中华绒螯蟹“长荡湖1号”连续3个世代的遗传多样性分析_庄振俊.pdf

doi:10.7541/2023.2022.0261中华绒螯蟹“长荡湖1号”连续3个世代的遗传多样性分析庄振俊1 唐美君1 张冬冬1 陈文彬2 罗 明2 成永旭1 吴旭干1,3,4 陈晓武1,3(1.上海海洋大学农业农村部淡水种质资源重点实验室,上海 201306;2.常州市金坛区水产技术中心,常州 213200;3.上海市水产动物良种创制与绿色养殖协同创新中心,上海 201306;4.上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范心,上海 201306)摘要:为了解选育对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)“长荡湖1号”遗传多样性的影响,研究采用20个微卫星位点对“长荡湖1号”A系和B系各连续3个世代进行遗传多样性分析。结果如下:20个微卫星标记在6个群体中共检测到551个等位基因,各位点的平均等位基因数(Na)和平均有效等位基因数(Ne)分别为27.55和13.61,平均观测杂合度(Ho)和平均期望杂合度(He)分别为0.72和0.90,平均香农信息指数(I)和多态信息含量(PIC)分别为2.73和0.89。在选育过程中,A系和B系3个世代的PIC均有下降趋势,各群体的He和Ho均维持较高水平。A系子一代(G1)和子二代(G2)的有效群体数量(Ne)分别为72.7和111.8,B系G1和G2的有效群体数量分别为67.7和115.8,均维持在较高水平。Hardy-Weinber平衡检验结果显示,有72.5%的数据偏离Hardy-Weinber平衡,表明选育群体的遗传结构处于相对不稳定的状态。A系和B系后代与G0的遗传距离均逐代增大,其中A系从0.2455增大到0.2607,B系从0.1736增大到0.1751。各群体之间遗传分化指数(Fst)均小于0.05,表明各群体间遗传分化程度微弱。AMOVA分析结果表明,“长荡湖1号”仅0.87%的变异存在于各群体间,而99.13%的变异发生在群体内个体间。综上所述,中华绒螯蟹“长荡湖1号”经过2代选育,选育群体的遗传多样性和有效群体数量依然保持较高水平,但群体遗传结构处于相对不稳定状态,今后选育过程中应该保持足够的繁殖亲本数量和遗传多样性,防止近交退化。关键词:新品系选育;微卫星标记;遗传多样性;有效群体大小;中华绒螯蟹中图分类号:Q346+.5 文献标识码:A 文章编号:1000-3207(2023)09-1523-11 中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)俗称河蟹、毛蟹和大闸蟹等,因其饮食文化悠久和风味独特而受到消费者欢迎,已经成为我国重要的养殖种类,全国每年成蟹养殖产量达80万吨左右1。目前,中华绒螯蟹的主产区集中在长江中下游地区,经过多年市场培养,出现了以产地为特征的地域品牌,如“阳澄湖大闸蟹”“太湖大闸蟹”和“长荡湖大闸蟹”等2。经过多年的人工养殖,养殖群体的种质退化和种质混杂已经成为影响中华绒螯蟹养殖产业可持续发展的重要问题之一,这严重制约着中华绒螯蟹产业的发展3,4。优良品种选育是提高中华绒螯蟹养殖性能的重要途径之一。尽管我国已经通过群体选育获得5个经过国家水产原良种委员会审定的中华绒螯蟹新品种,在一定程度上促进了河蟹养殖产业的发展,但这些新品种主要以生长速度和成蟹规格为选育目标5,但尚不能满足河蟹养殖产业的多样化需求。常州市金坛区的长荡湖是野生中华绒螯蟹的重要栖息地,该湖泊所产中华绒螯蟹品质优良,“长荡湖大闸蟹”成为一个有影响力的地域公共品牌6。经过多年发展,中华绒螯蟹养殖已经成为金坛区的农业主导产业,年产量达2万吨左右,整体养殖技术水平和养殖效益引导全国,有多项技术已经在全国大面积推广7。