长期随访RASAL1甲基化与肾间质纤维化及肾功能减退的关系.pdf

复旦学报（医学版）Fudan Univ J Med Sci2023 May，50（3）长期随访 RASAL1甲基化与肾间质纤维化及肾功能减退的关系张笛1 张函1 陈静1 张晨2 沈子妍1 章晓燕1（1复旦大学附属中山医院肾内科 上海 200032；2复旦大学生殖与发育研究院 上海 200011）【摘要】目的分析 RASAL1 基因启动子甲基化与慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）患者肾间质纤维化及预后的关系。方法本研究是单中心回顾性队列研究，纳入 33例行肾活检病理检查的 CKD 患者，于 2012 年 10月至 2013 年 1 月入组，并随访至 2021 年 12 月。焦磷酸测序法检测患者肾组织及外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）RASAL1基因启动子的甲基化水平。分析 RASAL1甲基化水平与肾功能、肾脏病理损伤指标及肾脏预后的关系。结果33 例 CKD 患者肾组织 RASAL1 甲基化率为 1.57%（1.14%，2.29%）。Spearman 相 关 分 析 提 示，肾 组 织 及 PBMC 的 RASAL1 甲 基 化 率 与 估 算 肾 小 球 滤 过 率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）呈负相关（=0.598 和0.590，P0.01）。肾组织 RASAL1 甲基化率预测基线肾功能减退的ROC 曲线下面积为 0.942（P0.01）。肾组织 RASAL1 高甲基化组患者肾间质纤维化比例明显高于低甲基化组（83.3%vs.38.1%，P0.05）。6例患者随访过程中 eGFR 较基线下降超过 20%，肾组织 RASAL1高甲基化组患者发生 eGFR进一步下降的概率高于低甲基化组（P0.01）。结论CKD 患者肾脏 RASAL1甲基化与肾间质纤维化及 eGFR下降相关。【关键词】慢性肾脏病（CKD）；DNA甲基化；RASAL1；肾脏纤维化【中图分类号】R692.5 【文献标志码】A doi：10.3969/j.issn.1672-8467.2023.03.002Long-term longitudinal study of the effect of RASAL1 hypermethylation on renal fibrosis and renal function deteriorationZHANG Di1，ZHANG Han1，CHEN Jing1，ZHANG Chen2，SHEN Zi-yan1，ZHANG Xiao-yan1（1Department of Nephrology，Zhongshan Hospital，Fudan University，Shanghai 200032，China；2Institute of Reproduction and Development，Fudan University，Shanghai 200011，China）【Abstract】ObjectiveTo analyze the effect of RASAL1 gene promoter methylation on renal fibrosis and renal function deterioration in patients with chronic kidney disease（CKD）.MethodsThis study is a monocentric retrospective cohort study，including 33 patients with CKD who underwent renal biopsy from Oct 2012 to Jan 2013.Patients were followed up until Dec 2021.The methylation level of RASAL1 gene promoter in renal biopsy tissue and peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）were measured by pyrosequencing.Results The mean methylation rate of RASAL1 gene promoter in renal tissue was 1.57%（1.14%，2.29%）.Spearman correlation