原花青素A1抑制NLRP3信号通路缓解抑郁症大鼠海马神经元损伤的研究.pdf

东南大学学报(医学版)()():():.():.王芋霖向守洪李宁等.能谱 定量参数对肺磨玻璃结节定性诊断的价值.肿瘤():.祁闻赵红王龙胜等.肺部磨玻璃结节的高分辨率 征象对结节良恶性的鉴别诊断价值.安徽医学():.陈文哲蒋博.双能低剂量能谱 曲线斜率评估乳腺癌新辅助化疗疗效的价值初探.影像研究与医学应用():.钟文滨黄旭胜龙海琼.能谱 对肺部磨玻璃样结节良恶性鉴别诊断的价值.数理医药学杂志():.().():.戴钢邓克学韦炜等.能谱 平扫定量分析在非小细胞肺癌与炎性肿块中的鉴别价值.中国医学计算机成像杂志():.收稿日期 修回日期 作者简介 张润菡()女河北河间人主治医师:.引文格式 张润菡高超.原花青素 抑制 信号通路缓解抑郁症大鼠海马神经元损伤的研究.东南大学学报(医学版)():.论著 原花青素 抑制 信号通路缓解抑郁症大鼠海马神经元损伤的研究张润菡高超(沧州市中心医院河北 沧州)摘要 目的:探究原青花素()是否能通过抑制海马神经细胞凋亡而改善抑郁症大鼠疾病进展方法:将 只 雄性大鼠随机分为正常对照组、慢性不可预测轻度应激()组、治疗组、组 实验期间每天观察大鼠一般情况给药结束后用糖水偏好实验测试快感缺失症状用旷场实验评估大鼠自发活动行为取海马组织切片做尼氏染色分析神经细胞状态蛋白质印迹法检测 淋巴细胞瘤()蛋白、相关蛋白()、胱天蛋白酶()、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白()、凋亡相关斑点样蛋白()和白细胞介素()的表达 结果:能够有效提高抑郁症大鼠的糖水偏好和活动兴趣修复细胞超显微结构有效降低 大鼠海马中上调的、和 蛋白水平提高 大鼠海马中抗凋亡蛋白 的表达水平 然而与 组相比给药 后大鼠抑郁症行为恶化细胞超显微结构排列紊乱大鼠海马中、和 蛋白水平再次上调同时 蛋白水平再次下调 结论:通过抑制细胞凋亡通路中 炎症小体途径发挥治疗效果可能是其干预抑郁症的分子依据关键词 慢性不可预测轻度应激抑郁症大鼠 海马 原青花素 细胞凋亡 核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白 中图分类号 .文献标志码 文章编号():./.():().:().()()()()()().:.:.抑郁症是以持续性情绪低落、抑郁为主要表现的一种情感障碍或精神障碍具体表现为兴趣无差别下降或完全丧失精力不足易疲劳、思维迟缓认知功能受损因自信心丧失而自卑甚至产生幻觉等精神症状严重时有自残等行为 这些症状不仅影响个体的日常行为能力也带来严重的心理痛苦 流行病学研究显示 年中 岁以上人群的抑郁症终生患病率高达.全国范围内抑郁症人数超过 万 年 以 来抑 郁 症 患 者 增 加 了据此估计我国将多达 亿人面临抑郁症的困扰 抑郁症的发生与遗传、环境、心理和社会等因素的影响有关 病理机制表现为中枢神经系统炎症及神经细胞凋亡、焦亡和自噬同时伴有大脑皮质、白质、杏仁核以及海马体萎缩和功能异常 原青花素()广泛存在于葡萄、花生、苹果、山楂、紫薯、银杏以及肉桂等植物的果实、树叶中是黄烷醇单体缩合而成的多酚化合物因其在酸性介质中加热生成花青素产物而得名 原青花素()是 的一个亚型(图)具有良好的水溶性、生物安全性、胃酸耐受性以及强烈的抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗肿瘤细胞的作用图 原青花素 的分子结构 慢性不可预测轻度应激()抑郁症大鼠模型是临床前常用于研究抑郁症发病机制的动物模型 本研究在构建了大鼠东南大学学报(医学版)年 月()模型的基础上通过给药 探讨了其对神经炎症及神经细胞凋亡的作用机制并进一步验证了 对抑郁症的治疗效果 材料与方法.实验动物 周龄的雄性 级 大鼠体质量()只购自上海亓上生物医学科技有限公司生产许可证号为(沪)饲养环境为 动物房室温 空气湿度 /的照明/黑暗循环 每 更换 次垫料饲料为标准颗粒饲料自由饮用高压灭菌自来水 本实验经沧州市中心医院医学实验动物伦理管理委员会批准审批号为.