长茎葡萄蕨藻多糖的理化性质及其对免疫抑制小鼠的调节作用.pdf

广东海洋大学学报Journal of Guangdong Ocean University第 43 卷第 4 期2023 年 7 月Vol.43 No.4Jul.2023陈荫，高畅畅，董喆，等.长茎葡萄蕨藻多糖的理化性质及其对免疫抑制小鼠的调节作用J.广东海洋大学学报,2023,43(4):1-9.收稿日期：2022-10-25基金项目：国家自然科学基金（82173737）第一作者：陈荫（1984），男，博士，教授，研究方向为海洋糖药物学。E-mail:通信作者：林琳（1975），女，硕士，副教授，研究方向为海洋分析化学。E-mail:长茎葡萄蕨藻多糖的理化性质及其对免疫抑制小鼠的调节作用陈荫，高畅畅，董喆，牛春雨，孙坤来,林琳(浙江海洋大学食品与药学学院，浙江 舟山 316022)摘要：【目的】为促进长茎葡萄蕨藻（Caulerpa lentillifera）的开发利用，研究长茎葡萄蕨藻多糖的理化性质和对免疫抑制小鼠的调节作用。【方法】以海南养殖的长茎葡萄蕨藻为研究对象，采用水提醇沉和离子交换柱层析获得多糖成分，用高效凝胶渗透色谱和高效液相色谱法分析多糖分子质量和单糖组成等理化性质，并从动物水平研究多糖对免疫抑制小鼠的免疫调节和抗氧化活性。【结果与结论】长茎葡萄蕨藻粗多糖产率为5.04%，粗多糖脱蛋白后，经强阴离子交换柱层析纯化得到主要多糖组分CP0。理化性质分析表明，CP0的总糖质量分数为70%，硫酸基质量分数为11%；主要由甘露糖、半乳糖和木糖组成，比例为4.4 4.0 1.4，还含有微量的葡萄糖。表明CP0是硫酸化的木糖半乳甘露聚糖，相对分子质量为471 000。原子力显微镜显示，CP0为直径约100 nm的近球体结构。CP0对免疫抑制小鼠脾脏指数、胸腺指数有显著影响（P 0.05），对小鼠白介素（IL2、IL4、IL10）、干扰素（IFN）、肿瘤坏死因子（TNF）、肠道分泌型免疫球蛋白A（SIgA）等6种免疫因子有显著调节作用（P 0.05），对总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）活性等抗氧化指标有显著影响（P 0.05）；通过提高小鼠肠道SIgA含量，发挥肠道免疫调节作用，对环磷酰胺引起的免疫抑制有较好的修复作用，可通过提高免疫抑制小鼠的脾脏指数和胸腺指数恢复免疫平衡，并通过增加体内抗氧化酶的活性提高机体抗氧化水平的能力。关键词：长茎葡萄蕨藻；海藻多糖；分离纯化；硫酸多糖；生物活性中图分类号：R931.77文献标志码：A文章编号：1673-9159（2023）04-0001-09doi：10.3969/j.issn.1673-9159.2023.04.001Physicochemical Properties of Polysaccharide from Caulerpa lentilliferaand Its Regulation Effect on Immunosuppressed MiceCHEN Yin,GAO Chang-chang,DONG Zhe,NIU Chun-yu,SUN Kun-lai,LIN Lin(College of Food and Pharmacy,Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China)Abstract:【Objective】This study aimed to explore the immnoregulation activity of polysaccharidesfrom Caulerpa lentillifera,so as to make better use of C.lentillifera.【Method】Polysaccharides wereextracted from cultured C.lentillifera in Hainan Province by water extraction,alcohol precipitationandion exchange column chromatography.The physicochemical properties of the polysaccharides wereanalyzed by high performance gel permeation chromatography and high performance liquid chromatography.The immune regulation and antioxidant activity of polysaccharides on immunosuppressed mice werestudied.