目前长荡湖地区的中华绒螯蟹养殖尚缺乏适应当地自然条件和养殖模式的专用良种,第 47 卷 第 9 期水 生 生 物 学 报Vol.47,No.9 2023 年 9 月ACTA HYDROBIOLOGICA SINICAS e p.,2 0 2 3 收稿日期:2022-06-25;修订日期:2022-11-02基金项目:国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”重点专项(2018YFD0900103);江苏省农业农村厅种业振兴揭榜挂帅项目(JBGS2021127);江苏金坛区农业农村局科技项目(JTNL2019001)资助 Supported by the Key National and Special Project ofBlue Granary Science and Technology Innovation(2018YFD0900103);Jiangsu Provincial Department of Agriculture and RuralDevelopment Seed Industry Zhengxing Guashai Projects(JBGS2021127);Science and Technology Project of Agriculture andRural Affairs Bureau,Jintan District,Jiangsu Province作者简介:庄振俊(1996),男,硕士研究生;研究方向为水产养殖。E-mail:通信作者:陈晓武,E-mail:这已然成为该地区中华绒螯蟹产业升级的重要瓶颈之一8。因此,金坛区水产技术推广中心联合上海海洋大学,自2017年开始进行“长荡湖1号”的选育工作,以培育适合长荡湖地区养殖模式的专用品种,目前已经选育到第二代。群体选育和配套系选育具有操作简单、选择强度大和育种设施要求低等优点,已被广泛应用于水产动物遗传育种中,但是群体选育和配套系选育通常会面临近交衰退和遗传多样性下降等风险9。因此,群体选育过程中采用合适的分子标记进行系谱鉴定和遗传多样性评估,可以有效避免近亲繁殖和遗传衰退10。微卫星分子标记具有可供选择的标记数量多、多态性高、个体特异性强和共显性遗传等优点,已在中华绒螯蟹种质资源评价和遗传育种中得到了广泛的应用11,12。先前研究已经在中华绒螯蟹基因组中开发出大量多态性高、遗传稳定和易PCR扩增的SSR分子标记13,并且在其遗传育种和种质鉴定中得到了初步应用10,14。特别是随着中华绒螯蟹基因组测序数据的积累,全基因组分析可筛选出886782个完整型微卫星,为微卫星分子标记的应用奠定了坚实基础15。在红壳色品系的中华绒螯蟹中,微卫星可以成功用于红壳蟹和2个绿壳蟹品系间遗传距离与遗传分化系数分析16。虽然遗传育种研究中有更多新的分子标记可以选择,但是微卫星还是可以作为一种经济、方便的遗传学研究工具。本研究筛选了20个多态性较高的微卫星,较系统地评估了中华绒螯蟹“长荡湖1号”3个连续选育世代的群体遗传多样性和遗传分化,以期为“长荡湖1号”的进一步选育提供实践参考。1 1 材料与方法 1.11.1 选育群体和采样中华绒螯蟹“长荡湖1号”选育系分为A系(耐高密度)和B系(高体重),两个选育系的奠基群亲本(G0)均于2018年11月中旬选自常州市金坛区的两个河蟹养殖场,这些亲本蟹均经过多代人工繁殖,基本适应了当地自然环境和养殖模式,所选亲本在位于江苏如东县的上海海洋大学河蟹遗传育种中心进行人工繁殖,获得选育子一代(G1)大眼幼体,大眼幼体被运送到金坛区水产技术推广中心试验基地进行扣蟹和成蟹养殖;2020年11月中旬,分别挑选A系和B系亲本作为选育第二代(G2)的父母本,人工繁殖、扣蟹和成蟹的养殖过程同第一代,两个选育系各选育世代的亲本数量见表 1。分别于2018年12月、2020年12月和2021年12月采集G0、G1和G2选育群体的样品蟹,每个选育系均随机采样30只以上个体(公母近似各50%),共6个选育群体,具体采样信息见图 1。采样个体冰浴麻醉后,分别取其附肢肌肉固定于 95%乙醇中,每只个体的肌肉样品均单独固定于5 mL离心管中,于20冰箱中保存备用。1.21.2 基因组DNA提取每个群体随机选用30个样品(雌雄各半),用酚-氯仿法17提取基因组DNA,用琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像系统(Bio-rad,USA)检测DNA质量,并使用Quawell Q5000(Quawell,USA)检测DNA浓度及纯度,用无菌超纯水稀释至50 ng/L。1.31.3 PCR反应参考已发表文献10,11,18和本课题组新开发的中华绒螯蟹微卫星标记中选择20个多态性较高的微卫星用于本研究,具体信息见表 2。PCR反应总体积为12.5 L,其中Mix 6.5 L,无菌水4 L,上游引物0.5 L(10 pmol/L),下游引物0.5 L(10 pmol/L),DNA模板1 L(50 ng/L)。PCR反应程序:94预变性3min;94变性30s,退火30s,72延伸90s,30个循环;72延伸6min,12保存。