长蕊石头花茶安全毒理学研究_祝边疆.pdf

山东化工收稿日期:20221023基金项目:山东省高等学校科技计划:长蕊石头花茶中试生产研究(项目编号 J15LE56)作者简介:祝边疆，副教授，硕士，主要从事植物资源开发研究。长蕊石头花茶安全毒理学研究祝边疆1，张李香2，吴银凤1(1青岛职业技术学院 生化学院，山东 青岛266555;2黑龙江大学 现代农业与生态环境学院，黑龙江 哈尔滨150000)摘要:长蕊石头花茶富含钙、铁、锌、硒、镁等矿质元素，并富含黄酮和皂苷等生物活性物质具有抗氧化、增强细胞活性的功能，本研究对长蕊石头花茶进行了安全性毒理学实验，通过急性毒性实验、小鼠精子畸形实验，结果表明受试长蕊石头花茶属无毒级;小鼠精子致畸形实验结果均为阴性，并对实验动物体重无不良影响，各剂量组与阴性对照组无显著差异。说明长蕊石头花茶无毒、无致畸形作用。本研究为长蕊石头花茶的产品进一步开发提供科学依据。关键词:长蕊石头花茶;急性毒性;遗传毒性实验;安全毒理学评价中图分类号:TQ4607;285文献标识码:A文章编号:1008021X(2023)03004002Study on the Toxicology of Gypsophila Oldhamiana MiqZhu Bianjiang1，Zhang Lixiang2，Wu Yinfeng1(1School of Biological Chemical Engineering，Qingdao Technical College，Qingdao266555，China;2College of Modern Agriculture and Ecological Environment，Heilongjiang University，Harbin150000，China)Abstract:Gypsophila oldhamiana Miq tea is rich in calcium，iron，zinc，selenium and magnesium and other mineral elementsIt isrich in flavonoids and saponin，which have the functions of antioxidation and enhancing cell activityIn this study，the safetytoxicology experiment of Gypsophila oldhamiana Miq tea was carried out Through the acute toxicity test and spermatozoadeformation test on mice，the experimental results showed that the tested Gypsophila oldhamiana Miq tea was nontoxicTheresults of spermatozoa deformation on mice were negative，and there was no adverse effect on the weight of experimental animalsThere was no significant difference between the dose groups and the negative control groupThe results showed that Gypsophilaoldhamiana Miq tea was nontoxic and non teratogenic for miceKey words:Gypsophila oldhamiana Miq tea;acute toxicity;genetic tests;toxicological evaluation长蕊石头花(Gypsophila oldhamiana Miq)为 中国植物志命名，又称霞草、属于石竹科、石头花属。该植物属于中国本土植物，分布于辽宁、河北、山西、陕西、山东、江苏、河南等省，生于海拔 2 000 m 以下山坡草地、灌丛、沙滩乱石间或海滨沙地。中国植物志 记载“根供药用，有清热凉血、消肿止痛、化腐生肌长骨功效”。该植物根的水浸剂可防治蚜虫、红蜘蛛、地老虎等，还可洗涤毛、丝织品。嫩茎叶富含钙、铁、锌、硒、镁等微量元素，富含黄酮和皂苷等保健成分，可开发成茶饮1。1实验材料11主要仪器设备与试剂实验室常用解剖器械、电子天平、冰箱、离心机等。试剂:01%秋水仙素，于棕色瓶中，冰箱保存。1%柠檬酸三钠，取 1 g 柠檬酸三钠(分析纯)，加蒸馏水定容至 100 mL。60%冰乙酸:取 60 mL 冰乙酸(分析纯)，加蒸馏水至100 mL。固定液:V甲醇 V冰乙酸=3 1，现用现配。磷酸盐缓冲液(pH 值 74):取磷酸氢二钠(Na2HPO4，分析纯)947 g 溶于 1 000 mL 蒸馏水中，制备磷酸氢二钠溶液(1/15 mol/L);取磷酸二氢钾(KH2PO4，分析纯)907 g 溶于1 000 mL蒸馏水中，制备磷酸二氢钾溶液(1/15 mol/L)。取磷酸氢二 钠 溶 液(1/15 mol/L)80 mL 与 磷 酸 二 氢 钾 溶 液(1/15 mol/L)20 mL 混合，调 pH 值至 74。Giemsa 染液:称取 Giemsa 染液 38 g，加入 375 mL 甲醇(分析纯)研磨，待完全溶解后再加入 125 mL 甘油。置 37 恒温箱保温 48 h 振摇数次。过滤两周后用。Giemsa 应用液:取 1 份 Giemsa 染液与 9 份磷酸盐缓冲液混合而成，现用现配。12实验材料制备121长蕊石头花茶制备选取长蕊石头花(Gypsophila oldhamiana Miq)芽叶，110 杀青，5 min;揉捻 1020 min;6070 干燥 6090 min，含水量控制在 10%以下。