【Result and Conclusion】The yields of the polysaccharides were 5.04%.The mainpolysaccharide fraction CP0 was purified by Q Sepharose Fast Flow ion-exchange.The physicochemical第43卷广东海洋大学学报analysis showed that the total sugar content and sulfate content of the CP0 was 70%and 11%,respectively.The monosaccharide composition showed that CP0 was mainly composed of mannose,galactose and xylose at the ratio of 4.4 4.0 1.4.It indicated that CP0 was a sulfated xylogalactomannan.The average relative molecular weight of CP0 by gel permeation chromatography was estimated to beabout 471 000.Atomic force microscopy(AFM)shows that the morphology of CP0 is a near-sphericalstructure with a diameter of about 100 nm.The immunoregulatory activity of CP0 showed it had goodimmunoregulation effect:significant effects on spleen index and thymus index of immunosuppressedmice(P 0.05).It could significantly regulate 6 immune factors including interleukin(IL2,IL4,IL10),interferon(IFN),tumor necrosis factor(TNF)and intestinal secreted immunoglobulin A(SIgA)in mice(P 0.05).It had significant effects on antioxidant indexes such as total antioxidant capacity(TAOC),superoxide dismutase(SOD),glutathione peroxidase(GSH-Px),catalase(CAT),and malondialdehyde(MDA)activity(P 0.05).These results indicated that CP0 played a good role in intestinal immuneregulation by increasing the content of intestinal SIgA in mice,had a good repair effect on theimmunosuppression caused by cyclophosphamide,improved the spleen index and thymus index ofimmunosuppressed mice,and restored the balance of immune system.And it could improve theantioxidant level by increasing the activity of antioxidant enzymes in the body.Key words:Caulerpa lentillifera;seaweed polysaccharide;purification;sulfated polysaccharide;bioactivity长茎葡萄蕨藻（Caulerpa lentillifera）俗称海葡萄，隶属于绿藻门（Chlorophyta）羽藻目（Bryopsidales）蕨藻科（Caulerpaceae），富含蛋白质、膳食纤维、不饱和脂肪酸、微量元素和多糖等营养物质，是一种低脂肪、零胆固醇的经济海藻4。