响应面曲面分析图（f）（a）（b）（c）（d）（e）表 2方差分析表注：A：pH、时间与破壁率的关系；B：pH、温度与破壁率的关系；C：pH、料液比与破壁率的关系；D：时间、温度与破壁率的关系；E：温度、料液比与破壁率的关系；F：时间、料液比与破壁率的关系。A、D、F 图酶解时间越长，响应面图就越高，说明时间越长，花粉的破壁率越高。c，e，f 液料比对花粉的破壁率先增大后减小的变化趋势。酶解 pH 越高，花粉的破壁率越低方差来源平方和自由度均方FP模型2350.2114167.8737.780.001X1121.861121.8627.420.001X2878.091878.09197.590.001X32.2412.240.510.489X419.15119.154.310.057X1X221.34121.344.800.046X1X3111.511111.5125.090.001X1X4112.571112.5725.330.001X2X30.5310.530.120.734X2X453.36153.3612.010.004X3X419.67119.674.430.054X12360.691360.6981.170.001X22212.281212.2847.770.001X32229.891229.8951.730.001X42697.131697.13156.870.001残差62.21144.44失拟项39.87103.990.710.698纯误差22.3545.59总和2412.4228表 1响应面设计与结果中，X12、X22、X32、X42对破壁率有极显著影响。对回归模型进行响应面分析，得到响应面三维立体图，直观地反映了各因素对响应值的影响，响应面曲面分析见图 3。2.8最佳破壁工艺条件的确定和验证试验通过所得回归模型对试验结果进行分析和预测，确定酶解法编号X1酶解 pHX2酶解时间（h）X3酶解温度（）X4液料比（mL/g）破壁率（%）11-10053.172101055.12301-1072.844001060.215000074.29600-1160.937-101070.518100-152.439-10-1060.3710-1-10055.6711-100-170.211200-1-159.8113001-164.0314110066.52150-1-1057.71160-10153.7017-100158.44180-10-149.5019000076.1820000078.9021-110078.262210-1066.1023010-174.3024010163.8925001156.2826100161.8827000076.3628000078.9029011076.80（下转第 560 页）535甘肃医药 2023 年 42 卷第 6 期Gansu Medical Journal，2023，Vol.42，No.6参考文献1 王开发.花粉营养成分与花粉资源利用 M.上海：复旦大学出版社，1993：346.2 孟庆焕.牡丹种皮黄酮提取分离与抗氧化及抗疲劳作用研究 D.哈尔滨：东北林业大学，2013.3 曹龙奎，张学娟，王景会，等.玉米花粉破壁方法试验研究温差法与超微粉碎破壁方法研究 J.中国粉体技术，2003，9（4）：9-12.4 董捷，李春阳，张红城，等.酶法处理对油菜花粉萌发孔通透性改善的研究 J.食品与生物技术学报，2008，27（6）：103-106.5 永宁，卢挺，石玉平.油菜蜂花粉酶法破壁研究 J.天然产物研究与开发，2004，16（3）：228-230.6 杨月琴，胡凤祖，卢挺.青海油菜蜂花粉酶解破壁前后营养成分的比较 J.西北农业学报，2007，16（1）：100-102.7 任向楠，张红城，董捷.蜂花粉破壁的研究进展 J.食品科学，2009，30（21）：380-383.8 何余堂，王婷，于洋，等.玉米花粉混合破壁法的研究 J.食品科学，2006，27（10）：282-284.9 陈蓉.花粉破壁工艺条件的研究 J.食品与发酵科技，2014，50（5）：61-67.10周顺华，陶乐仁，徐斐.液氮淬冷法进行花粉破壁的实验研究 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