转位蛋白配体XBD173对...炎症反应的减轻作用及其机制_高兴洪.pdf

第 49 卷 第 2 期2023年 3 月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.49 No.2Mar.2023DOI：10.13481/j.1671587X.20230202转位蛋白配体 XBD173对香烟烟雾提取物诱导小鼠肺炎症反应的减轻作用及其机制高兴洪,唐红梅,李月蛟,王孝芸,王星,袁谢芳,吴敏（西南医科大学附属医院炎症与变态反应实验室，四川 泸州 646000）摘要 目的目的：探讨转位蛋白（TSPO）配体 XBD173对香烟烟雾提取物（CSE）诱导小鼠肺炎症反应和巨噬细胞 M1型极化的影响，阐明其相关分子机制。方法方法：18只成年雄性 C57BL/6小鼠随机分为对照组、CSE 组和 CSE+XBD173 组，CSE 组小鼠采取 20 L CSE 滴鼻，CSE+XBD173 组小鼠给予相同剂量 CSE和腹腔注射 10 mg kg1 XBD173。采用 HE染色和 PAS染色观察各组小鼠肺组织病理形态表现。培养小鼠 RAW264.7巨噬细胞，分为对照组、CSE组和 CSE+XBD173组，CSE给药浓度为 1%，XBD173给药浓度为 4 mg L1，对照组给予相同体积的二甲基亚砜；刺激 18 h后，流式细胞术检测各组 RAW264.7细胞中 CD80、CD86、诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）和活性氧（ROS）表达水平及细胞凋亡率，Western blotting法检测各组 RAW264.7细胞中核因子 B/p65（NF-B/p65）和磷酸化 NF-B/p65（p-NF-B/p65）蛋白表达水平。采用 siRNA 敲低 RAW264.7 细胞中 TSPO 表达，实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）法检测各组细胞中白细胞介素 6（IL-6）和肿瘤坏死因子 （TNF-）mRNA表达水平。结果结果：动物实验，与对照组比较，CSE组小鼠肺组织中炎症细胞数量明显增多、支气管管壁增厚；与 CSE 组比较，XBD173+CSE 组小鼠肺组织中炎症细胞减少，支气管管壁变薄。细胞实验，与对照组比较，CSE 组 RAW264.7 细胞中 CD80、CD86、iNOS 和 ROS 表达水平明显升高（P0.05），细胞凋亡率明显升高（P0.05），IL-6 和 TNF-mRNA 表 达 水 平 升 高（P0.05），p-NF-B/p65蛋白表达水平明显升高（P0.05）；与 CSE 组比较，XBD173+CSE 组 RAW264.7 细胞中 CD80、CD86、iNOS 和 ROS 表达水平明显降低（P0.05），细胞凋亡率明显降低（P0.05），IL-6 和 TNF-mRNA 表达水平明显降低（P0.05），p-NF-B/p65蛋白表达水平明显降低（P0.05）。结论结论：XBD173可减轻 CSE 引起的小鼠肺炎症反应，抑制 CSE 诱导的巨噬细胞 M1极化，其机制可能与 NF-B蛋白有关。关键词 转位蛋白；XBD173；烟草提取物；巨噬细胞；核因子 B中图分类号 R392.12文献标志码 A文章编号 1671587X(2023)02027208收稿日期 20220617基金项目 国家自然科学基金青年基金项目（82001703）作者简介 高兴洪（1998），男，四川省凉山彝族自治州人，在读硕士研究生，主要从事呼吸系统相关免疫学方面的研究。通信作者 吴敏，教授，硕士研究生导师（E-mail：min.wumed.und.edu）；袁谢芳，助理研究员，硕士研究生导师（E-mail：yxf_）272高兴洪，等.转位蛋白配体 XBD173对香烟烟雾提取物诱导小鼠肺炎症反应的减轻作用及其机制Attenuating effect of translocator protein ligand XBD173 on pulmonary inflammatory response induced by cigarette smoke extraction in mice and its mechanismGAO Xinghong,TANG Hongmei,LI Yuejiao,WANG Xiaoyun,WANG Xing,YUAN Xiefang,WU Min（Laboratory of Inflammation and Allergy，Affiliated Hospital，Southwest Medical University，Luzhou 646000，China）ABSTRACT Objective：To investigate the effects of translocator protein（TSPO）ligand XBD173 on the pulmonary inflammatory response and M1 polarization of macrophages of the mice