其有调节免疫和抗炎等生物活性，对心血管疾病和代谢性疾病有调节作用。长茎葡萄蕨藻的品质主要取决于藻体的大小、长度、分支度、密度和色泽，目前仅约40%长茎葡萄蕨藻达到食品级并进入市场。所以，对非食品部分长茎葡萄蕨藻资源开发利用有助于促进海藻高值化利用8-10。绿藻中以多糖为代表的碳水化合物有多种生理和生物学活性，是天然活性化合物的重要资源宝库，有调节免疫、抗病毒、抗凝血、抗肿瘤等多种活性。绿藻多糖不同的连接方式、分子质量、空间结构均会引起生物活性的改变13。海洋绿藻中的硫酸化多糖结构多样，与陆地植物理化性质不同，研究海洋绿藻多糖的理化性质及免疫活性有重要意义。本研究以养殖长茎葡萄蕨藻为原料，提取绿藻多糖，分析长茎葡萄蕨藻多糖的理化性质及对肠道的调节作用，为促进长茎葡萄蕨藻资源的充分开发利用提供参考。1 材料与方法1.1 主要材料、试剂与仪器长茎葡萄蕨藻，2022年9月采自海南文昌市海域的养殖海区，采集后盐渍处理；小鼠肿瘤坏死因子-、白介素2、白介素12 和干扰素的ELISA析试剂盒购于上海朗顿生物科技有限公司；总抗氧化能力、抗氧化酶活性检测试剂盒购于上海索莱宝生物科技有限公司；高效凝胶渗透色谱仪（SchambeckSFD S2020，德国）；高效液相色谱仪（Agilent-1260，美国）。1.2 方法1.2.1长茎葡萄蕨藻多糖的提取选取新鲜成熟的长茎葡萄蕨藻，清洗，干燥，粉碎，用丙酮脱脂，45 下烘干，得到浅绿色粉末，备用。称取60 g藻粉，以水为溶剂，料液质量（g）体积比（mL）为1 30，80 下提取3 h。以高速离心机离心（7 000 r/min）15 min，收集上清液，浓缩至原体积的1/10，将预冷的无水乙醇缓慢加入浓缩后提取液中，至乙醇体积分数为80%，在4 下醇沉12 h。沉淀复溶于水，离心，除去水不溶性杂质，用Sevage法脱蛋白，用可截留相对分子质量为3 500的透析袋流水透析48 h，除盐，浓缩，冻干，得长茎葡萄蕨藻粗多糖。将10 mg/mL长茎葡萄蕨藻粗多糖溶液通过QSepharose Fast Flow离子交换柱层析分离纯化。依次使用去离子水和 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mol/L的NaCl为流动相，以1 mL/min的流速进行梯度洗脱，用自动收集器收集洗脱下来的组分，用硫酸-苯酚法检测，确定长茎葡萄蕨藻多糖的分布和对应的洗脱梯度。收集各梯度的含糖组分，透析除盐2第4期陈荫等：长茎葡萄蕨藻多糖的理化性质及其对免疫抑制小鼠的调节作用后浓缩、冻干14，得到纯化后的长茎葡萄蕨藻多糖。1.2.2长茎葡萄蕨藻多糖的理化性质分析纯化后的长茎葡萄蕨藻多糖有 4 种组分，分别记为 CP0、CP0.5、CP1、CP1.5，选取占比较大的组分进行后续分析。对占比较大多糖组分以SB-804凝胶色谱柱（8.0 mm 300.0 mm）采用高效凝胶色谱法（HPGPC）分析纯度，根据已知相对分子质量的标准葡聚糖出峰时间推算该多糖的相对分子质量。将长茎葡萄蕨藻多糖进行完全酸水解后，用 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生高效液相色谱法（HPLC），以单糖标准品为对照，测定多糖的单糖组成。以Na2SO4为标准品，以SH-AC-1阴离子交换柱（4.6 mm 250 mm）采用离子色谱法测定硫酸基含量。采用苯酚硫酸法测定长茎葡萄蕨藻多糖的总糖含量，采用福林酚法测定多糖的蛋白含量15。1.2.3长茎葡萄蕨藻多糖的红外光谱分析采用溴化钾（KBr）压片法分析多糖样品的红外光谱，将干燥长茎葡萄蕨藻多糖与真空干燥至恒重的KBr粉末均匀混合（质量比1 200），压成透明的薄片，用红外光谱仪（Nicolet IS20,赛默飞）扫描，分辨率为4.0 cm-1；背景扫描32次。1.2.4长茎葡萄蕨藻多糖的原子力显微镜观测分析 称取一定量样品，用去离子水溶解，使其最终质量浓度约1.010-3mg/mL。