芝麻香白酒堆积及发酵过程中酒醅理化指标变化的研究_王文洁_.pdf

DOI：10.13746/j.njkj.2022188作者简介：王文洁（1995-），助理工程师，硕士，研究方向为白酒酿造工艺技术，E-mail：。通讯作者：马春玲，女，教授，博士，研究方向为微生物菌种分离鉴定、微生物发酵产品开发，酶的分离纯化、基因克隆等，E-mail：machun-。芝麻香白酒堆积及发酵过程中酒醅理化指标变化的研究王文洁，马春玲，刘玉涛，张梦梦，吴玉轩，赵巧珍，胥鑫钰（1.齐鲁工业大学（山东省科学院）生物工程学院，山东 济南 250353；2.济南趵突泉酿酒有限责任公司，山东 济南 250115）摘要：为了进一步明确芝麻香型白酒的酿造机理，利用可培养技术对堆积过程微生物变化规律、堆积及入池后酒醅的生理生化指标变化进行了研究。研究表明，堆积过程中不断富集空气中的酵母菌与细菌并不断增殖，霉菌逐渐死亡；堆积过程是一个不断消耗淀粉，增加温度、酸度与糖分的过程，为芝麻香型白酒的后续发酵与香气前体物质的生成奠定了基础。关键词：芝麻香型白酒；堆积过程；酒醅；理化；微生物中图分类号：TS262.3；TS261.7文献标识码：A文章编号：1001-9286（2023）04-0017-05Changes of Physicochemical Indexes of Fermented Grains ofZhimaxiang Baijiu during FermentationWANG Wenjie,MA Chunling,LIU Yutao,ZHANG Mengmeng,WU Yuxuan,ZHAO Qiaozhen and XU Xinyu(1.School of Bioengineering,Qilu University of Technology(Shandong Academy of Sciences),Jinan,Shandong 250353;2.Jinan Baotuquan Distillery Co.Ltd.,Jinan,Shandong 250115,China)Abstract:In order to clarify the fermentation mechanism of Zhimaxiang Baijiu,we studied the changes of microorganisms during thestacking fermentation process,and the changes of physicochemical indexes of the fermented grains during the stacking fermentationprocess and the in-pit fermentation process.The results showed that during the stacking fermentation process,yeasts and bacteria pro-liferated,while molds gradually declined;starch was continuously consumed,and temperature,acids and saccharides increased.Thestacking fermentation process lays the foundation for the subsequent fermentation of Zhimaxiang Baijiu and the generation of aromaprecursors.Key words:Zhimaxiang Baijiu;stacking fermentation;fermented grains;physicochemical indexes;microorganisms芝麻香型白酒采用高温大曲与芝麻香专用曲混用，砖底泥窖发酵，分级摘酒，长期贮藏，精心勾调。