1.41.4 微卫星分型用1%的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳,检测其扩增效果。若PCR产物目的条带清晰,则将PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进表 1 中华绒螯蟹“长荡湖1号”选育两世代的亲本数量Tab.1 The number of parents for two generations of Eriocheirsinensis“Changdang Lake 1”世代GenerationA系 Strain AB系 Strain B雌体Female雄体Male雌体Female雄体Male子一代Generation 154816826280子二代Generation 21251370789269A 系 Strain AG0样品63个63 samples of G0G1样品32个32 samples of G1G2样品32个32 samples of G2G2样品32个32 samples of G2G1样品32个32 samples of G1G0样品82个82 samples of G0B 系 Strain B 图 1 中华绒螯蟹“长荡湖1号”样品信息Fig.1 Sample information of Eriocheir sinensis“ChangdangLake 1”G0为基础群体;G1为子一代;G2为子二代G0 is the base population;G1 is generation 1;G2 is generation 21524水 生 生 物 学 报47 卷行毛细管电泳分型,记录每个中华绒螯蟹样品各微卫星位点的基因型。1.51.5 数据分析使用POPGEN 3.219软件计算有效等位基因数(Ne)、观测等位基因数(Na)、期望杂合度(He)、观测杂合度(Ho)、香农信息指数(I)和群体间遗传距离(D);应用PIC-CALC0.620软件计算位点的多态信息含量(PIC);使用Cervus 3.021软件计算各群体的多态性信息含量(PIC);用ARLEQUIN3.122软件计算群体间遗传分化指数(Fst)和分子方差分析(AMOVA);通过Genepop 1.223软件检验Hardy-Weinberg平衡;利用NeEstimator V224软件的连锁不平衡法(Linka-ge Disequilibrium)估计各群体的有效群体数量(Ne)。2 2 结果 2.12.1 微卫星位点多态性本实验选用的20个微卫星位点在“长荡湖1号”6个群体中均能成功扩增,且具有多态性(表 3)。共检测到551个等位基因,各位点的等位基因数(Na)在1052,平均值为27.55。有效等位基因数(Ne)最小为3.7780(Esin67),最大为26.4274(Esin36),平均值为13.6080。观测杂合度(Ho)介于0.40910.9556,平均值为0.7151。期望杂合度(He)在0.73740.9648,平均值为0.9023香农信息指数(I)为1.80473.5411,平均值为2.7276。多态信息含量(PIC)介于0.71410.9609,平均值为0.8918。2.22.2 中华绒螯蟹“长荡湖1号”的遗传多样性从平均等位基因数(Na)、平均有效等位基因数(Ne)、平均观测杂合度(Ho)、平均期望杂合度(He)、平均香农信息指数(I)和平均多态信息含量(PIC)均可看出,中华绒螯蟹“长荡湖1号”A系和B系群体遗传多样性均呈下降趋势(图 2)。就A系而言,3代群体的平均等位基因数为15.800018.9500,平均有效等位基因数为10.109112.7130;平均观测表 2 20个微卫星位点引物信息Tab.2 Information of 20 microsatellite markers位点Locus片段大小Size range(bp)退火温度Annealingtemperature()引物序列Primer sequences(5 3)位点Locus片段大小Size range(bp)退火温度Annealingtemperature()引物序列Primer sequences(5 3)A920028260GCAATGAGACTCAACAGGAGAJPX1018727558TGGAAGGGTTGAGGATGAAATGTGGCTCACCTGACGTTGTGAGACAGGACCCCATATB319823360GAGAAACGAGCAGCATTTCC