吸取30 L样品稀释液，迅速滴在新鲜云母片上，吸附约10 min后用定性滤纸吸去多余液体，待样片干燥后进行原子力显微镜（Atomic force microscope，AFM）扫描。采用美国Bruker Dimension Icon型原子力显微镜检测。扫描模式为 ScanAsyst 智能扫描，扫描频率 1 Hz，探针SCANASYST-AIR，图 像 均 在 轻 敲 模 式(TappingMode)下获得16。1.2.5长茎葡萄蕨藻多糖动物水平的免疫调节活性、抗氧化活性以具有免疫抑制作用的抗肿瘤药物环磷酰胺建立免疫抑制小鼠模型。选用6 8周龄无特定病原体SPF级封闭群小鼠ICR雌性小鼠，体质量为（20.00.2）g。经过一周的适应喂养，小鼠被随机分为6组：空白组（NC），模型组（MC），阳性药组（PC），长茎葡萄蕨藻多糖低、中、高剂量组（分别记为C-L、C-M、C-H）。NC组每天仅用生理盐水（9 g/L）灌胃10 d，其余5个实验组腹腔注射环磷酰胺（CTX）（80 mg/kg），连续注射3 d。对MC组用生理盐水灌胃10 d，PC组用左旋咪唑按40 mg/kg的剂量灌胃10 d；参考相关多糖动物实验17，对多糖组按低、中、高剂量（50、100、200 mg/kg）灌胃10 d。最后1次给药后，停饲小鼠12 h，采用颈椎脱臼法处死小鼠，取出其胸腺和脾脏，称湿质量，计算胸腺、脾脏指数。胸腺（脾脏）指数 胸腺（脾脏）质量（mg）/小鼠体质量（g）10。分析多糖对免疫器官的影响。对小鼠进行眼球取血，采血后立即在低温离心机中以 3 000 r/min 离心 10 min，取上层血清，按照Elisa试剂盒说明书检测小鼠血清中白细胞介素（IL）、干扰素（IFN）和肿瘤坏死因子（TNF）（分别为IL-2、IL-4、IL-10、IFN-、TNF-）的质量浓度（pg/mL），计算辅助型 T 细胞（Th）1 和 2 的比例。(Th1)/(Th2)=(IFN-)+(TNF-)+(IL-2)/(IL-4)+(IL-10)，分析多糖对小鼠免疫因子的影响。收集小鼠小肠内的肠液，低温离心，弃去杂质，取上层清液，按照Elisa试剂盒说明书检测肠液中分泌型免疫球蛋白A（SIgA）含量,分析多糖对小鼠肠道免疫调节活性。1.2.6长茎葡萄蕨藻多糖动物水平的抗氧化活性用1.2.5方法建立免疫抑制小鼠模型。收集小鼠小肠内的肠液，取小鼠肝脏研磨液，以 3 000 r/min低温离心 10 min，弃去杂质，按照抗氧化酶测试试剂盒说明书检测小鼠肠液和肝脏中总抗氧化能力（T-AOC），超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）的含量18。1.3 统计分析所有实验结果以平均值标准差表示，显著性差异使用单因素方差分析（one-way ANOVA 分析）。与对照组相比，P 0.05时差异显著，P 0.001时差异极显著。2 结果与讨论2.1 长茎葡萄蕨藻多糖的提取和分离纯化通过水提、醇沉、脱盐、脱蛋白，获得长茎葡萄蕨藻粗多糖，得率约5.0%。海洋生物多糖多富含糖醛酸和硫酸基团等阴离子基团，因此，长茎葡萄蕨藻多糖通过阴离子交换柱层析进行分离纯化。图1可知，经纯化后，长茎葡萄蕨藻粗多糖主要有CP0、CP0.5、CP1 和 CP1.5 等 4 种多糖组分，产率分别为45.9%、12.7%、9.1%和 6.4%。四组分单糖组成相似，硫酸基团区别较大，收集典型的得率最多的组分CP0进行后续研究。3第43卷广东海洋大学学报2.2 长茎葡萄蕨藻多糖的理化性质分析高效凝胶色谱分析（图 2）表明，CP0在色谱图中显示为相对单一峰，说明CP0的分子质量分布较为集中，纯度较高。将保留时间代入葡聚糖标准曲线后，计算出CP0的相对分子质量为471 000。与大部分海藻多糖相似，长茎葡萄蕨藻多糖属于高分子质量的多糖19。理化性质分析表明，CP0组分含有质量分数为12%的硫酸基团，为硫酸多糖。一般来说，从蕨藻属种类中提取的硫酸多糖，硫酸基团的质量分数集中在10%23%13，长茎葡萄蕨藻多糖的硫酸基团也集中在这一范围。CP0组分为阴离子交换柱层析的水洗组分，含丰富的硫酸根，可能是由于CP0为高分子质量多糖，空间位阻大或者硫酸基团包裹在分子内部未暴露出来，所以离子交换柱不能对其吸附。CP0的总糖质量分数为70%，蛋白质质量分数约为6.2%，不含有糖醛酸。CP0的总糖含量测定结果偏低，但HPGPC结果显示纯度较高，所以排除含杂质的问题，推测主要由硫酸基团取代所致。