induced by cigarette smoke extraction（CSE），and to clarify their realted molecular mechanisms.Methods：A total of 18 adult male C57BL/6 mice were randomly divided into control group，CSE group，and CSE+XBD173 group.The mice in CSE group were intranasally given 20 L CSE，and the mice in CSE+XBD173 group were given the same dose of CSE and intraperitoneally injectied with 10 mg kg1 XBD173.The pathomorphology of lung tissue of the mice in various groups was observed by HE staining and PAS staining.The RAW264.7 macrophage were cultured and divided into control group，CSE group，and CSE+XBD173 group.The CSE administration concentration was 1%，the XBD173 administration concentration was 4 mg L1，and the cells in control group were given the same volume of dimethyl sulfoxide；after 18 h of stimulation，the expression levels of CD80，CD86，inducible nitric oxide synthase（iNOS），reactive oxygen species（ROS）in the RAW264.7 cells，and the apoptotic rates of the RAW264.7 cells in various groups were detected by flow cytometry；Western blotting method was used to detect the expression levels of nuclear factor-B/p65（NF-B/p65）and phosphorylated NF-B/p65（p-NF-B/p65）proteins in the cells in various groups.The siRNA was used to knock down the TSPO expression in the RAW264.7 cells in various groups，and the expression levels of interleukin-6（IL-6）and tumor necrosis factor-（TNF-）mRNA in the cells in various groups were detected by real-time fluorescence quantitative PCR（RT-qPCR）method.Results：The animal experiment results showed that compared with control group，the number of inflammatory cells in lung tissue of the mice in CSE group was increased significantly and the bronchial wall was thicker；compared with CSE group，the number of inflammatory cells in lung tissue of the mice in XBD173+CSE group was decreased and the bronchial wall was thinner.The cell experiment results showed that compared with control group，the expression levels of CD80，CD86，iNOS，and ROS in the RAW264.7 cells in CSE group were increased（P0.05），the apoptotic rate was increased（P0.05），the expression levels of IL-6 and TNF-mRNA were increased（P0.05），and the expression level of p-NF-B/p65 protein was significantly