在酿造工艺上吸收了酱香型白酒“四高一长”的特点，又加入各种有益微生物纯培养相结合的工艺，进一步丰富了芝麻香型白酒的典型风格。芝麻香型白酒制作流程中的一个重要环节就是高温堆积发酵，酒醅的处理过程相当于“二次制曲”。随着生物堆积工艺的开展，原料中的淀粉、蛋白质和高分子等有机物在细菌、酵母菌、霉菌和各种酶的协同作用下，不断地被分解成还原糖和游离态氨基酸，再进行美拉德反应得到各种香气物质或前体产物1。本研究主要通过追踪研究芝麻香高温堆积和发酵过程中酒醅生理生化指标的动态变化，运用生物可培养技术对发酵过程中酵母、细菌和霉菌的动态变化规律进行实时检测2，分析了芝麻香型白酒酒醅堆积过程和酿造机理,进一步说明了高温堆积在芝麻香型白酒酿制过程中的重要意义，提供数据酿酒科技2023年第4期（总第346期）LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.4(Tol.346)1717酿酒科技2023年第4期（总第346期）LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.4(Tol.346)化的理论支撑,为酒醅入池后发酵过程奠定了良好的理论与物质基础，更好的指导工业生产。1材料与方法1.1材料1.1.1样品来源以济南趵突泉酿酒有限公司芝麻香手工酿造车间为研究对象，对高温堆积过程中的酒醅进行分析。1.1.2培养基配制酵母菌培养基：酵母浸粉10 g、葡萄糖20 g、蛋白胨 20 g、琼脂 20 g、水 1000 mL，200 mg/mL 氯霉素3 mL，115 湿热灭菌30 min。霉菌培养基：土豆 200 g、葡萄糖 20 g、琼脂20 g。土豆去皮后称重，切片煮沸至软烂，纱布过滤后定容至 1000 mL，3 mL 200 mg/mL 氯霉素，115 湿热灭菌30 min。细菌培养基：胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母提取物5 g，琼脂20 g，水1000 mL，8 g/mL两性霉素400 L，115 湿热灭菌30 min。1.2试验方法1.2.1堆积过程取样时间点设计预实验监测堆积过程中不同时间段堆积酒醅温度的变化情况，找到温度变化明显的时间段，设计取样时间，在堆积的第 0 h、8 h、16 h、20 h、24 h、32 h、40 h堆积结束3时取样。1.2.2堆积发酵过程温度的测定实际堆积厚度为50 cm，实际堆积时间为40 h。测温点部位分下层(距池底 5 cm)、中层(距池底25 cm)、上层(距池底45 cm)，每层间隔放置三个测温点，共9个测温点。固定温度计从堆积开始直至堆积结束，记录测温点温度。1.2.3堆积过程取样空间点设计用酒醅采样器分别于堆积上层、中层、下层均匀取样，测定相关指标，每次采样分为上层、中层和下层三点：上层点（距地面3545 cm）、中层点（距地面2030 cm）、下层点(距地面515 cm)，在每层区域内取6个点样混合均匀作为一个样品。采集的样品在无菌塑料袋中密封保存，于4 保藏备用，尽快分析。1.2.4酒醅理化实验方法对酒醅的水分、酸度、还原糖、粗淀粉等理化指标进行测定，测定方法参考 白酒生产技术全书4。1.2.5不同稀释梯度菌悬液的制备于装有225 mL无菌水的三角瓶中称取25 g酒醅，置于摇床振荡摇匀30 mim制成菌悬液。分别于9 mL无菌水试管中加入1 mL菌悬液，稀释一定的倍数，吸取100 L稀释液于培养基中进行计数，各 3 个平行，用玻璃珠进行涂布，酵母菌置于30、细菌置于37、霉菌置于45 培养箱中培养12 d，对微生物进行计数5。