此外，针对不同的单糖，苯酚硫酸法显色强弱有一定区别，所以杂多糖的总糖含量如选择单一标准品作为对照，也会对总糖含量结果产生影响。高效液相色谱（HPLC）分析（图3）表明，CP0基本是由甘露糖（mannose，Man）和半乳糖（galactose，Gal）组成的硫酸杂多糖，其中还含少量的木糖（xylose，Xyl）和微量的葡萄糖（glucose，Glc）。经计算，组分中各单糖质量分数比例w(Man):w(Gal):w(Xyl):w(Glc)=4.4 4.0 1.4 0.2。文献8,12,20显示，不同来源长茎葡萄蕨藻多糖的单糖组成较为相似，均由甘露糖、半乳糖、葡萄糖和木糖等4种中性糖组成，以甘露糖和半乳糖含量较高，且比例约为1 1，几乎不含糖醛酸。本研究提取的长茎葡萄蕨藻多糖也符合该特征。至于葡萄糖和木糖的含量和比例，不同来源藻体差异较大。泰国产的长茎葡萄蕨藻多糖中葡萄糖质量分数达27%，而木糖仅为7%。也有报道称长茎葡萄蕨藻多糖中木糖质量分数达20%50%，葡萄糖质量分数仅为2%左右20。2.3 红外光谱分析结果CP0组分的红外光谱分析（图4）显示，CP0是一个典型的硫酸多糖。在3 399 cm-1附近宽和强的吸收峰是OH的伸缩振动峰；在2 937 cm-1处是多糖甲基CH的伸缩振动；存在于1 130 1 170 cm-1处的环醚COC的伸缩振动体现了多糖的基本结构特征；鉴于CP0的单糖组成均为中性糖，没有糖醛酸或乙酰基团的羰基振动，1 652 cm-1处为多糖结合水图3CP0的PMP柱前衍生液相色谱Fig.3HPLC chromatogram of the PMP pre-columm derivative CP03500300025002000150010005000光密度OD254 nmManGlcNRhaGlcUAGalUAGlcGalXylArb时间Time/min1020304050（a）标准品Standards（b）样品Sample时间Time/min10203040503500300025002000150010005000光密度OD254 nmManGlcGalXyl图2CP0的HPGPC色谱Fig.2HPGPC chromatogram of CP076543210相对分子质量对数lg Mry=0.709 4x+10.003R2=0.998 15.56.06.57.07.58.08.59.0时间Time/min0.00 1.16 2.32 3.48 4.64 5.80 6.96 8.12 9.28时间Time/min10.4411.607.356.245.124.012.891.780.67-0.45电压Voltage/mV图1长茎葡萄蕨藻多糖强阴离子柱层析的梯度洗脱结果Fig.1Segment elution figure of the crude polysaccharide ofCaulerpa lentillifera on Q Sepharose Fast Flow0.400.350.300.250.200.150.100.050CP0CP0.5CP1CP1.54.54.03.53.02.52.01.51.00.50光密度OD490 nmc(NaCl)/(mol/L)159 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57试管序数 Test tube ordinalOD600 nmc(NaCl)4第4期陈荫等：长茎葡萄蕨藻多糖的理化性质及其对免疫抑制小鼠的调节作用的振动峰。从图 4 中还发现硫酸基特征峰，在1 259 cm-1附近有硫酸基S=O的伸缩振动，在825 cm-1附近有COS的轴向伸缩振动，表明多糖CP0存在硫酸基取代，与理化性质的分析结果一致21。2.4 原子力显微镜观测结果通过原子力显微镜可直接得到多糖样品的空间结构和形貌图。图5可见，CP0样品呈类球状空间结构，直径约100 nm，球形分子有团聚现象。CP0的球状结构进一步确定多糖的硫酸基团可能被包裹在分子内部，使硫酸基团不能有效地与离子交换柱层析填料的离子交换基团接触，造成CP0虽带有较多硫酸基团，但不能在离子交换柱层析上有效吸附，因而在水洗组分中出现20,22。2.5 免疫调节活性2.5.1多糖对免疫器官的影响哺乳动物的免疫器官状况一定程度上影响免疫水平，免疫器官指数可粗略估计免疫功能的强弱。环磷酰胺是治疗恶性肿瘤的最常见烷化剂，有广谱抗肿瘤作用，是联合化疗、手术和放疗辅助化疗的常见药物之一，环磷酰胺的毒副作用主要是免疫抑制，是建立免疫抑制动物模型的主要药物。