analysis showed that renal tissue（=-0.598，P0.01）and PBMCs（=-0.590，P0.01）RASAL1 methylation were negatively correlated with estimated glomerular filtration rate（eGFR）.The AUC of renal tissue RASAL1 methylation rate for predicting baseline renal function impairment was 0.942（P0.01）.In RASAL1 hypermethylation group，the proportion of patients 国家自然科学基金（81903972，82002018）ZHANG Di and ZHANG Han contributed equally to this work Corresponding author E-mail：zhang.xiaoyanzs- 网络首发时间：2023-05-16 08 57 12 网络首发地址：https：/ RASAL1甲基化与肾间质纤维化及肾功能减退的关系with renal interstitial fibrosis was significantly higher than patients with hypomethylation（83.3%vs.38.1%，P0.05）.Six patients had a decrease in eGFR of more than 20%during the follow-up.The probability of eGFR decline events in patients with RASAL1 hypermethylation was higher than hypomethylated group（P0.01）.Conclusion RASAL1 hypermethylation is associated with renal interstitial fibrosis and renal function deterioration in patients with CKD.【Key words】chronic kidney disease（CKD）；DNA methylation；RASAL1；renal fibrosis*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(81903972,82002018).慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）是一种全球流行病，影响着全世界超过 10%的人口1。肾间质纤维化是 CKD进展的共同最终途径，但目前治疗手段仍有限2。表观遗传学修饰尤其是 DNA甲 基 化 在 肾 脏 纤 维 化 和 CKD 进 展 中 起 重 要 作用3-5。RASAL1 基因是一种 Ras活性调节基因，其编 码 蛋 白 属 于 Ras GTP 酶 活 化 蛋 白 家 族（Ras GTPase-activating protein，Ras GAP）中的 GAP1 家族6。RASAL1能将GTP水解为GDP而使Ras蛋白失活，从而参与细胞的增殖、分化、凋亡。RASAL1低表达在多种恶性肿瘤中的作用已得到广泛研究，而甲基化是 RASAL1基因表达调控的重要机制7。近年来，RASAL1在脏器纤维化中的作用亦引起重视。既往研究通过肾纤维化的多种实验动物模型、肾活检的小队列人群、人肾脏成纤维细胞的体外培养等，证实 RASAL1甲基化及低表达与肾脏纤维化有关8-11。这一作用有待于更大范围人群、不同种族尤其是亚洲人群、不同病理类型肾病的验证以及长时间的随访研究。本研究拟通过肾活检的单中心队列，经过平均6.9年的随访，进一步从患者层面验证 RASAL1甲基化在肾脏纤维化及CKD进展中的作用。资 料 和 方 法研究设计 本研究为单中心回顾性队列研究，纳入 2012 年 10 月至 2013 年 1 月在复旦大学附属中山医院肾内科行肾活检病理检查的 CKD患者，临床和病理资料完整，临床随访至 2021年 12月。本研究获得复旦大学附属中山医院伦理委员会的批准（批准号：B2022-041R），入组患者均签署知情同意书。CKD 定义为肾脏损伤或肾小球滤过率（glomerular filtration rate，GFR）60 mL min11.73m2持续超过 3 个月。排除标准：合并恶性肿瘤、活动性感染、3 个月内使用过糖皮质激素或免疫抑制剂、吸烟的患者。