increased（P0.05）；compared with CSE group，the expression levels of CD80，CD86，iNOS，and ROS in the RAW264.7 cells in CSE+XBD173 group were decreased（P0.05），the apoptotic rate was decreased（P0.05），the expression levels of IL-6 and TNF-mRNA were decreased（P0.05），and the expression level of p-NF-B/p65 protein was decreased significantly（P0.05）.Conclusion：XBD173 can alleviate the inflammatory response of lung tissue of the mice and inhibit the M1 polarization of the macrophage induced by CSE，and its mechanism may be related to the NF-B protein.KEYWORDS Translocator protein；XBD173；Cigarette smoke extraction；Macrophage；Nuclear factor-B273第 49 卷 第 2 期 2023 年 3 月吉林大学学报（医学版）自 1956 年 RICHARD-DOLL 阐述了吸烟与肺癌高度相关1，吸烟的危害已经被广泛研究。烟雾暴露可参与机体多种疾病的发生发展，巨噬细胞在受 到 香 烟 烟 雾 提 取 物（cigarette smoke extract，CSE）刺激时，可极化为 M1 型巨噬细胞，分泌多种炎症因子，在 CSE 诱导的肺部炎症反应中具有重 要 作 用2，转 位 蛋 白（translocator protein，TSPO）广泛分布于线粒体外膜，具有调节胆固醇转运、类固醇类激素合成、卟啉转运、血红素合成、细胞凋亡、细胞增殖、离子运输、线粒体功能调节和免疫调节等多种功能3。XBD173为人工合成的 TSPO 配体，研究4显示：XBD173具有良好的抗炎作用和神经保护作用，但 XBD173 对 CSE诱导的肺炎症反应和巨噬细胞极化是否有作用及其可能机制，国内外尚未见相关报道。因此本研究以C57BL/6 小鼠和 RAW264.7 细胞为研究对象，探讨 XBD173 对 CSE 所致小鼠肺部炎症反应和 CSE诱导的巨噬细胞 M1型极化的影响及其可能分子机制，以期为吸烟者的肺炎症治疗提供新思路。1 材料与方法 1.1实验动物实验动物、细胞细胞、主要试剂和仪器主要试剂和仪器18 只 8 周龄 SPF 级 C57BL/6 雄性小鼠购于重庆腾鑫生物技术有限公司，动物使用许可证号：SYXK（川）2018-065，体质量（202）g。12 h交替照明，温度保持在 22 26，自由获取食物和水，按照实验动物许可管理办法 和 实验动物管理条例的相关规定进行实验；香烟（娇子牌）购自成都卷烟厂；小鼠 Raw264.7 巨噬细胞购于中国科学院细胞库；血清购于澳大利亚 Bovogen Biological公司，高糖 DMEM 培养基购于上海源培生物科技股份有限公司，XBD173 购于美国 MedChemExpress 生物科技公司，CD80、CD86和诱导型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）流式抗体均购于赛默飞世尔科技（中国）有限公司，活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司，凋亡检测试剂盒购于四正柏生物有限公司，逆转录试剂盒和逆转录聚合 酶 链 式 反 应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）试剂盒购于南京诺维赞生 物 科 技 有 限 公 司，Western blotting 抗 体GADPH、核因子 B/p65（nuclear factor-B/p65，NF-B/p65）和磷酸化 NF-B/p65（phosphorylated NF-B/p65，p-NF-B/p65）均 购 于 美 国 Cell Signal Technology公司，ECL超敏化学发光试剂盒购自四正柏生物有限公司，TSPO 转染慢病毒、转染试剂和嘌呤霉素购于吉凯基因，HE染色试剂盒、RIPA 裂解液和 SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒均购于碧云天生物技术公司。凝胶成像分析仪购自美国BIO-RAD 公 司，Leica DM2000 显 微 镜 购 自 德 国Leica Microsystems 公司，Centrifuge 5810R 离心机购自德国艾本德公司，Nano400微量分光光度计购自北京原平皓生物技术有限公司，LightCycler480 实时荧光定量 PCR系统购自瑞士罗氏医学仪器公司。