以环磷酰胺为免疫抑制剂进行实验鼠造模，造成免疫功能紊乱，以临床上与抗癌药合用减轻抗癌药物细胞毒性的免疫调节剂左旋咪唑为阳性药。本研究对小鼠进行环磷酰胺免疫抑制造模后给药治疗，通过测量小鼠胸腺和脾脏指数研究多糖对小鼠免疫器官的调节作用。图6可见，空白组小鼠胸腺和脾脏指数分别为（3.52 0.35）mg/g和（6.70 0.66）mg/g，造模后模型组小鼠的胸腺和脾脏指数分别为（1.37 0.23）mg/g 和（3.21 0.31）mg/g，与空白组相比极显著降低（P 0.01），说明环磷酰胺对小鼠免疫器官损伤造模成功。左旋咪唑和多糖CP0给药后，与模型组相比，左旋咪唑对小鼠免疫器官指数的影响极显著提升（P 0.05），在中、高剂量给药时，小鼠脾脏指数浓度依赖型显著增加（P 0.05）。多糖对小鼠胸腺指数的影响呈浓度依赖型显著增加（P 0.05）。综上，多糖CP0对小鼠胸腺指数有显著调节作用，对中、高剂量组小鼠脾脏指数有显著影响，且呈浓度依赖型增长。初步推测多糖CP0可对受损的免疫器官起恢复作用，可缓解免疫器官萎缩的症状23。2.5.2多糖对小鼠免疫因子的影响人体黏膜表面的SIgA是机体抵御细菌和病毒等病原体侵袭的第一道免疫防线。从图7可见，造模前空白组小鼠肠图5CP0 的原子力显微镜图Fig.5Atomic force microscopy chart of CP08.8 nm-5.4 nmHeight sensor300.0 nm图4CP0的红外光谱Fig.4Infrared Spectroscopy of CP010095908580透过率Transmittance/%3800 3400 3000 2600 2200 1800 1400 1000 600波数Wave number/cm-1339929371652125911501070825图6多糖CP0对小鼠免疫指数的影响Fig.6Effects of CP0 on immune index of mice与NC组比较，*表示P0.01；与MC组比较，#表示P0.01，#表示P0.05Compared with group NC,*indicates P0.01;Compared with groupMC,#indicates P0.01,and#indicates P0.05脾脏指数Spleen index/(mg/g)876543210*#*#*#*NC MCPCC-L C-M C-H组别Groups胸腺指数Thymus index/(mg/g)4.53.52.51.50.5NC MCPCC-L C-M C-H组别Groups*#*#*#*#*5第43卷广东海洋大学学报液内 SIgA 质量浓度为(3.890.12)g/mL，造模后模型组小鼠肠液内SIgA质量浓度降至(3.160.18)g/mL，差异有统计学意义（P 0.01）。给药后，阳性药组 SIgA 质量浓度为（3.710.26）g/mL，与模型组相比显著提高且活性最佳（P 0.01）。CP0在中、高剂量给药时，SIgA含量显著增加且呈浓度依赖型（P 0.05），分别为（3.600.23）和（3.680.36）g/mL。表明CP0在中、高剂量时对小鼠胃肠道免疫有一定正向调节作用。细胞因子是由活化的单核巨噬细胞和淋巴细胞分泌的低分子质量蛋白，在人体内相互协同又相互拮抗，形成复杂的细胞因子调节网络，参与人体多种重要生理活动，调节免疫相关反应。细胞因子种类繁多，IL、IFN和TNF等细胞因子主要由Th分泌。Th 有多种亚型，其中 Th1 和 Th2 较为重要。Th1主要分泌IL-2、IL-12、TNF-和IFN-，Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-10和IL-13。(Th1)/(Th2)是描述免疫平衡状态的指标之一。本研究对小鼠造模，测定小鼠免疫因子并计算(Th1)/(Th2)，研究多糖CP0对小鼠胃肠道及体内免疫功能的调节作用，与文献24相一致。结果表明，多糖 CP0对 Th1分泌的IL-2、TNF-和IFN-产生调节作用（图7），造模后模型组小鼠血清内IL-2、TNF-和IFN-的含量与空白组相比显著降低（P 0.01）。阳性药可极显著提高造模后小鼠血清中细胞因子的含量（P 0.01）。与模型组相比，给药组CP0可显著提高免疫抑制小鼠血清内IL-2的含量（P 0.05），且呈浓度依赖型。