LCX256 35846355ATGGCTCTCTCTGGTGGCTCACAACAACACGGAGTATCGGTGCTGAAATCGGAAGGTTES1739250056ACTATGCCTTTGCCTATGTATGAALCX401 38543655TCACACAGCACTTTTCTTTCGCGGTTGTTAAAGCCAGAATGTCATCCCCCTCCTTATCEsin3621233655GAGCGAGTATGCAAATGAGTAATCJ146149155CTCGTTTGCCTTAATCGTGTCTCTTCATTCACGAACAAAACACTAATGTTCCTCTACTTCCTCCACTTTCTEsin4221528155GCACCGCAGTGATAATGTAGTGGLH144547555GAAGCCAGTCTGGTAATGATCCTCGTGTGGGCGTGCTTACTGCCCTGAAGAGCGATACAGEsin6722234855TTTGGGATTCACCTTGTCAACTTLH248352455GCCATCAGGGCTCGTAAGTTCGACGCACGACAGAGGAGAGGAGGTGAAAAGAGGCGGGAGGHLJE25 20229255AAGGACAACACGATGACALH449454155TTACACGCACCCTCAGTCTCTTAAGAGGAGGAAGAGGCAGCATACCGAAGGCTTTCATTGCHLJE34 113 19155AACAACTACCCAGCACCTHH147051055CGTGTGTTTGCTCATTAGTTCGCTCATCACGCTACCACCTAGGATGAGGACGAGAGGTGGHLJE42 32038655ACCCTCAGCAGTTATCGTGQ8228714755GGGTTTTGAAATAAGGAAGAACATGACGCTACAACAAAGGCAAGCTTGGTTTTGGGTGTTGTTTTGTTHLJE88 20830655TACGGCAAATCCATCCTCQ84011223555TGTTCCTCTTGTTCTGTTTTGTTCCACGCCAATAAACTGACCAAGGTTGCTTAATGGTGGCTTATGAA9 期庄振俊等:中华绒螯蟹“长荡湖1号”连续3个世代的遗传多样性分析1525杂合度为0.66050.7139,平均期望杂合度为0.88380.9155;平均香农信息指数为2.39692.6158,平均多态信息含量为0.85740.8911。就B系而言,3代群体的平均等位基因数为16.100017.4500,平均有效等位基因数为9.515510.8750;平均观测杂合度为0.72560.7510,平均期望杂合度为0.88380.9023;表 3 中华绒螯蟹“长荡湖1号”选育群体20个微卫星位点的多态性Tab.3 Genetic polymorphism of 20 microsatellite markers of“Changdang Lake 1”位点Locus等位基因数 Na有效等位基因数 Ne观测杂合度 Ho期望杂合度 He香农信息指数 I多态信息含量PICA935.0019.94460.82120.95253.20490.9476B327.0013.82870.85880.93032.85500.9231CJ110.005.27380.49710.81271.92540.7910ES1728.0013.91780.40910.93122.88580.9237Esin3652.0026.42740.83890.96483.54110.9609Esin4219.0010.36140.66110.90602.52840.8957Esin6714.003.77800.67800.73741.80470.7141HH141.0018.25870.89440.94793.17540.9426HLJE2533.0018.47810.73740.94853.10200.9432HLJE3432.0018.52630.85800.94873.11960.9434HLJEsa4220.008.92510.71350.89052.43210.8781HLJEsB8837.0022.47090.84830.95823.30710.9537JPX1032.0014.45240.65920.93342.96020.9269LCX25640.0023.33450.95560.95983.36320.9555LCX40123.008.77670.77530.88862.43010.8754LH117.004.86240.60890.79662.01750.7773LH217.007.26050.58190.86472.30330.8500LH416.006.10730.42770.83872.09090.8178Q82218.008.65500.64440.88692.33620.8733Q84040.0018.51960.83330.94863.16850.9434Mean27.5513.60800.71510.90232.72760.8918G0G1G251015205101520世代 