1.2CSE 制备制备参照 NAKAMURA 等5方法制备：将香烟烟嘴与泵连接，通过泵的抽气作用吸取香烟燃烧后的烟雾，按每支香烟烟雾溶解于 2 mL PBS 液制成悬液。悬液经 NaOH 调节 pH 值为 7.4，经孔径为 0.2 m 滤膜过滤除去细菌和大颗粒后备用。1.3实 验 动 物 分 组实 验 动 物 分 组、肺 炎 症 模 型 制 备 及 处 理肺 炎 症 模 型 制 备 及 处 理 18 只小鼠随机分为对照组、CSE 组和 CSE+XBD173 组，每组 6 只。CSE 组和 CSE+XBD173组小鼠给予 CSE 滴鼻，每 次 20 L，连 续 28 d，2 次间隔 24 h；在第 2228 天，CSE+XBD173 组小鼠在 CSE 刺激前 0.5 h 给予 10 mg kg1 XBD173腹腔注射。第 29天处死小鼠。1.4HE 染色观察各组小鼠肺组织病理形态表现染色观察各组小鼠肺组织病理形态表现 处死小鼠后取新鲜肺组织，4%多聚甲醛固定20 h。脱水、透明、浸蜡和包埋，将包埋好的肺组织蜡块切片，厚度为 4 m，按 HE染色试剂盒进行后续步骤。染色完成后，显微镜下观察各组小鼠肺组织病理形态表现。1.5PAS 染色观察各组小鼠肺组织病理形态表染色观察各组小鼠肺组织病理形态表现现处死小鼠后取新鲜肺组织，10%甲醛固定，石蜡包埋，2 m 厚度切片后常规脱蜡至水，PAS染色后中性树胶封固。显微镜下观察各组小鼠肺组织病理形态表现。1.6RAW264.7 细胞细胞 TSPO 蛋白敲低和筛选蛋白敲低和筛选将处于对数生长期的 RAW264.7细胞经细胞刮刮下，完全培养基制成细胞密度为（35）104 mL1 的细胞悬液，6孔细胞培养板铺板，每孔 2 mL，培养24 h 后，采用感染复数（multiplicity of infection，MOI）为 20 的慢病毒感染 RAW264.7 细胞以敲低TSPO 基因，培养 12 h 后完全培养基换液继续培养，在完全培养基中加入 2 mg L1嘌呤嘧啶筛选，当病毒载体上的绿色荧光蛋白（green fluorescent 274高兴洪，等.转位蛋白配体 XBD173对香烟烟雾提取物诱导小鼠肺炎症反应的减轻作用及其机制protein，GFP）阳性表达率大于 80%时，收集细胞进行后续实验。TSPO 基因敲低序列，上游引物：5-ACCATTGGGCC-3，下游引物：5-CTG-GTCTA-3。1.7RT-qPCR 法检测各组法检测各组 RAW264.7 细胞中白细胞中白细胞介素细胞介素 6（interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-，TNF-）mRNA 表 达 水表 达 水平平将实验处理后的细胞按照 RNA 提取试剂盒说明书提取 RNA；采用微量分光光度计测定总 RNA纯度，检测 RNA 样本在波长 260 和 280 nm 处的吸光度（A）值，控制 A（260）/A（280）在 1.92.1，RNA 电泳检测其完整性。检测浓度及纯度后取 2 g 总 RNA，采用逆转录试剂盒合成 cDNA。逆转录条件：37 反应 15 min，85 反应 5 s。将逆 转 录 所 得 cDNA 纯 化 后 应 用 RT-qPCR 仪 进 行PCR 扩增。反应总体积为 20 L：2 L cDNA 模板，2 L 引 物，10 L SYBR qPCR Master Mix，6 L H2O。PCR反应条件：95 预变性 30 s，扩增循环 95、5 s，56、34 s，共 40 个 循 环。以-actin 为 参 照，采 用 2Ct法 计 算 IL-6 和 TNF-mRNA相对表达水平。引物序列见表 1。1.8Western blotting 法检测各组法检测各组 RAW264.7细胞细胞中中 NF-B/p65 和和 p-NF-B/p65 蛋白表达水平蛋白表达水平细胞刺激结束后，吸去培养基，PBS 缓 冲 液 洗 涤1次，加入 200 L RIPA 强裂解液，检测蛋白浓度；加入含 SDS 上样缓冲液，煮 10 min；进行 SDS-PAGE 凝胶配制，上样电泳；采用 PVDF 膜转膜；5%脱脂奶粉进行封闭；按照抗体说明书稀释一抗，4 过夜孵育。TBST 洗涤 3 次，进行二抗孵育，4 孵育 2 h，TBST 洗涤 3次后，采用 ECL 超敏化学底物试剂盒上机检测拍照分析；Image J 软件分析各蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。目 的 蛋 白 表 达 水 平=目 的 蛋 白 条 带 灰 度值/-actin蛋白条带灰度值。1.9流式细胞术检测各组流式细胞术检测各组 RAW264.7 细胞细胞 CD80、CD86、iNOS 和和 ROS 表达水平表达水平将各组细胞分装入5 mL 流式细胞管内，离心细胞，弃上清，CD80、CD86 和 iNOS 抗体用孵育缓冲液按照 11 000 稀释，加入 100 L 含抗体的孵育缓冲液，重悬细胞；在冰上孵育 30 min。