2结果与分析2.1堆积过程中常规理化的变化2.1.1堆积过程中酒醅温度的变化趋势由图1可知，堆积过程中物料的温度呈整体上升趋势，三层堆积起始温度在25 左右，结束温度在50 左右。上层堆积接触环境与空气，微生物生长繁殖旺盛，升温幅度大于中层与下层，在16 h与20 h时变化最为明显，这可能与微生物大量繁殖产热有关。2.1.2堆积过程中酒醅水分的变化趋势微生物正常的生长代谢都离不开水，水是构成微生物细胞的主要成分之一，也是微生物进行各种生命活动的必要条件之一。由图2可知，堆积过程中水分变化并不明显，含量基本稳定在 51%54%之间，整体呈先升高后降低再升高的趋势。下层酒醅由于直接接触地面，水分不易挥发，水分含量高于中层和上层。上层和中层酒醅的水分含量在前20 h整体呈降低的趋势，可能是前期堆积升温图1堆积过程中酒醅温度的变化1818快水分挥发多，微生物生长繁殖旺盛消耗水分多，在后 20 h 水分呈上升趋势，后期温度变化幅度减小，微生物生长代谢会产生部分水分。2.1.3堆积过程中酒醅酸度的变化趋势由图3可知，堆积过程中酒醅酸度整体呈增加的趋势，上层与中层酒醅的酸度整体上高于下层酒醅6。堆积前期主要依靠霉菌产生的酸性蛋白酶有效分解堆积物料中的蛋白质产生各种氨基酸类物质，使得堆积酒醅的酸度不断上升。2.1.4堆积过程中酒醅还原糖的变化趋势由图4可知，堆积过程中酒醅还原糖在016 h增加，在20 h左右被大量消耗，20 h后又逐渐增加并趋于平稳。酒醅中的还原糖以葡萄糖为主，占总糖量的60%左右，为微生物的生长繁殖提供营养物质，还有部分难以被微生物分解消耗的五碳糖，可以与各种氨基酸反应产生香气成分。1620 h微生物生长旺盛消耗营养物质多，还原糖总含量在20 h达到最低点。堆积后期细菌、酵母菌生长趋于平缓，霉菌大量凋亡，还原糖总量开始增多并为后期入池发酵提供营养物质。2.1.5堆积过程中酒醅淀粉的变化趋势由图5可知，堆积酒醅淀粉呈下降趋势，上层与中层酒醅变化比下层明显。随着堆积时间的延长，微生物逐渐富集，蛋白酶与糖化酶的含量逐渐增加，将堆积中的物料逐渐分解，使淀粉类物质释放并分解成葡萄糖等营养物质，表明了堆积过程是芝麻香型白酒酿造的物质积累与准备阶段。2.2堆积过程中微生物菌群的变化2.2.1堆积过程中酵母菌总数的变化趋势酒醅样品稀释后涂布于YPD培养基，30 培养48 h后，培养基上的菌落形态如图6所示。图2堆积过程中酒醅水分的变化图3堆积过程中酒醅酸度的变化图5堆积过程中酒醅淀粉的变化图4堆积过程中酒醅还原糖的变化图6YPD培养基的酵母菌菌落形态王文洁，马春玲，刘玉涛，张梦梦，吴玉轩，赵巧珍，胥鑫钰 芝麻香白酒堆积及发酵过程中酒醅理化指标变化的研究1919酿酒科技2023年第4期（总第346期）LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.4(Tol.346)YPD培养基也适于霉菌的生长，故平板上会同时出现酵母菌和少量的霉菌。霉菌的个头大有绒毛，酵母菌个头小且没有绒毛。生长的酵母菌呈乳白色不透明状，一种表面光滑、湿润，均匀易挑起，一种表面带有褶皱比较粗糙，气味多带有酒香味7。样品稀释玻璃珠涂布培养2 d后，得到堆积过程中酵母菌总数的变化规律如图7所示。由图7可知，随着堆积时间的延长，酵母菌总数也逐渐增多。上层与中层酒醅和环境与空气的接触面积大，故上层与中层酵母菌的数量与生长速率大于下层。堆积结束时，酵母菌总数可达 31074107个/g。在 1624 h，酵母菌生长速率较快，24 h后，由于堆积温度的升高不易于酵母菌的生长，故酵母菌生长速率开始减慢。2.2.2堆积过程中细菌总数的变化趋势酒醅样品稀释后涂布于LB培养基，37 培养48 h后，培养基上的菌落形态如图8所示。生长的细菌呈灰白色不透明，一种小而平坦且带有不规则褶皱形状，不易挑起，一种大而圆润中间有圆形凸起，都带有一股使人不愉悦的臭味。样品稀释玻璃珠涂布培养2 d后，得到堆积过程中细菌总数的变化规律如图9所示。