Generation平均等位基因数The average numberof alleles(Na)平均有效等位基因数The average effectivenumber of alleles(Ne)A系NaA系NeB系NaB系NeA系HoA系HeB系HoB系HeaG0G1G20.50.60.70.80.91.00.50.60.70.80.91.0世代 Generation平均观测杂合度The average observedheterozygosity(Ho)平均期望杂合度The average expectedheterozygosity(He)bG0G1G22.02.22.42.62.8世代 Generation平均香农信息指数The average Shannoninformation index(I)A系Strain AB系StrainBA系Strain AB系StrainBcG0G1G20.70.80.9世代 Generation平均多态信息含量The average polymorphisminformation content(PIC)d图 2 “长荡湖1号”连续三代遗传多样性参数Fig.2 Genetic diversity parameters of 3 generations of“Changdang Lake 1”a.平均等位基因数和平均有效等位基因数;b.平均观测杂合度和平均期望杂合度;c.平均香农信息指数;d.平均多态信息含量a.the average number of alleles and the average effective number of alleles;b.the average observed heterozygosity and the average expectedheterozygosity;c.the average Shannon information index;d.the average polymorphic information content1526水 生 生 物 学 报47 卷平均香农信息指数为2.38652.5033,平均多态信息含量为0.85650.8775。中华绒螯蟹“长荡湖1号”子代的有效群体数量(Ne)相对基础群体有所下降,但各群体的Ne均保持在较高水平(图 3)。A系G0的有效群体数量为395.9,G1和G2的有效群体数量分别为72.7和111.8;B系G0的有效群体数量为122.2,G0、G1和G2的有效群体数量分别为67.7和115.8。2.32.3 中华绒螯蟹“长荡湖1号”的遗传分化Hardy-Weinberg平衡的检测结果显示,在检测的240个数据中,有83个处于Hardy-Weinberg平衡,157个显著偏离Hardy-Weinberg平衡(P0.05),其中74个极显著偏离Hardy-Weinberg平衡(P0.01;表 4)。A系有78.33%的数据显著偏离Hardy-Weinberg平衡,而B系中显著偏离Hardy-Weinberg平衡的数据占66.67%。位点CJ1、ES17、Esin42、JPX10、LH2、LH4和Q822在所有群体中均显著偏离Hardy-Weinberg平衡(P0.05),占所有位点的35%。显著偏离Hardy-Weinberg平衡位点个数最多的群体是A系奇年G1群体,为17个。