1 200 r min1离心 5 min，弃上清液；加入 100 L 孵育缓冲液重悬细胞，使用流式细胞分析仪检测分析。ROS 按照试剂盒说明书检测。CD80 和 CD86 表达水平以各组荧光阳性细胞数量占总细胞数百分比表示，iNOS 和 ROS 表达水平以各组细胞的平均荧光强度表示。1.10流式细胞术检测各组流式细胞术检测各组 RAW264.7 细胞凋亡细胞凋亡率率收集已处理好的细胞至离心管内，1 000 g 离心 5 min，弃上清，收集细胞，用 PBS 缓冲液轻轻重悬细胞并计数，取（510）104个万重悬的细胞，1 000 g 离 心 5 min，弃 上 清，加 入 195 L Annexin-FITC 结合液轻轻重悬细胞；加入 5 L Annexin-FITC，混匀；加入 10 L 碘化丙啶染色液，混匀；室温避光孵育 10 min，流式细胞仪检测，按说明书分析。1.11统计学分析统计学分析采用 SPSS 24.0软件进行统计学分析。各组细胞中 CD80、CD86、iNOS 和 ROS表达水平，IL-6 和 TNF-mRNA 表达水平，细胞凋亡率，NF-B/p65和 p-NF-B/p65蛋白表达水平均符合正态分布，以 xs 表示，多组间样本均数比 较采 用单 因素 方差 分析，组 间两 两比 较采 用SNK-q检验。以 P0.05为差异有统计学意义。2 结 果 2.1各组小鼠肺组织病理形态表现各组小鼠肺组织病理形态表现HE 染色和PAS 染色结果显示：对照组小鼠肺组织中支气管结构完整，肺泡腔结构清晰，肺泡壁厚度均匀，无增宽和渗出等现象，肺泡间隔无水肿、无炎症细胞浸润、无分泌物渗出。CSE 组小鼠肺组织中支气管管腔变窄，管壁增厚，有分泌物渗出，可见大量炎症细胞浸润，肺泡结构不完整。CSE+XBD173组小鼠肺组织中炎症表现减轻。见图 1。2.2 各 组各 组 RAW264.7 细 胞 中细 胞 中 M1 表 面 标 志 物表 面 标 志 物CD80、CD86 和和 iNOS 表达水平表达水平与对照组比较，表表 1RT-q qPCR引物序列引物序列TabTab.1 1Primer sequences of RTPrimer sequences of RT-qPCRqPCRGene IL-6TNF-actinForward sequence（53）TACCACTTCACAAGTCGGAGGC GGTGCCTATGTCTCAGCCTCTT CATTGCTGACAGGATGCAGAAGGReverse sequence（53）CTGCAAGTGCATCATCGTTGTTC GCCATAGAACTGATGAGAGGGAGTGCTGGAAGGTGGACAGTGAGG 275第 49 卷 第 2 期 2023 年 3 月吉林大学学报（医学版）CSE组 RAW264.7细胞中 CD80、CD86和 iNOS表达水平明显升高（P0.05或P0.01）；与CSE组比较，CSE+XBD173 组 RAW264.7 细 胞 中 CD80、CD86 和 iNOS 表 达 水 平 明 显 降 低（P0.05）。见图 2。2.3各组各组 RAW264.7细胞中细胞中 ROS表达水平表达水平与对照组（19 2902 906）比较，CSE 组 RAW264.7细胞中 ROS 表达水平（26 7893 980）明显升高（P0.05）；与 CSE 组 比 较，CSE+XBD173 组RAW264.7 细胞中 ROS 水平（20 1204 114）明显降低（P0.05）。2.4 各 组各 组 RAW264.7 细 胞 凋 亡 率细 胞 凋 亡 率 与 对 照 组（8.80%0.42%）比较，CSE 组 RAW264.7 细胞凋亡率（28.96%1.73%）明显升高（P0.05）；与 CSE 组比较，CSE+XBD173 组 RAW2647 细胞凋亡率（22.94%2.2%）明显降低（P0.05）。见图 3。2.5各组各组 RAW264.7细胞中细胞中 IL-6和和 TNF-mRNA表达水平表达水平与对照组比较，CSE 组 RAW264.7 细胞中 IL-6 和 TNF-mRNA 表 达 水 平 明 显 升 高（P0.05）；与 CSE 组 比 较，CSE+XBD173 组RAW264.7 细胞中 IL-6 和 TNF-mRNA 表达水平明显降低（P0.05）。当 RAW264.7 细胞 TSPOA-C：HE staining；D-F：PAS staining；A，D：Control group；B，E：CSE group；C，F：CSE+XBD173 group.图图 1各组小鼠肺组织病理形态表现各组小鼠肺组织病理形态表现（200）Fig.1Pathomorphology of lung tissue of mice in various groups（200）A：CD86；B：CD80；C：iNOS；*P0.05，*P0.01 vs control group；P0.05）。见表 2。