药物与试剂()、核苷酸结合寡聚化结构域样 受 体 蛋 白 ()激 动 剂()购自上海蓝木化工有限公司 多克隆抗体()、凋亡相关斑点样蛋白()多克隆抗体()、淋巴细胞瘤()蛋白多克隆抗体()、相关蛋白()多克隆抗体()、白细胞介素()多克隆抗体 和甘油醛磷酸脱氢酶()单克隆抗体()、交联的羊抗兔()()、交联的羊抗小鼠()()购自武汉三鹰生物技术有限公司 化学发光检测试剂盒()购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司 蔗糖购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司.主要仪器石蜡包埋机()、石蜡切片机()、透射电子显微镜()均来自德国 公司显微摄像系统()购自日本 公司 超纯水系统()购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司电泳仪()及微型垂直电泳槽()购自上海天能科技有限公司.造模与分组本研究造模方法参考 等的 方案略作修改建立大鼠抑郁症模型 简而言之大鼠经过 周的适应性饲养后采用湿锯末作为鼠笼垫料更换垫料周期延长为 刺激方案包括随机禁食、禁水、给予夜间照明、冷水浴 、热水浴 、身体物理约束 、倾斜笼子 等 每日施加 种压力且同 种刺激不连续出现造模期间动物均单笼饲养持续 周 没有 处理的大鼠正常饲养自由饮食、饮水除每 更换 次干洁垫料外不予其它干扰 本研究使用糖水消耗试验测定 饮用 蔗糖溶液的量来判断造模成功每日记录各组大鼠糖水消耗量若单日饮用糖水量下降超过/且差异具有统计学意义提示该组大鼠糖水消耗显著降低抑郁模型造模成功 本实验全部工作在沧州市中心医院中心实验室完成各类药物配制及给药剂量参照本课题组前期预实验结果 蔗糖用高压灭菌的饮用水配制为 水溶液 以生理盐水配置为 浓度的悬浊液每只大鼠体质量约 单次给药计量为 即单次腹腔给药体积约为 以高压灭菌的 水配制为 的溶液每只大鼠体质量约 单次给药计量为 及单次腹腔给药体积约为 只大鼠按数字表法随机选择 只作为正常对照组剩余 只按照上述方法使用 刺激造模实验第 周时糖水消耗试验验证各组造模成功率 后再将 只造模成功大鼠随机分为 组继续 刺激 同时各组按照以下分组进行给药挽救:()正常对照组按照动物房规定标准饲养()组从造模成功第 周起每日随机处置 次连续()治疗组从造模成功第 周起每日随机处置 次并每日 次腹腔注射 剂量为 以注射量最大的单大鼠注射量为标准补充注射生理盐水保证各组给药体积一致连续 ()组在第 组的基础上增加每日 次腹腔注射 剂量为 的剂量腹腔注射以注射量最大的单大鼠注射量为标准补充注射生理盐水保证各组给药体积一致连续 正常对照组和 组大鼠腹腔注射等体积生理盐水 实验结束后各组大鼠禁食不禁水处理 使用异氟烷麻醉后取脑于冷冻操作台上分离海马组织.观察指标.糖水偏好实验糖水偏好实验中将大鼠单笼饲养后给予 瓶 蔗糖溶液用作饮用水 然后以普通饮用水代替其中 瓶蔗糖水进行适应性训练适应期完成后剥夺实验鼠饮用水和食物 然后进行偏好测试 在偏好测试的 期间同时提供两个饮水瓶分别装有 蔗糖溶液和 自来水让其自由饮水 蔗糖偏好定义为:蔗糖消耗量/(水消耗量 蔗糖消耗量)张润菡等.原花青素 抑制 信号通路缓解抑郁症大鼠海马神经元损伤的研究.旷场实验 参照刘美华等描述的旷场实验方案执行稍作改动 在给药结束后取底部与四面均为黑色的敞口箱子()用白线把底面划分为边长 的小方格在上面安装摄像头记录大鼠的活动情况 将 只大鼠放入箱子中央方格中记录其在 内的活动水平 每穿越 个格子记 分(个爪子进入)前双爪同时抬起离地面 以上记 分然后统计每只大鼠的得分 每测试 只后清理排泄物以 乙醇喷洒消毒待挥发干净后进行下 只测试.