中华绒螯蟹“长荡湖1号”A系和B系后代与表 4 20个微卫星位点在“长荡湖1号”中的Hardy-Weinberg平衡P值Tab.4 Hardy-Weinberg equilibrium P value of 20 microsatellite loci of“Changdang Lake 1”位点Locus群体PopulationA0A1A2B0B1B2A90.0217*0.0044*0.06270.0147*0.0030*0.0084*B30.0047*0.09630*0.35990.26120.7926CJ10.0004*0.0002*0.0028*0.0034*0*0*ES170*0*0*0*0*0*Esin360*0*0*0.0097*0.40780.0094*Esin420*0*0*0*0.0068*0.0069*Esin670.58290.09560.0252*0.19200.14290.2142HH10*0*0.0301*0.32130.10390.2528HLJE250*0*0*0.41870*0.0015*HLJE340.31620*0.0047*0*0.10220.1541HLJEsa420.26960.0014*0.0091*0.0141*0.0052*0*HLJEsB880*0.0296*0.37900.0147*0.0069*0.0475*JPX100*0*0*0*0.0060*0*LCX2560.56220.0385*110.37050.3429LCX4010.07710*0.68670.0052*0.58520.0936LH10*0*0.20230.11650.0154*0.0022*LH20*0*0.0102*0*0*0*LH40*0*0*0*0*0*Q8220*0*0*0.0182*0*0.0082*Q8400*0.06620*0.0395*0.0340*0.3305注:*表示显著偏离Hardy-Weinberg平衡(P0.05),*表示极显著偏离Hardy-Weinberg平衡(P0.01);A0为A系G0;A1为A系G1;A2为A系G2;B0为A系B0;B1为B系G1;B2为B系G2Note:*indicates a significant deviation from Hardy-Weinberg equilibrium(P0.05),*indicates very significant deviation from Hardy-Weinberg equilibrium(P0.50时,为高度多态性;当0.25PIC0.50时,为中度多态性;当PIC0.25时,为低度多态性。本研究中所有位点PIC均高于0.5,表明本研究选用的20个微卫星位点具有高度多态性,可作为有效的河蟹遗传多样性研究标记。本研究中20个微卫星位点均在某些群体中出现显著偏离Hardy-Weinberg平衡,这与期望杂合度略高于观测杂合度的结果相一致。在马氏珠母贝(Pinctada martensi)27、华南鲤(Cyprinus carpio rubro-fuscus)28、凡纳滨对虾(Litopenaeus Vannamei)29、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)30和中华绒螯蟹等物种的微卫星遗传多样性研究中均出现了位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡的现象,这是微卫星分析群体遗传多样性时出现的普遍现象。因此本研究选用的微卫星位点可用于河蟹群体的遗传多样性分析研究。3.23.2 中华绒螯蟹“长荡湖1号”的遗传多样性品种选育成功的关键在于维持遗传改良和遗传变异之间的平衡。选育的目的是培育具有优良性状的品种,但长期的人工选择可能导致种群的遗传多样性下降,引起目标种群的种质衰退31。微卫星标记是评估种群遗传多样性的重要手段,在刺参(Stichopus japonicus)32、大黄鱼(Larimichthys cro-cea)33、中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)34、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)35和中华绒螯蟹36等水产物种上都有相关研究。由图 2a可知平均有效等位基因数(Ne)小于平均等位基因数(Na)。Ne表示等位基因频率均匀分布的位点上产生相同的期望杂合度时所需的等位基因数,根据公式Ne=1/pi2(式中pi为第i个等位基因的频率)可知,Ne是基因纯合度的倒数,等位基因在群体中分布越均匀,Ne就越接近实际观察到的等位基因数(Na)5。综上,Na与Ne绝对值相差大的原因可能是:河蟹选育群体是受强烈人工干预的群体,某些等位基因的频率在高强度累代选育过程中可能迅速升高或降低,而另外一些等位基因频率则可能发生随机波动,因此,文中抽样的微卫星位点上的等位基因在群体中的分布很不均匀,导致Na与Ne差异较大。