122急性毒性实验样品处理称取 15 g 长蕊石头花茶样品量于烧杯中，加 150 mL 纯水，80 浸泡 30 min 后倒出浸泡液;再加 150 mL 纯水，80 浸泡30 min 后倒出浸泡液。将 2 次浸泡液合并加热浓缩为 20 mL，倒入试剂瓶标识备用2。123小鼠精子畸形实验样品处理称取长蕊石头花茶样品 30 g 于烧杯中，加 150 mL 纯水，80 浸泡 30 min 后倒出浸泡液;再加 150 mL 纯水，80 浸泡30 min后倒出浸泡液。将 2 次浸泡液合并加热浓缩至 60 mL，作为最高剂量 10 000 mg/kg，取最高剂量溶液 15 mL 进行一倍稀释后即为 5 000 mg/kg，取最高剂量溶液 5 mL 进行十倍稀释后即为 1 000 mg/kg3。124实验动物清洁级 IC 小鼠，由浙江实验动物中心提供，使用许可证号SCXK(浙)20140001。急性经口毒性实验用小鼠共 20 只，其中雌雄各 10 只。小鼠精原细胞畸形实验用小鼠共 25 只，雄性。每个受试物组动物按性别分笼饲养。保障每笼动物数能自04SHANDONG CHEMICAL INDUSTY2023 年第 52 卷DOI:10.19319/ki.issn.1008-021x.2023.03.015第 3 期由活动;保持宽松环境以有利于观察。试验期间对实验动物饲喂基础饲料，保障自由饮水。试验前实验动物在试验环境中应进行3 d 的环境适应和检疫观察。实验前禁食 4 h，可自由饮水。选择两种性别的健康成年小鼠(1822 g)。雌性动物应是未交配过、未妊娠的。同性别实验动物个体间体重相差不超过平均体重的20%4。2实验方法21急性毒性实验方法染毒途径:经口灌胃。采用最大耐受剂量法，灌胃剂量为 15 000 mg/kg;染毒前动物禁食 16 h。染毒后，每天观察中毒症状或行为变化，每周称重一次，对中毒死亡动物和染毒后 14 d 存活动物作解剖观察56。22小鼠精子畸形实验方法221染毒及检验经口灌胃染毒。对每组动物连续染毒 5 d，于末次给受试物第 30 d 颈椎脱臼处死小鼠，取附睾制成生理盐水悬液涂片，每组5 张，自然干燥，甲醇固定 7 min，干燥后，伊红染色，镜检78。222对照组用纯化水为阴性对照组，除不使用受试样品外，其他处理与受试物组一致。阳性对照物为环磷酰胺(40 mg/kg 体重，单次腹腔注射)。223剂量受试物设 3 个剂量组:1 000，5 000，10 000 mg/kg。23实验环境屏障环境动物房，使用许可证号:SYXK(浙)20160012，室温 215250;相对湿度 520%650%。3结果与分析31急性毒性实验实验动物在染毒 4 h，全部出现共济失调症状，24 h 后发现症状消失，恢复正常状态，14 d 内未发现任何中毒死亡;雌雄动物的体重未见异常。实验观察结束后，对受试动物进行解剖观察，未见异常。用样品对小鼠的经口灌胃实验得出 LD5015 000 mg/kg，根据急性毒性分级进行判定，该样品属于口服无毒级别，见表 1。表 1长蕊石头花茶急性经口毒性实验结果性别动物数量/只体重/g(?XSD)0 d7 d14 d14 d 增重死亡数/只死亡率/%雄性1020409725414931311710910200雌性10210069252140283140731100032小鼠精子畸形实验实验结果(表 2)与阴性对照组比较，阳性对照组应用剂量40 mg/kg 环磷酰胺引起小鼠畸变精子数显著升高，而各给药组的小鼠畸变精子数与阴性对照组比较，无显著差异。该受试物分1 000，5 000，10 000 mg/kg 三个剂量组，与阴性对照组比较，精子畸变率均无显著差异，受试物对小鼠精子畸形率在正常畸形范围内，未见受试物对小鼠雄性生殖细胞的遗传毒性。表 2长蕊石头花茶致小鼠精子畸形实验结果性别剂量/(mgkg1)动物数受检精子总数/个畸变精子数/个畸变率/雄性阴性对照55 0003597181 00055 0003436865 00055 00031963810 00055 000343686阳性对照55 00012252450注:阳性对照为环磷酰胺，40 mg/kg;阴性对照为纯化水。4讨论急性毒性实验中 14 d 内未发现任何中毒死亡;雌雄动物的体重未见异常，LD5015 000 mg/kg，根据急性毒性分级，可判定长蕊石头花茶口服无毒性。在长蕊石头花茶遗传毒性方面，通过小鼠精子畸形实验三个剂量组(1 000，5 000，10 000 mg/kg)，导致的精子畸变率与阴性对照均无显著差异，受试物对小鼠精子畸形率在正常畸形范围内，说明对小鼠精子细胞无遗传毒性。综上所述长蕊石头花茶安全性良好，可进一步进行保健产品开发和安全研究。参考文献 1 祝边疆，陈旭仁，鲁晓泽长蕊石头花的营养成分及氨基酸分析 J 湖北农业科学，2016，55(15):39853987 2王同壮，王尚，马朋，等绞股蓝叶水提物对糖尿病大鼠降血糖作用研究 J 中草药，2020，51(10):28282834 3黄鑫，宋春莲，潘琼，等黄芩多糖的急性和亚慢性毒性试验 J 黑龙江畜牧兽医，2022(16):116120+140141 4白茹玉，张盼阳，毕亚男，等补骨脂素和异补骨脂素的急性毒性和相互作用J 药物评价研究，2018(6):10681072 5 蔡佳仲，张艳平，刘抗伦，等百两金皂苷 A 的急性与亚急性毒性实验 J 毒理学杂志，2012(1):7072 6 陈耿，徐以泓以阿拉伯树胶为原料的 L阿拉伯糖的急性毒性和遗传毒性研究J 江苏预防医学，2022，33(3):284287+293 7赵春燕，龚加顺，杨磊帮，等梁王茶叶及其速溶茶粉的化学成分分析和抗氧化研究J 食品研究与开发，2020(3):173179 8 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