多糖在中高剂量给药时显著增加TNF-的含量和IFN-的分泌（P 0.01）。多糖CP0对Th2分泌的IL-4和IL-10也有一定作用。如图7所示，造模后模型组小鼠血清内IL-4和IL-10的含量与空白组相比显著降低（P 0.01），多糖CP0在中高剂量给药时可显著增加IL-4和IL-10的含量（P 0.01），且呈浓度依赖型，可缓解环磷酰胺对IL-4和IL-10的分泌有抑制作用。表 1可见，造模前空白组小鼠血清内(Th1)/(Th2)为 3.120.12，造模后模型组小鼠血清内(Th1)/(Th2)为 3.420.14，与空白组相比，小鼠血清内细胞因子的平衡值显著升高（P 0.01），证明环磷酰胺造模可打破正常小鼠体内的细胞因子分泌的平衡值，造成免疫功能紊乱。阳性药组可显著改变造模后小鼠血清中(Th1)/(Th2)的值（P 0.01），恢复小鼠体内的免疫平衡。多糖 CP0在中高剂量给药时小鼠血清内(Th1)/(Th2)分别为 3.240.12和3.190.10，且呈浓度依赖型降低（P 0.05）。2.5.3多糖对小鼠体内抗氧化指标的影响对小鼠造模后，环磷酰胺在肝脏磷酰胺酶或磷酸酶水解作用下转化成磷酰胺氮芥，诱导自由基的生成，从而图7CP0对小鼠免疫因子分泌的影响Fig.7Effects of CP0 on immune factor secretion in mice与NC组比较，*表示P0.01；与MC组比较，#表示P0.01，#表示P0.05Compared with group NC,*indicates P0.01;Compared with group MC,#indicates P0.01,and#indicates P0.05NC MC PC C-L C-M C-H组别Groups706050403020100NC MC PC C-L C-M C-H组别Groups806040200白介素10质量浓度Mass fraction of IL-10/(pg/mL)4030201003590450肿瘤坏死因子质量浓度Mass fraction of TNF-/(pg/mL)干扰素质量浓度Mass fraction of IFN-/(pg/mL)1501209060300(分泌型免疫球蛋白)Mass fraction of SIgA/(pg/mL)43210NC MC PC C-L C-M C-H组别GroupsNC MC PC C-L C-M C-H组别GroupsNC MC PC C-L C-M C-H组别GroupsNC MC PC C-L C-M C-H组别Groups*#*#*#*#*#*#*#*#*#*#*#*#*#*#*#*#*#*#*白介素2质量浓度Mass fraction of IL-2/(pg/mL)白介素4质量浓度Mass fraction of IL-4/(pg/mL)6第4期陈荫等：长茎葡萄蕨藻多糖的理化性质及其对免疫抑制小鼠的调节作用产生氧化损伤。如图8所示，造模后模型组小鼠肝脏中的细胞毒性产物丙二醛（MDA）含量与空白组相比显著增加（P 0.01），说明环磷酰胺造模对小鼠肝脏造成了一定的氧化损伤。阳性药左旋咪唑对小鼠肝脏内氧化应激有较好的调节作用。给药后，多糖CP0在低、中、高3种剂量时，小鼠肝脏中MDA含量显著地呈浓度依赖型降低（P 0.01），表明多糖CP0有降低小鼠肝脏氧化损伤水平的作用。与模型组相比，阳性药可显著提升小鼠肝脏内的抗氧化水平（P 0.01）。多糖CP0在中、高两种剂量给药后小鼠肝脏中T-AOC显著地呈浓度依赖型增加（P 0.01），表明多糖CP0在中高浓度可以显著提升小鼠肝脏总抗氧化能力。与空白组相比，模型组CAT、SOD和GSH-Px等3种抗氧化酶活性显著降低（P 0.01），说明环磷酰胺可抑制小鼠肝脏内抗氧化酶活性。给药后，阳性药组小鼠肝脏内的抗氧化酶活性显著提升（P 0.01），多糖CP0在低、中、高3种剂量下显著提升小鼠肝脏中CAT和SOD活性（P 0.05），且对CAT活性的提升呈浓度依赖型增加。CP0在中、高剂量给药下显著提高小鼠肝脏内 GSH-Px 的含量（P 0.01），且呈浓度依赖型提升。表明多糖CP0在低、中、高3种剂量给药时可显著提升小鼠肝脏内CAT和 SOD 的活性，在中、高剂量给药时可显著提升GSH-Px的活性。如图 9所示，给药后多糖 CP0在低、中、高 3种剂量时，小鼠肠组织中MDA含量显著地呈浓度依赖型降低（P 0.05），表明多糖CP0有降低小鼠肠道内氧化损伤水平的作用。