一般资料 记录患者肾穿时性别、年龄、肾脏基础疾病及相关疾病（如高血压、糖尿病、自身免疫病、肿瘤等）病史。实验室指标包括血常规、尿常规、肝 肾 功 能、电 解 质、24 h 尿 蛋 白 定 量。根 据CKD-EPI 2009 公 式 计 算 估 算 肾 小 球 滤 过 率（eGFR）。eGFR=141min（SCr/，1）max（SCr/，1）1.2090.993Age1.021（女性）。其中，SCr表示血肌酐（mg/dL），=0.7（女性）或 0.9（男性），=0.329（女性）或0.411（男性）。病理损伤指标 记录研究对象的肾活检病理诊断。肾小管间质各项病理参数参照 Katafuchi 评分标准12，包括有无间质炎性细胞浸润、间质纤维化和肾小管萎缩。根据盲法原则，由一位病理医师独立阅片，阅片人对患者临床资料不知情。RASAL1基因甲基化检测 标本留取 肾组织来源于肾活检常规病理检查 后 的 剩 余 组 织，外 周 血 单 个 核 细 胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）来源于常规实验室检查后剩余的血细胞部分。主要步骤 使用 DNA 提取试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司 进行 DNA 抽提。CpG 岛选取及引物设计：RASAL1 PCR 引物，F：5-GGGGG-TATAGATTATGTTTTTTAAGTTTAA-3；R：5-CAAAAACCTCCCCACAATCC-3（生物素化）。RASAL1 焦磷酸测序引物 5-AGGAAGGGGGTT-TTTTTTTAT-3。引物由上海生工生物合成。使用 Bisul DREAM-Methylation Universal 试剂盒（上海奇悟生物科技有限公司）对 DNA进行亚硫酸盐处理，使 用 QIAGEN PyroMark PCR 试 剂 盒（德 国QIAGEN公司）对目的片段进行扩增。焦磷酸测序：按照 PyroMark Q96测序仪（德国 QIAGEN 公司）操作说明进行目标序列的甲基化分析。CpG位点的甲基化程度表示为甲基化的胞嘧啶占所有胞嘧啶的比325复旦学报（医学版）2023年 5月，50（3）例。分 别 检 测 7 个 CpG 岛 位 点 的 甲 基 化 水 平（326364），这些位点的超甲基化与基因沉默有关7。RASAL1的甲基化水平取7个位点的平均值。随访及结局 记录患者随访过程中的尿蛋白、肾功能、用药情况（是否使用激素/免疫抑制剂）。主 要 终 点：终 末 期 肾 病（end stage kidney disease，ESKD，即 eGFR15 mL min11.73 m2或 肾 脏 替代治疗；eGFR 较基线值下降超过 40%。次要终点：eGFR较基线值下降超过 20%。33例患者平均随访83（25103）个月，无死亡病例，无主要终点事件，6例患者达到次要终点。统计学方法 采用 SPSS 20.0统计软件进行统计学处理。计量资料以 xs（正态分布）或 M（P25，P75）（非正态分布）表示，计数资料以绝对例数或百分比（%）表示。组间计量资料比较采用 t 检验，计数资料比较采用 2检验。采用 Spearman 分析行单因素相关分析。采用 ROC 曲线下面积（AUC）评估肾组织 RASAL1 甲基化水平对肾功能减退的诊断价 值，肾 组 织 RASLA1 甲 基 化 率 的 临 界 值 为1.93%。RASAL1 甲基化率呈非正态分布，进行自然对数转换后偏态得到纠正，分析中采用对数转换值。采用 Kaplan-Meier曲线分析高甲基化组和低甲基化组患者无事件肾脏存活率。P0.05 为差异有统计学意义。结 果患者基本资料 33例 CKD 患者，男性 18例，女性 15 例，年龄（39.315.2）岁。肾活检病理类型包括 IgA 肾病 14 例（42.4%），膜性肾病 6 例（18.2%），微小病变病 5例（15.1%），局灶节段性肾小球硬化 3例（9.1%），局灶节段增生性肾炎 3 例（9.1%），系膜增 生 性 肾 炎 2 例（6.1%）。合 并 高 血 压 者 11 例（33.3%），合并糖尿病者 1 例（3.0%）。患者平均血肌 酐（78.619.8）mol/L，eGFR（97.119.9）mL min11.73m2。CKD1 期 22 例（66.7%），2 期 10例（30.3%），3期 1例（3.0%）。分别对患者肾组织及PBMC RASAL1 甲基化进行检测，检测 7 个位点。肾组织各位点 RASAL1 甲基化率平均值为 1.57%（1.14%，2.29%）（表 1）。