糖代谢异常患者外周血Treg和Th17细胞的变化.pdf

当代医药论丛 2023 年 第 21 卷 第 15 期检测与诊断122糖代谢异常患者外周血Treg和Th17细胞的变化沈艳1，李文花1，龙密密1，谭玉洁2*（1.六盘水市人民医院检验科，贵州六盘水553000；2.贵州医科大学附属医院临床检验中心，贵州贵阳550004）摘要 目的：研究糖代谢异常（GM）患者外周血 Treg 和 Th17 细胞的变化，探讨 GM 患者的免疫功能状态。方法：选取贵州医科大学附属医院门诊及住院部的 GM 患者 78 例作为研究对象，其中包括糖尿病前期（DM 前期）患者 20 例、2 型糖尿病初诊（T2DM 初诊）患者 20 例、2 型糖尿病伴并发症（T2DM 伴并发症）患者 20 例和 1 型糖尿病（T1DM）患者 18 例，并以同期健康体检者 20 例作为对照组（NC 组）。应用流式细胞术对全部研究对象进行 Treg 和 Th17 细胞检测，并采用 SPSS 18.0 软件对相关数据进行统计学分析。结果：与 NC 组比较，GM 组的 Treg/Th17 降低，Treg 和 Th17细胞均升高（P 0.05）。与 NC 组比较，不同病程（DM 前期、T2DM 初诊、T2DM 伴并发症）GM 组的 Treg 和 Th17 细胞均升高（除 DM 前期组的 Treg 细胞），Treg/Th17 均降低（P 0.05），且随着病程进展，Treg 和 Th17 细胞逐渐增加，Treg/Th17 逐渐降低，其中以 T2DM 伴并发症组最为明显。与 NC 组比较，T1DM 组和 T2DM 组的 Treg 和 Th17 细胞均升高，Treg/Th17 均降低（P 0.05）。结论：GM 患者存在免疫功能缺陷或调节紊乱，且免疫功能缺陷或调节紊乱随 GM 程度进一步加重，其中以 T2DM 伴并发症患者最为严重。关键词 糖代谢异常；Treg 细胞；Th17 细胞；糖尿病；流式细胞术 中图分类号 R587.1 文献标识码 A 文章编号 2095-7629-（2023）15-0122-03糖代谢异常（GM）是机体葡萄糖代谢出现异常的一类疾病，包括糖尿病（DM）前期和 DM。DM 的发生与遗传、环境及自身免疫等多种因素有关，但其具体病因目前尚未明确。近年来的研究表明，DM 是以高血糖为主要特征的低度炎症性疾病1，而炎症的发生与机体免疫状态密切相关，已有文献报道 DM 的发生与免疫功能紊乱有关2-3。Th17 细胞是一种不同于 Th1、Th2 的新型 CD4+T 细胞，在各种传染性疾病、癌症和许多自身免疫性疾病的发生发展中起着重要作用。Treg 细胞是一种具有免疫调节功能的免疫抑制性 T 细胞，与多种免疫性疾病的发病机制或免疫状态密切相关，在维持机体免疫稳态和调控免疫应答方面发挥着重要作用。Treg 细胞分泌的转化生长因子-（TGF-）细胞因子可促进 Th17 细胞的分化，提示Th17 细胞与 Treg 细胞的分化存在密切的联系。Th17细胞与 Treg 细胞之间处于动态平衡状态，若这种平衡状态被打破则易发生炎症及自身免疫性疾病。目前，DM 中关于 Treg 细胞的研究尚存在争议。本研究拟通过观察 GM 患者外周血 Th17 细胞和 Treg 细胞数量的变化，探讨 GM 时机体免疫功能及其平衡调节的变化情况，明晰相关免疫细胞在 GM 发生发展中的作用，以期为GM的发生机制及治疗策略研究提供新的思路。1资料与方法1.1一般资料选取贵州医科大学附属医院门诊及住院部的 GM患者 78 例为研究对象，其中男 45 例，女 33 例，年龄 11 75 岁，平均年龄（47.5315.68）岁。在这些患者中，有 T1DM 患者 18 例，DM 前期患者 20 例，T2DM 初诊患者 20 例，T2DM 伴并发症患者 20 例。GM 分类符合 1999 年世界卫生组织（WHO）糖尿病专家委员会提出的相关标准。对照组为我院同期健康体检者 20 例，其中男 8 例，女 12 例，年龄 28 79 岁，平均年龄（46.1513.44）岁。健康体检者与 GM 患者的性别及年龄相比，差异无统计学意义（P 0.05），具有可比性。1.2仪器与试剂CD4-FITC、CD25-PE-Cy7、IL-17A-PE、A-Fluor 647-CD127（均为鼠抗人），同型对照 FITC Mouse IgG1，Isotype Control RUO、Alexa Fluor 647 Mouse IgG1 Isotype Control RUO、PE Mouse IgG1，Isotype Control RUO、PE-Cy 7 Mouse IgG1 Isotype Control RUO，刺激剂+蛋白转运抑制剂，均为美国 BD 公司生产。FACS Canto 流式细胞仪由BD 公司制造。1.3方法1.3.1 标本采集 所有研究对象均隔夜禁食 8 12 h，采集清晨空腹静脉血 2 mL，置于 EDTA-K2 真空抗凝采血管内，混匀后于室温下保存，用于检测 Treg 细胞和 Th17 细胞的表达。1.3.2 Treg 细 胞 检 测 取 CD4-FITC、A-Fluor 647-CD127 各 5 L、CD25-PE-Cy7 1.25 L，加 入50 L EDTA-K2 抗凝血，震荡混匀后于室温下避光孵育 30 min。