2.6 各 组各 组 RAW264.7 细 胞 中细 胞 中 NF-B/p65 和和p-NF-B/p65 蛋白表达水平蛋白表达水平3 组 RAW264.7 细胞中 NF-B/p65 蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P0.05）；与 对 照 组 比 较，CSE 组RAW264.7细胞中 p-NF-B/p65蛋白表达水平明显升高（P0.05）；与CES组比较，CSE+XBD173组RAW264.7细胞中 p-NF-B/p65表达水平明显降低（P0.05）。见图 4。3 讨 论 香烟是一种具有多重毒性的成瘾物，与全身多个器官的损害有关6。香烟烟雾对心血管具有严重的损伤作用，可表现为内皮功能障碍氧化应激增加、心血管发病率和死亡率增加等7。TSPO 首先由 BRAESTRUP 于 1977年发现，被认为与外周的苯二氮卓类结合位点有高亲和性8。正常情况下，TSPO 在中枢神经系统中表达较低，仅限于星形胶质细胞和小胶质细胞，但当脑损伤或炎症时，其表达水平明显升高9-10。在急性肺炎模型中，TSPO可作为衡量炎症损伤的指标11-12。研究13-14表明：TSPO 配体 XBD173可有效缓解视网膜缺血模型中的神经退行性变，还可减轻视网膜色素上皮细胞的炎症反应。本研究结果显示：XBD173可有效抑制A：Control group；B：CSE group；C：CSE+XBD173 group.图图 3流式细胞术检测各组细胞凋亡率流式细胞术检测各组细胞凋亡率Fig.3Apoptotic rates of cells in various groups detected by flow cytometry表表 2RT-qPCR法检测各组细胞中法检测各组细胞中 IL-6和和 TNF-mRNA 表表达水平达水平TabTab.2 2Expression levels of ILExpression levels of IL-6 6 and TNF and TNF-mRNA in cells mRNA in cells in various groups detected by RTin various groups detected by RT-qPCR methodqPCR method(n=3，xs）GroupControlCSECSE+XBD173TSPO KD+controlTSPO KD+CSETSPO KD+CSE+XBD173IL-60.950.072.750.98*0.870.300.320.180.140.070.140.11TNF-1.090.131.610.22*0.650.141.000.100.910.060.750.13*P0.05 compared with control group；P0.05 compared with CSE group.Lane 1-3：Control group；Lane 4-6：CSE group；Lane 7-9：CSE+XBD173 group.*P0.05 vs control group；P0.05 vs CSE group.图图 4Western blotting法检测各组细胞中法检测各组细胞中 NF-B/p65和和 p-NF-B/p65蛋白表达电泳图蛋白表达电泳图（A）及直条图及直条图（B和和 C）Fig.4Electrophoregram(A)and histograms(B，C)of expressions of NF-B/p65 and p-NF-B/p65 proteins in cells in various groups detected by Western blotting method277第 49 卷 第 2 期 2023 年 3 月吉林大学学报（医学版）CSE诱导的肺部炎症反应。巨噬细胞是重要的免疫细胞，其主要的功能包括：吞噬病原体、感染细胞、碎片和死亡细胞；呈递抗原；分泌各种细胞因子15。当巨噬细胞受到刺激时，会极化为 M1 型巨噬细胞和 M2 型巨噬细胞，M1 型巨噬细胞作为一种促炎症细胞存在，主要参与体内的 1 型辅助 T 细胞（T helper 1 cell，TH1）介 导 的 免 疫 反 应，可 分 泌 TNF-、IL-1、IL-12 和 IL-6 等炎症因子15-16，M1 型巨噬细胞参与多种疾病的病理过程。在小鼠蛛网膜下腔出血模型中，TSPO 配体处理可降低小胶质细胞活化和增加抗炎因子的产生 17，TSPO配体2-（2-氯苯基）喹唑啉-4-基二甲基氨基甲酸酯（2-Cl-MGV-1）和 2-苯基喹唑啉-4-基二甲基氨基甲酸酯（MGV-1）可降低脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的小 胶 质 细 胞 炎 症 因 子 TNF-、IL-6 和 IL-1 表达18。本研究结果显示：CSE 刺激使 RAW264.7细胞增加 M1 极化水平和细胞因子分泌，XBD173处理可抑制巨噬细胞 M1极化和细胞因子分泌，与小鼠肺组织的病理结果一致；而在 TSPO 敲低组中，各组之间无明显变化，提示 TSPO 对巨噬细胞功能起重要的调控作用。