尼氏染色分析把新鲜海马组织置于 中清洗表面后置于的 中固定 然后依次进入、和 乙醇中脱水将其置于乙醇二甲苯、二甲苯中进行透明处理完成后浸蜡、包埋 石蜡切块行 切片 过夜烘烤后再逆向从二甲苯到 乙醇中水化 随后将载玻片置于 的甲酚紫溶液中染色 然后在蒸馏水中快速冲洗 将载玻片置于 乙醇中分化 并在显微镜下检查直到显示良好的染色与背景分化结果 再次进入 乙醇到二甲苯的脱水流程中性树胶封片成片后以光学显微镜拍照记录、分析.蛋白质印迹分析 称取海马组织加入 倍体积 裂解液 充分匀浆 离心 后取上清 采用 胶进行电泳取 总蛋白上样 电泳待溴酚蓝指示剂到达分离胶顶端后改用 电泳直至溴酚蓝出胶 以 条件转膜 将蛋白转移到 膜脱脂奶粉孵育 洗涤 以封闭液稀释的一抗 过夜孵育 次日充分洗涤二抗室温孵育 进行显影用 .根据相对浓度对条带进行分析.透射电子显微镜分析将海马组织取出后置入 戊二醛中 固定过夜然后于 中固定处理 在 到 的梯度乙醇中脱水(其中 乙醇含有 乙酸双氧铀)完全脱水后浸入环氧丙烷中浸透、包埋并硬化成形 以 切片机做超薄()切片、乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色并用 电子显微镜观察拍照记录.统计学处理采用 .()软件对数据进行统计学分析 组数据间比较使用单因素方差分析组间差异性进一步用 检验进行分析.为差异具有统计学意义 结 果.对 大鼠的糖水偏好和活动评分的改善作用 在实验过程中正常对照组大鼠体型不断增大被毛整齐有光泽眼睛明亮有神 组大鼠则体型增长缓慢喜欢扎堆、双眼无神、周身潮湿大面积被毛集聚不能散开 治疗组大鼠体型、被毛及精神状态显著改善而 组的大鼠状态与 组大鼠相似精神不振被毛潮湿结块 糖水偏好实验结果如表 所示在给药结束后给定时间内 组平均饮用糖水量明显低于正常对照组()治疗组饮用糖水量有所回升显著高于 组(.)而同时给药 后大鼠饮用糖水量再次下降抑郁状态恶化(.)大鼠活动评分结果如表 所示在给药结束后给定时间内 组大鼠活动评分明显低于正常对照组()治疗组大鼠活动评分有所回升显著高于 组(.)而同时给药 后大鼠大鼠活动评分再次下降抑郁状态恶化(.)表 大鼠行为学评分比较()()组 别糖水消耗/大鼠活动评分/分正常对照组.组.治疗组.组.值.值.与正常对照组相比 .与 组相比 与 治疗组相比.对 大鼠海马神经细胞受损状态的改善 尼氏染色结果如图 所示正常海马组织中神经细胞排列规则、致密细胞质内有大量的尼氏小体表明神经细胞代谢功能旺盛神经元有大量的树突 大鼠海马细胞排列出现松散、细胞丢失尼氏小体数量很少不能通过树突将相邻细胞相连 处理的 海马中神经细胞的分布、排列状态与正常大鼠间没有可识别的明显区别尼氏小体的数量反而东南大学学报(医学版)年 月()有增加的趋势细胞活性更强 相比而言 被激活后海马细胞严重受损与 组相似尼氏小体的数量更少细胞间尼氏小体的分布近乎消失各组大鼠海马组织透射电子显微镜观察显示与正常对照组大鼠相比 组大鼠海马神经细胞核内缩、边界模糊、伴有局部断裂、染色质凝集胞浆内线粒体出现空泡化现象而溶酶体性颗粒显著增加 治疗组海马组织神经细胞仍有染色质凝集的现象但是较 组显著减轻空泡化线粒体结构恢复到正常对照组的状态 组中细胞核收缩、染色质凝集现象与 组类似显示细胞凋亡的特征 见图.正常对照组.组.治疗组.组图 尼氏染色分析海马神经元损伤()().对海马组织细胞凋亡蛋白表达的作用各组大鼠海马组织凋亡蛋白表达如图 所示 组大鼠海马中抑凋亡蛋白 表达水平显著下降 治疗组的 表达水平虽然低于正常对照组(.)但已经恢复到对照的.生物学上差别并不是特别大 组中 的表达水平显著低于 治疗组(.)促凋亡蛋白 的表达水平呈现与 相反方向的变化 见表.对海马组织细胞凋亡通路的作用进一步分析发现、等蛋白的表达水与细胞凋亡的趋势相一致()所有检测的蛋白均因造模而急剧升高经 治疗后表达水平在 组的基础上显著下降(.)但是采用 激活 后这些细胞凋亡蛋白表达则再次升高表现出了逆转 降低细胞凋亡的趋势(.)