多糖CP0在中、高剂量给药后小鼠肠组织中T-AOC活性显著地呈浓度依赖型增加（P 0.05）。表明多糖CP0在中、高浓度可显著提升小鼠肠道内总抗氧化能力。多糖CP0在中、高剂量给药时，可显著提升小鼠肠道内GSH-Px和SOD活性（P 0.01），但对肠道CAT活性的调节不明显，仅可在高剂量给药下提高小鼠肠道内的CAT水平（P 0.01）。长茎葡萄蕨藻多糖通过调节肠道菌群发挥稳说明：与NC组比较，*表示P0.01；与MC组比较，#表示P0.01，#表示P0.05。Notes:Compared with group NC,*indicates P0.01;Compared withgroup MC,#indicates P0.01,and#indicates P0.05.组别GroupsNCMCPCC-LC-MC-H(Th1)/(Th2)3.120.123.420.01*3.180.14#3.360.01*3.240.12#3.190.10#表1CP0对(Th1)/(Th2)的影响Table 1Effects of CP0 on(Th1)/(Th2)图8CP0对小鼠肝脏内抗氧化能力的影响Fig.8Effects of CP0 on antioxidative capacity in mouse livers与NC组比较，*表示P0.01；与MC组比较，#表示P0.01，#表示P0.05。Compared with group NC,*indicates P0.01;Compared with group MC,#indicates P0.01,and#indicates P0.05.0.120.100.080.060.040.020总抗氧化能力T-AOC/(mmol/mL)NC MCPC C-L C-M C-H组别Groups200150100500超氧物歧化酶活性SOD activity/(U/mg)6543210丙二醛质量摩尔浓度Molality of MDA/(nmol/mg)过氧化氢酶活性CAT activity/(U/mg)6543210超谷胱甘肽过氧化物酶活性GSH-Px activity/(U/mg)120100806040200NC MC PC C-L C-M C-H组别GroupsNC MC PC C-LC-M C-H组别GroupsNC MCPC C-L C-M C-H组别GroupsNC MC PC C-L C-M C-H组别Groups*#*#*#*#*#*#*#*#*#*#*#*#*#*#*#*#*7第43卷广东海洋大学学报定肠道内微环境作用25，但是长茎葡萄蕨藻多糖对肠道抗氧化的调节作用，对免疫平衡状态的影响，对肠道菌群的调节作用，以及三者间的相互关系，还需更进一步探索。3 结论以海南的养殖长茎葡萄蕨藻为原料，采用水提醇沉法提取多糖，经强阴离子柱层析以及凝胶柱层析分离纯化后得到多糖CP0组分。CP0为硫酸木糖半乳甘露聚糖，相对分子质量为471 000，硫酸基团质量分数为11%，空间结构为近球形状态。多糖 CP0 可提升肠道中氧化酶 CAT、SOD 和GSH-Px的活性，增强肠道内总抗氧化活性，缓解肠道受到的氧化损伤。CP0有一定肠道免疫调节作用，可促进细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、TNF-和IFN-的分泌，还可调节免疫平衡，增强肠道中分泌型免疫球蛋白A的含量。CP0可通过增加体内抗氧化酶的活性来提高机体抗氧化水平。综上可见，长茎葡萄蕨藻多糖是长茎葡萄蕨藻重要活性成分。参考文献1 STUTHMANN L E,Achuthan R,Pribbernow M,et al.Improving the nutritional value of edible Caulerpa lentillifera(Chlorophyta)using high light intensities.A realistic toolfor sea grape farmersJ.Algal Research,2022,66:102785.2 廖静.海葡萄实现批量养殖:8年反复试验的结果,产业链完善仍需努力J.海洋与渔业,2017(10):50-51.3 方再光.海葡萄：海南海水养殖产业发展的新引擎与助推器J.中国农村科技,2020(7):25-27.4 龙海珊,谭彩军,冯献真,等.海葡萄主要营养成分的比较分析J.中国中医药现