表 5 “长荡湖1号”连续三代遗传距离D(对角线以下)和遗传分化指数Fst(对角线以上)Tab.5 Matrix of pair-wise genetic distance(below diagonal)andFst values(above diagonal)between 3 generations of“ChangdangLake 1”群体PopulationA0A1A2B0B1B2A0*0.01000.01250.00760.00770.0118A10.2455*0.00860.00490.00870.0067A20.26070.1970*0.01160.01050.0118B00.24100.18150.2336*0.00260.0047B10.23820.21020.21790.1736*0.0114B20.25920.18090.22030.17510.2391*表 6 基于20个微卫星位点的分子方差分析Tab.6 AMOVA based on 20 microsaltellite markers变异来源Source ofvariation自由度Degree offreedom平方和Sum ofsquares方差组分Variancecomponents方差比例Percentage ofvariation(%)所有群体Allpopulations群体间Amongpopulations5 63.6860.073470.87群体内个体间Within populations3542948.4338.3289199.13总变异Totalvariation3593012.1198.40238100A系群体Strain A群体间Amongpopulations2 27.1220.087271.04群体内个体间Within populations1771473.5178.3249598.96总变异Totalvariation1791500.6398.41222100B系群体Strain B群体间Amongpopulations2 21.5670.046940.59群体内个体间Within populations1771410.1007.9666799.41总变异Totalvariation1791431.6678.013611001528水 生 生 物 学 报47 卷杂合度是衡量一个种群遗传多样性的重要标准,代表微卫星位点上杂合子基因型所占比例,反映了群体的遗传变异程度37。观测杂合度Ho受样本数量影响较大,而期望杂合度He更能够稳定反映群体的遗传多样性38。本研究中“长荡湖1号”各群体的He为0.88320.9155,显示出了很高的遗传多样性水平,这与以往对中华绒螯蟹的研究一致39,40。A系和B系三代群体的He均逐代下降,但不同选育世代之间He差异不大,且下降的速度逐代变慢,说明“长荡湖1号”的遗传多样性在选育过程中并无明显变化,这在鲤41和中国对虾34的选育过程中He也有类似结果。He高于Ho,表明中华绒螯蟹“长荡湖1号”选育群体存在杂合子缺失现象,与南美白对虾42的相关研究结果一致。导致群体中杂合子缺失的原因很多,如非随机交配、奠基者效应、瓶颈效应、随机遗传漂变等43。对于人工选育群体而言,导致群体内杂合子缺失的主要原因是非随机交配引起等位基因在群体中的不均匀分布,一些等位基因在选育过程中被固定下来,频率逐代升高,另一些等位基因则被逐渐稀释,频率下降,甚至丢失。为防范因杂合子缺失导致的近交程度上升等问题,有必要对每个选育世代建立系谱档案,监测每代群体等位基因频率的变化,根据杂合子缺失具体情况,适当调整选育计划,降低近交风险。多态信息含量(PIC)是评价群体遗传多样性的重要参数。本研究中各群体PIC为0.85650.8911,均大于0.5,为高度多态性,说明“长荡湖1号”各群体均具有丰富的遗传变异。A系和B系三个世代的PIC从G0到G2稍有降低,与华南鲤28、带石斑鱼(Epinephelus coioides)和凡纳滨对虾44等选育品种PIC变化趋势相一致。因此,连续多代的人工选择对中华绒螯蟹“长荡湖1号”的遗传多样性造成了影响,其中A系和B系的PIC都有所降低,但各群体的遗传多态性依然很高。本研究中“长荡湖1号”子代的有效群体数量(Ne)相对基础群体有所下降,但各群体的Ne均保持在较高水平,与中华绒螯蟹10、哲罗鱼(Hucho tai-men)45和半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)46等研究结果相似。