肾组织RASAL1甲基化与eGFR的相关性 将患者分为肾功能正常组（eGFR90 mL min1 1.73 m2）和肾功能减退组（eGFR90 mL min11.73 m2），肾功能减退组患者肾组织 RASAL1 甲基化率显著高 于 肾 功 能 正 常 组2.57%（2.29%，3.00%）vs.1.43%（1.14%，1.61%），t=6.577，P0.01。肾组织 RASAL1甲基化率评价患者肾功能减退的 AUC为 0.942（P0.01），肾组织 RASAL1 甲基化率为临界值 1.93%时，预测肾功能减退的灵敏度为 91%，特异性为 87%（图 1）。Spearman 相关性分析提示，肾 组 织 RASAL1 甲 基 化 率 与 eGFR 负 相 关（=0.598，P0.01）（图 2）。表 1CKD患者 RASAL1甲基化水平Tab 1 RASAL1 methylation levels in CKD patientsM（P25，P75）Position1234567AverageRenal tissue（%mC）0（0，2.00）4.00（3.00，5.50）0（0，0）2.00（2.00，3.00）2.00（2.00，2.00）2.00（2.00，2.00）0（0，2.00）1.57（1.14，2.29）PBMC（%mC）0（0，0）2.00（2.00，2.00）0（0，0）0（0，2.00）0（0，0）0（0，2.00）0（0，0）0.57（0.57，0.64）图 1肾组织 RASAL1甲基化率预测基线肾功能减退的 ROC曲线Fig 1ROC curve of RASAL1 methylation level in renal tissue to predict renal function impairment图 2肾组织 RASAL1甲基化率与基线 eGFR的相关性Fig 2Correlation between RASAL1 methylation level in renal tissue and eGFR326张笛，等.长期随访 RASAL1甲基化与肾间质纤维化及肾功能减退的关系患者外周血 PBMC RASAL1甲基化率 33例患者 PBMC 各 位 点 的 RASAL1 甲 基 化 率 平 均 值 为0.57%（0.57%，0.64%）。Spearman 相关性分析提示，PBMC 与肾组织 RASAL1 甲基化率呈正相关（0.413，P0.05）。PBMC RASAL1甲基化率与eGFR负相关（=0.590，P0.01）。肾组织RASAL1甲基化与CKD患者肾脏病理损伤的相关性以1.93%为临界值，高甲基化组患者肾间质 纤 维 化 比 例 明 显 高 于 低 甲 基 化 组 患 者（P0.05，表 2）。肾组织 RASAL1 甲基化对 CKD 患者预后的影响 33 例患者平均随访 83（25103）个月，无死亡病例，无主要终点事件，6例患者随访过程中达到次要 终 点（eGFR 较 基 线 下 降 超 过 20%）。肾 组 织RASAL1 低甲基化组（n=21）和高甲基化组（n=12）患者的基线和预后资料见表 3。两组分别有 1 例（n=21）和 5 例（n=12）的 患 者 达 到 次 要 终 点（P0.01）。Kaplan-Meier曲线分析提示，高甲基化组患者无恶化事件肾脏存活率明显低于低甲基化组患者，但差异无统计学意义（P=0.064，图 3）。讨 论近年来，表观遗传修饰包括 DNA 甲基化、羟甲基化、组蛋白修饰等在肾脏纤维化及 CKD进展中的作用引起重视，可能作为潜在的治疗靶点3，13-15。既往研究发现 RASAL1 异常甲基化及低表达参与了包括肾纤维化在内的多种脏器纤维化过程16-17。本表 2肾组织 RASAL1甲基化与 CKD患者肾间质小管损伤的关系Tab 2RASAL1 methylation level in renal tissue and renal tubulointerstitial lesionsn（%）IndexInterstitial fibrosisWithoutWithTubular atrophyWithoutWithInterstitial cell infiltrationWithoutWithHypomethylation group（n=21）13（61.9）8（38.1）1（4.8）20（95.2）5（23.8）16（76.2）Hypermethylation group（n=12）2（16.7）10（83.3）1（8.3）11（91.7）1（8.3）11（91.7）2/P6.303/0.0120.171/0.6791.229/0.268表 