由图9可知，堆积过程中细菌总数与酵母菌总数的变化趋势相同，都呈现持续增长的趋势。与酵母菌一样，上层与中层酒醅中细菌数量比下层多。细菌从 8 h 开始快速增长，到 24 h 时生长速率变缓。堆积结束时，细菌总数可达51076107个/g，细菌总数整体高于酵母菌，堆积后期温度升高不利于酵母菌生长，更利于一些嗜热芽孢杆菌的生长。2.2.3堆积过程中霉菌总数的变化趋势酒醅样品稀释后涂布于PDA培养基，45 培养48 h后，培养基上的菌落形态如图10所示。生长的霉菌形态较大，质地疏松，外观干燥，菌丝细长，不透明呈白色绒毛状，菌落和培养基间紧密连接，不易挑取。样品稀释玻璃珠涂布培养2 d后，得到堆积过程中霉菌总数的变化规律如图11所示。由图11可知，堆积过程中霉菌数量变化不同于酵母菌与细菌，前 20 h 霉菌数量迅速增多，在20 h时达到最高约5104个/g，数量远远小于酵母菌与细菌，2040 h霉菌数量开始大幅下降。霉菌属于好氧菌，堆积前期属于微氧环境宜于霉菌的生长，上层与中层酒醅接触空气，霉菌数量多于下层酒醅。在堆积的后期，堆积内部氧气逐渐被消耗，不利于霉菌的生长。图7堆积过程中酵母菌数量的变化图8LB培养基的细菌菌落形态图9堆积过程中细菌数量的变化20202.3过程发酵中常规理化的变化为探讨堆积酒醅在窖池中的变化，对芝麻香入池后酒醅的理化指标变化进行了跟踪分析，总体变化情况如图12所示。由图12可知，在发酵过程中，酒醅水分呈整体升高的趋势，最后稳定在54%左右；淀粉含量在入池后迅速降低；还原糖含量整体呈降低的趋势，在发酵第1035天时变化明显；酸度在发酵前期基本没有变化，进入第15天时开始上升，最后稳定在6%左右；酒精含量在入池后缓慢增加，最高达到3%vol4%vol。3结论芝麻香高温堆积过程在开放的环境中网罗、富集各种微生物，微生物利用堆积酒醅中的各种营养物质进行繁殖与代谢活动；堆积温度影响微生物的生长代谢，微生物的代谢活动同样会产生一定的热能。堆积过程中酒醅的酸度与还原糖含量呈增加的趋势，淀粉含量一直在降低，水分变化不明显，维持在一定的水平。上层与中层酒醅变化一致且显著高于下层酒醅，与下层酒醅接触地面，含氧量低，微生物代谢缓慢有关。通过可培养技术对微生物进行动态实时检测发现：堆积过程中酵母菌与细菌变化规律一致，呈增长趋势，为后续入池发酵提供大量菌源；霉菌在 20 h 左右随氧气的消耗逐渐死亡。芝麻香白酒的高温堆积过程实际上是酒醅中的各种微生物利用营养物质生长繁殖代谢，产生各种生香前体物质的过程。控制好堆积时间、温度和水分对芝麻香型白酒酿制过程有重要意义，为酒醅入池后发酵过程奠定良好的理论与物质基础,可以更好的指导工业生产。参考文献：1曹润洁,何宏魁,葛向阳,等.芝麻香型酒醅堆积过程中微生物结构变化分析J.微生物学通报,2019,46(6)：1371-1380.2陈向田.芝麻香型白酒堆积过程中关键功能微生物变化的研究J.酿酒,2018,45(6)：39-41.3葛向阳,何惠昭,徐岩,等.杜康复合香酿酒堆积与发酵过程中酒醅理化变化趋势研究J.酿酒科技,2019(12)：89-92.4唐贤华,杨官荣,黄志瑜,等.传统浓香型白酒窖池发酵糟醅研究现状及其展望J.酿酒,2014,41(3)：14-17.5涂昌华,郝飞,汪地强,等.酱香型白酒下沙、造沙轮次堆积发酵过程中酒醅温度与微生物的变化规律分析J.酿酒科技,2020(2)：60-64.6甄攀.不同深度汾酒酒醅酿酒特性研究J.酿酒,2013,40(5)：43-47.7曾凡洲,卫民,蒋剑春,等.乙醇发酵菌种的选育及发酵条件的初步探索试验J.生物质化学工程,2010,44(5)：35-40.图10PDA培养基的酵母菌菌落形态图11堆积过程中霉菌数量的变化图12堆积酒醅入池发酵理化指标的变化王文洁，马春玲，刘玉涛，张梦梦，吴玉轩，赵巧珍，胥鑫钰 芝麻香白酒堆积及发酵过程中酒醅理化指标变化的研究2121