对于人工选育群体(中华绒螯蟹长荡湖1号)而言,考虑到育种工作的工作量、成本投入等因素,保持每代近交增量(F)控制在0.1%以内是比较理想的,鉴于此,根据公式F=1/2Ne,则每代Ne应不少于500。3.33.3 中华绒螯蟹“长荡湖1号”的遗传分化Hardy-Weinber平衡检验是评估群体遗传结构稳定性的重要工具47。“长荡湖1号”各群体在20个微卫星位点中的Hardy-Weinberg平衡检测到的240个数据中,有87个显著偏离Hardy-Weinberg平衡(P0.05),占72.50%,表明“长荡湖1号”的遗传结构处于相对不稳定的状态。在红壳色文蛤(Mere-trix meretrix)48、细鳞鲑(Brachymystax lenok)49和中国对虾50等水产物种的选育过程中,亦发现了各代选育群体显著偏离Hardy-Weinberg平衡的现象。样本数量少、侧翼序列出现变异和近亲繁殖引起杂合子缺失都会导致群体基因型偏离Hardy-Weinberg平衡51。而本实验每个群体有30个样本,已达到进行微卫星遗传多样性分析所需的样本量52,53。因此,导致“长荡湖1号”中华绒螯蟹各位点偏离Hardy-Weinberg平衡的原因可能是近亲交配。相比较而言,A系有78.33%的数据显著偏离Hardy-Weinberg平衡,而B系中显著偏离Hardy-Weinberg平衡的数据占66.67%,因此“长荡湖1号”A系的遗传结构更不稳定。遗传分化指数Fst是评价群体间遗传分化程度的指标。根据Wright54的划分,Fst为00.05,群体间遗传分化很小,可以不考虑;Fst为0.050.15,群体间存在中等程度的遗传分化;Fst为0.150.25,群体间遗传分化较大;Fst为0.25以上,群体间遗传分化极大。本实验结果各群体之间Fst为0.00260.0125,均小于0.05,表明“长荡湖1号”各群体间遗传分化程度微弱,这与以往中华绒螯蟹微卫星遗传多样性研究结果一致。AMOVA分析结果表明,“长荡湖1号”仅0.87%的变异存在于各群体间,而99.13%的变异发生在群体内个体间,表明“长荡湖1号”各群体间遗传分化较弱,这与以往研究一致11,18。其中,A系3个世代各群体间的变异所占比例高于B系,表明B系各世代群体间遗传结构较稳定。总的来说,采用微卫星标记估算河蟹群体遗传多样性参数的精度受到两个因素的影响,一是采样河蟹样本大小,二是微卫星标记的数量多少,一般情况下,样本容量越大,微卫星标记数量越多,则遗传多样性参数(Ho和He)的估计值越精确。但考虑到微卫星标记的局限性,后续的检测拟采用单核苷酸多态性(SNPs)来进行评估分析。SNPs具有多态性丰富,分布广泛和易于检测等优点在遗传多样性研究、品种鉴定和动植物育种等领域受到广泛使用5557。本课题组也在进行“长荡湖1号”分子育种芯片的开发,初步完成30K位点的筛选,后续完成开发的芯片将被用于检测与性状相关的位点,以此来提高选育效率,并且能够做到大规模遗传多样性和有效种群的分析监控。9 期庄振俊等:中华绒螯蟹“长荡湖1号”连续3个世代的遗传多样性分析1529“长荡湖1号”群体选育过程中,留种率是4.5%。选择压力越高时,每代留种的个体越少,有效群体数量下降越快,群体内杂合度下降越快,群体内遗传一致度(遗传纯度)升高越快。为防止遗传纯度上升过快而引起近交衰退加速,有必要根据河蟹自身的生物学特性(繁殖力、世代间隔等)和科研、生产单位的预先制定的育种计划,设定合理的选择压力,一方面保证每代足够的遗传进展,另一方面,防止遗传一致度过快上升和近交衰退的发生,保护选育群体的遗传性能。由于人为对优良性状的长期选育,导致“长荡湖1号”遗传多样性下降。为避免遗传多样性的进一步下降导致种质退化,同时也要保持优良性状,控制群体内平均近交系数,笔者认为应该采用以下技术措施:建立河蟹育种核心群体的谱系档案,采用现代可靠的分子遗传标记对每只亲蟹进行基因分型,并计算个体间的亲缘系数(Relatedness),根据计算结果对其编号,在人工繁殖时,尽可能挑选亲缘系数较小的亲本进行随机配组,从而最低限度降低子代的近交风险。与此同时,保证每代参加繁育的亲本有效群体大小在500只以上,从而最大程度保留亲本群体的杂合度。为增加A系和B系群体的遗传一致度,可以适时采用建立全同胞或半同胞家系的方法,逐代提高选育群体的遗传纯度。4 4 结论中华绒螯蟹“长荡湖1号”经过2代选育,出现杂合子缺失和多态信息含量降低现象,遗传结构处于相对不稳定的状态,但各群体的遗传多样性依然较高,遗传分化程度微弱,表