3CKD患者基线及随访资料Tab 3Baseline and follow-up parameters of subjects xs，M（P25，P75）or n（%）ParametersAge（y）Male genderHypertensionDiabetes mellitusSerum creatinine（mol/L）Serum uric acid（mol/L）eGFR（mL min11.73 m2）Proteinuria（g/24 h）Follow up time（mo）Glucocorticoid/immunosuppressantsDeathPrimary endpointSecondary endpointAll（n=33）39.315.218（54.5）11（33.3）1（3.0）78.619.8380.5103.597.119.91.7（0.8，4.2）83（25，103）19（57.6）006（18.2）Hypomethylation group（n=21）36.413.410（47.6）5（23.8）0（0）70.317.6382.8124.8107.816.51.7（0.9，5.8）83（22，98）12（57.1）001（4.8）Hypermethylation group（n=12）44.217.58（66.7）6（50.0）1（8.3）93.015.1376.653.079.710.32.4（0.9，3.7）90（51，106）7（58.3）005（41.7）Z，t or 2-1.416（2）1.117（3）2.357（3）1.695（3）3.744（2）0.162（2）5.318（2）0.146（2）1.087（1）0.004（3）/6.991（3）P0.1670.2900.1250.1930.0010.8720.0010.885a0.2910.947/0.008（1）Z value；（2）t test；（3）2 test.a Data were ln transformed.327复旦学报（医学版）2023年 5月，50（3）研究纳入了 33 例行肾活检的 CKD 患者，排除了吸烟、恶性肿瘤等可能会影响 DNA 甲基化水平的情况18，采用焦磷酸测序法检测肾组织 RASAL1基因启动子甲基化水平，横断面分析中，Spearman 相关分析提示肾组织 RASAL1 甲基化率与 eGFR 呈负相关（P0.01）。肾组织 RASAL1甲基化率预测基线肾功能减退的 AUC 为 0.942（P0.01）。肾脏病理损伤指标分析提示，肾组织 RASAL1高甲基化组患者肾间质纤维化比例明显高于低甲基化组患者（83.3%vs.38.1%，P0.05）。提 示 肾 组 织RASAL1 甲基化与肾间质纤维化及肾功能减退相关，与既往研究结果一致。既往实验研究表明，RASAL1甲基化是肾纤维化的重要机制。Bechtel 等8通过活检肾脏分离出人成纤维细胞，体外培养后发现 12个甲基化水平差异显著的纤维化相关基因，并通过体内外实验证实，RASAL1的高甲基化可导致 RASAL1表达持续性下调，促进成纤维细胞持续活化和肾纤维化。后续研究进一步在肾纤维化的多种动物模型中验证了 RASAL1 异常甲基化的作用，如单侧输尿管梗阻、叶酸肾病、糖尿病肾病、5/6肾切除、肾缺血再灌注模型等9-11。但在 CKD 患者中，特别是亚洲人群，RASAL1 甲基化对肾间质纤维化及慢性肾病进展的作用研究尚少。Tampe等9曾通过肾活检的小队列人群（共 6 例），证实肾间质纤维化的患者存在RASAL1 甲基化及 mRNA 低表达。这一作用有待于更大范围人群、不同种族人群、不同病理类型肾病的验证以及长时间的随访研究。本研究的优势在于纳入了 33例 CKD 患者检测肾组织 RASAL1甲基化水平，较以往研究病例数明显增加，经过平均6.9 年的随访发现，肾组织 RASAL1 高甲基化组患者发生 eGFR 进一步下降的概率高于低甲基化组（P0.01）。从 患 者 层 面 进 一 步 证 实 了 肾 组 织RASAL1 甲基化与肾间质纤维化及肾功能减退相关。目前生存分析的结果无统计学意义，后续进一步扩大样本量，有望得到更有说服力的结论。既往研究发现，循环中游离 RASAL1基因甲基化片段水平与肾脏 RASAL1 甲基化水平及肾脏纤维化程度正相关，但样本量较小（9 例）10。另有研究发现，外周血 PBMC的 RASAL1甲基化水平与镉（具有肾毒性的重金属）污染地区人群的 eGFR 下降及 肾 间 质 小 管 损 伤 相 关，但 无 肾 组 织 甲 基 化 数据19。