ROS 既是一种重要的抗菌介质，也是重要的信号分子19，在细胞增殖、缺氧适应和细胞信号传递决定中起重要作用，但过量的 ROS 会导致不可逆的细胞损伤甚至细胞死亡，许多疾病的发生和发展与 ROS 生产过剩有密切关联20。在视网膜损伤模型中，XBD173 可降低巨噬细胞的吞噬能力，减少 ROS 产生从而发挥保护作用21。本研究结果显示：XBD173 可抑制 CSE 诱导的 ROS 产生。细胞产生过量 ROS 会导致细胞凋亡。本研究结果同时显示：XBD173 可抑制 CSE 诱导的细胞凋亡水平。凋亡的巨噬细胞通过释放代谢产物和炎症因子，激活 MAPK 信号通路，导致巨噬细胞 M1极化增加和炎性因子释放22。年龄相关黄斑变性模型的研究13结果显示：XBD173 可通过 NADPH 氧化酶 2（NADPH oxidase 2，NOX2）通路或钙离子减少 ROS 的产生，降低小胶质细胞激活。研究23显 示：TSPO 可 与 NOX2 亚 基 gp91phox 和 p22phox结合，其机制可能与 NOX2通路相关。NF-B 于 1986年作为结合 B 细胞的 轻链增强子的转录因子被发现24。NF-B 家族是真核转录因 子 结 构 相 关 的 蛋 白 家 族，包括 5 个成员：NF-B1（p50 及其前体 p105）、NF-B2（p52 以及其前体 p100）、RelA（p65）、c-Rel 和 RelB，5 个成员在正常状态下通常在细胞质中与 NF-B 抑制因子（inhibitory of NF-B，IB）家族结合保持未激活状态，在其经典激活途径中，当受到相应信号分子刺激时，IB 首先被磷酸化，继而降解，从而促使 NF-B 异二聚体（RelA-p50 二聚体）从细胞质中转移至细胞核，调控巨噬细胞向 M1 型极化，进而促进 IL-1、TNF-和 IL-6 等促炎因子的释放25-26。研究27显示：NF-B 通路参与小胶质细胞炎症的激活。本研究结果显示：CSE 处理组细胞中 p-NF-B/p65 蛋白表达水平升高，而 XBD173可降低其表达水平，提示 XBD173 可能通过调节NF-B通路而发挥抗炎作用。综上所述，TSPO 配体 XBD173可减轻 CSE 诱导的小鼠肺部炎症反应，TSPO 可调控巨噬细胞M1 极化和炎症因子的产生，其机制可能与 NF-B通路有关，但其具体机制仍需进一步研究。本研究为 XBD173对香烟烟雾诱导的肺部炎症反应的保护作用提供了理论和实验依据，未来应进一步结合动物实验和临床试验探索 XBD173的炎症抑制作用机制，为 香烟 烟雾 引起 的肺 部炎 症的 改善 提供 新思路。参考文献1 DOLL R，HILL A B.Lung cancer and other causes of death in relation to smoking J.BMJ，1956，2（5001）：1071-1081.2 FENG H，YIN Y，REN Y，et al.Effect of CSE on M1/M2 polarization in alveolar and peritoneal macrophages at different concentrations and exposure in vitro J.In Vitro Cell Dev Biol Anim，2020，56（2）：154-164.3 ZHANG L，HU K，SHAO T，et al.Recent developments on PET radiotracers for TSPO and their applications in neuroimagingJ.Acta Pharm Sin B，2021，11（2）：373-393.4 ZHOU D，JI L，CHEN Y.TSPO Modulates IL-4-induced microglia/macrophage M2 polarization via PPAR-gamma pathwayJ.J Mol Neurosci，2020，70（4）：542-549.5 NAKAMURA Y，ROMBERGER D J，TATE L，et al.Cigarette smoke inhibits lung fibroblast proliferation and chemotaxis.J.Am J Respir Crit Care Med，1995，151（5）：1497-1503.278高兴洪，等.转位蛋白配体 XBD173对香烟烟雾提取物诱导小鼠肺炎症反应的减轻作用及其机制6 THOMSON N C，POLOSA R，SIN D D.Cigarette smoking and asthma J.J Allergy Clin Immunol Pract，2022，10（11）：2783-2797.7 MNZEL T，HAHAD O，KUNTIC M，et al.Effects of tobacco cigarettes，e-cigarettes，and waterpipe smoking on endothelial function and clinical outcomes J.Eur Heart J，2020，41（41）：4057