见图、表 讨 论在临床诊疗中抑郁症患者表现为精神不振、食欲减退、精力不够集中、学习能力下降、自信心缺乏、毅力下降等心理性的情感与精神障碍症状 我们采用 方案建立抑郁症大鼠模型时模型组大鼠喜欢扎堆、精神不振、被毛散乱糖水偏好降低旷场水平得分、垂直得分显著降低表明成功建立大鼠抑郁症模型 处理后大鼠一般状态得到显著改善糖水饮用量提升显示快感缺失程度和奖赏敏感性得到有效改善旷场活动性增强表明抑郁症大鼠的探索能力有了积极改观 然而采用 激活炎症因子 的表达后对 的治疗效果产生了显张润菡等.原花青素 抑制 信号通路缓解抑郁症大鼠海马神经元损伤的研究 细胞质空心化 细胞核皱缩及染色质改变.正常对照组.组.治疗组.组图 透射电子显微镜分析海马神经元超显微结构变化 .正常对照组.组.治疗组.组图 海马组织中凋亡蛋白表达蛋白质印迹分析 著的拮抗效果说明 的抑郁症治疗与炎症反应有直接关系研究表明抑郁症的发病源于中枢神经系统功能 障 碍、器 质 性 损 伤 大 脑 中 五 羟 色 胺()、去甲肾上腺素()、多巴胺()等神经递质的细胞感受器被破坏造成递质不能通过相应的神经信号通路来调节人的情绪从而表现为抑郁 海马、皮质、白质、杏仁核等大脑特定部位的炎症反应受损神经细胞的凋亡、焦亡或吞噬清理均可直接引发抑郁症恶化 依据抑郁表 凋亡蛋白表达定量的比较()()组 别/正常对照组.组.治疗组.组.值.值.与正常对照组相比 .与 组相比 与 治疗组相比.症病理基础可对抑郁症进行针对性干预细胞凋亡是一种高度调节的程序化细胞死亡()形式有序清除受损细胞在病理、发育和衰老过程中维持体内平衡 抑郁症海马组织神经细胞尼氏小体显著减少表明蛋白合成受到抑制细胞形态和致密性排列被破坏并表现出核皱缩核膜内陷、边界不清并伴有局部断裂染色质凝东南大学学报(医学版)年 月().正常对照组.组.治疗组.组图 /调控细胞凋亡蛋白的表达/聚出现大量空泡化结构的线粒体以及溶酶体颗粒等典型的凋亡特征说明因细胞凋亡使得海马受损 通过 治疗后细胞蛋白合成活性得到恢复凋亡细胞显著减少细胞核中染色质凝聚、线粒体结构损伤等显著改善细胞凋亡的趋势得到了抑制受损细胞恢复到正常形态结构 然而 治疗的同时激活 后神经细胞改善效果丧失说明 的表达与抑郁症海马细胞的凋亡存在直接关系细胞凋亡是一个受多基因、多蛋白严格调控的过程以、和 作为凋亡起始 发挥作用最终以、和 等作为效应蛋白完成执行 是炎症小体的主要组成蛋白之一 识别相关致炎因子信号后通过 蛋白形成胞质寡聚体与 结合为复合体并引发细胞焦亡 然而亦有研究表明抑郁症的发病与中枢神经系统 过表达相关并引发细胞凋亡损伤表 和细胞凋亡通路蛋白表达定量的比较()()组 别/正常对照组.组.治疗组.组.值.值.与正常对照组相比.与 组相比.与 治疗组相比.中枢神经系统 此时 蛋白与 形成复合体成为一个保守的 激活平台 活化后的 可以直接切割和激活 和 等效应 启动细胞凋亡 此外 可以诱导细胞色素 的释放和随后的 激活最终通过激活效应 造成细胞凋亡引发 表达受阻而 等促凋亡蛋白表达升高 激活的 增强 释放进一步加剧细胞凋亡和组织损伤 本研究发现 介入后、及 成熟体等的表达水平显著下降而 被激活后这些指标的水平大幅度升高阻碍 的保护作用表明 通过/复合体调节 成熟这一凋亡通路治疗抑郁症总而言之 能够通过抑制 和介导的细胞凋亡信号通路改善抑郁症模型大鼠的病理表征其具有作为抑郁症治疗性药物的巨大潜在价值参考文献 .:.中华医学会中华医学会杂志社中华医学会全科医学分会等.抑郁症基层诊疗指南(年).中华全科医师杂志():.():.:.():.张润菡等.原花青素 抑制 信号通路缓解抑郁症大鼠海马神经元损伤的研究:?.():./.:.:.():.():.单卫明刘冬胡修伟等.葡萄籽活性物质原青花素萃取条件的研究.科技资讯:.:.:.():.刘美华王素荣刘平等.五味子提取物对抑郁症大鼠海马神经元损伤的修复作用及其机制.广州中医药大学学报:.:.():.:.:.:.():.:.柴继杰施一公.凋亡小体与炎症小体:蛋白酶的激活平台.生物化学与生物物理进展():./.():.:.:.:.:.():.东南大学学报(医学版)年 月()