本研究同时检测了患者肾组织及 PBMC 的RASAL1 甲 基 化 水 平，结 果 显 示：PBMC 的RASAL1 甲基化水平与肾组织正相关（0.413，P0.05）。评价肾组织病理损伤及肾脏预后方面，肾组织 RASAL1 甲基化优于 PBMC。可能与本研究纳入的 CKD 患者病情较轻，PBMC 的 RASAL1甲基化水平普遍偏低有关。总之，DNA 甲基化用于肾纤维化预测的无创标志物还有待进一步研究。在 肾 小 球 硬 化 程 度 方 面，我 们 发 现 肾 组 织RASAL1 高甲基化组患者肾活检病理所示肾小球硬化比例高于低甲基化组 0.15（0.07，0.37）vs.0.05（0，0.08），P=0.036，提示 RASAL1 甲基化与肾小球硬化存在一定的相关性。但既往实验研究中，RASAL1 对肾脏纤维化的影响主要关注于肾小管及间质11，17，RASAL1 在肾小球硬化中的作用及机制有待进一步研究。本研究存在以下不足：（1）总样本量偏小，纳入患者以 CKD12期为主，未纳入肾功能明显减退的患者；（2）缺少肾组织 RASAL1转录及表达的数据。表观遗传改变是可逆的，因此有重要的治疗靶点前景。既往实验研究发现骨形态发生蛋白 7、肼苯哒嗪等可通过逆转 RASAL1 甲基化改善肾纤维化9，11。最 近 有 研 究 发 现 基 于 高 保 真 CRISPR/Cas9技术的基因特异性双加氧酶，可通过靶向消除RASAL1 和 Klotho 的 异 常 甲 基 化，改 善 肾 纤 维化20。因此，RASAL1甲基化在肾脏病领域有广泛的研究前景和重要的临床意义。综上所述，CKD 患者肾脏 RASAL1 基因甲基化与肾间质纤维化和基线 eGFR 下降相关。肾脏图 3CKD患者肾组织 RASAL1甲基化水平与肾脏预后的关系（Kaplan-Meier曲线）Fig 3RASAL1 methylation level in renal tissue and renal prognosis in patients with CKD（Kaplan-Meier curve）328张笛，等.长期随访 RASAL1甲基化与肾间质纤维化及肾功能减退的关系RASAL1甲基化与随访过程中 eGFR进一步下降也存在相关趋势，但未见统计学意义。后续研究中将进一步扩大样本量，分析不同疾病类型、疾病各个阶段 RASAL1甲基化的作用。作者贡献声明张笛数据整理和分析，论文撰写。张函研究构思，数据分析，论文修订。陈静，张晨，沈子妍数据收集和分析，文献调研。章晓燕研究构思，论文指导。利益冲突声明所有作者均声明不存在利益冲突。参 考 文 献1 WANG F，HE K，WANG J，et al.Prevalence and risk factors for CKD：a comparison between the adult populations in China and the United States J.Kidney Int Rep，2018，3（5）：1135-1143.2 杨梦凡，范桢亮，尹日平，等.肾小管间质纤维化发病机制的研究进展 J.中国中西医结合肾病杂志，2021，22（2）：186-188.3 TAMPE B，ZEISBERG M.Chromatin dynamics at the core of kidney fibrosisJ.Matrix Biol，2018，68-69：194-229.4 刘婉婷，钱诗蕾，袁小澎.肾纤维化的表观遗传学研究进展 J.广东医学，2019，40（9）：1342-1344.5 陈林娜，张鹏，王汉民.DNA 甲基化与糖尿病肾病的研究进展 J.医学研究杂志，2019，48（12）：11-13.6 SOT B，BEHRMANN E，RAUNSER S，et al.Ras GTPase activating（RasGAP）activity of the dual specificity GAP protein rasal requires colocalization and C2 domain binding to lipid membranesJ.Proc Natl Acad Sci，2013，110（1）：111-116.7 JIN H，WANG X，YING J，et al.Epigenetic silencing of a Ca2+-regulated Ras GTPase-activating protein RASAL defines a new mechanism of Ras activation in human cancersJ.Proc Natl Acad 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