加入溶血素 1 mL，震荡混匀后于室温下溶血 5 min，然后再置于 37 恒温水浴箱中溶作者简介：沈艳（1990），女，汉族，贵州六盘水人，研究方向：免疫相关性疾病*通讯作者：谭玉洁（1968），女，汉族，贵州贵阳人，研究方向：免疫相关性疾病当代医药论丛 2023 年 第 21 卷 第 15 期检测与诊断123血 5 min。待血融透后，加入 3 mL PBS，震荡混匀后用低速离心机以 1500 r/min 的转速离心 5 min，洗涤两次，加入 0.3 mL PBS 重悬细胞，混匀后上机检测。收集 20 000 个淋巴细胞，采用 Flowj0 7.6 软件分析 CD4+CD25+CD127low 细胞占 CD4+T 细胞的百分比（Treg/CD4+T%）。1.3.3 Th17 细胞检测 用人淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞（PBMC），加入 PBS 至 1 mL，重悬细胞，混匀备用。取 24 孔细胞培养板，每孔加入 1 mL含 10%FBS 的 1640 培养基，然后加入上述制备好的细胞悬液，调整细胞浓度为 1106/mL，用移液枪吹打混匀，再加入 2 L 刺激剂+蛋白转运抑制剂，吹打混匀，置于 37、5%的 CO2培养箱中培养刺激 6 8 h。加入 PBS，以 1500 r/min 的转速离心 5 min，洗涤两次，加入 10 L 的 CD4-FITC，4 下避光孵育 30 min。加入 PBS，以 1500 r/min 的转速离心 5 min，洗涤 2次，加入固定/破膜洗液 1 mL，颠倒混匀，4 下避光孵育 1 h。加入固定/破膜洗液 1 mL，以 1500 r/min的转速离心 5 min，洗涤 2 次；加入 10 L IL-17A-PE，4 下避光孵育 50 min。加入固定/破膜洗液 1 mL，以 1500 r/min 的转速离心 5 min，洗涤 2 次，加入 300 L的 PBS 重悬细胞，上机检测。每管收集 20 000 个淋巴细胞，采用 Flowj0 7.6 软件分析 CD4+IL-17A+细胞占CD4+T 细胞的百分比（Th17/CD4+T%）。1.4统计学方法采用 SPSS 18.0 软件进行统计学分析，计量资料用sx 表示，正态分布的计量资料两组间比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐者用 LSD 检验，方差不齐者用 Dunnetts T3 检验；计数资料用%表示，以 检验，以 P 0.05为差异有统计学意义。2结果2.1GM 组外周血 Treg、Th17 细胞及 Treg/Th17的对比与 NC 组 比 较，GM 组 的 Treg/Th17 降 低，Treg和 Th17 细胞均升高（P 0.05）。详见表 1。表1 GM 组外周血Treg、Th17细胞及Treg/Th17 的对比（sx）组别T r e g 细胞（%）T h 1 7 细胞（%）T r e g/T h 1 7G M组（n=7 8）4.6 7 1.0 4*1.4 9 0.3 8*3.2 8 0.9 6*N C组（n=2 0）3.6 2 0.6 40.8 3 0.1 94.5 4 1.1 9注：与 NC 组比较，P 0.01。2.2不同病程 GM 患者外周血 Treg、Th17 细胞及 Treg/Th17 的对比与 NC 组比较，不同病程（DM 前期、T2DM 初诊、T2DM 伴并发症）GM 组的 Treg 和 Th17 细胞均升高（除 DM 前期组的 Treg 细胞），Treg/Th17 均降低（P 0.05），且随着病程进展，Treg 和 Th17 细胞逐渐增加，Treg/Th17 逐渐降低，其中以 T2DM 伴并发症组最为明显。详见表 2。表 2 不同病程 GM 患者外周血 Treg、Th17 细胞及 Treg/Th17的对比（sx）组别T r e g 细胞（%）T h 1 7 细胞（%）T r e g/T h 1 7D M前期（n=2 0）4.1 0 0.7 91.1 4 0.1 7a3.6 9 0.9 2aT 2 D M初诊（n=2 0）4.3 8 0.7 5a1.4 1 0.2 2a b3.2 2 0.9 4aT 2 D M伴并发症（n=2 0）5.2 1 1.3 0a b c1.7 8 0.2 3a b c2.9 6 0.7 8a bN C组F 值P 值3.6 2 0.6 41 0.7 7 70.0 0 2*0.8 3 0.1 97 8.1 0 40.0 0 0*4.5 4 1.1 91 0.0 4 70.0 0 0*注：组间比较，P 0.01；a 与 NC 组比较，P 0.05；b 与 DM 前期组比较，P 0.05；c 与 T2DM 初诊组比较，P 0.05。2.3不同类型 GM 患者外周血 Treg、Th17 细胞及 Treg/Th17 的对比与NC 组比较，T1DM 组和T2DM 组的Treg 和Th17细胞均升高，Treg/Th17 均降低（P 0.05）。详见表 3。表 3 不同类型 GM 患者外周血 Treg、Th17 细胞及 Treg/Th17的对比（sx）组别T r e g 细胞（%）T h 1 7 细胞（%）T r e g/T h 1 7T 1 D M组（n=1 8）5.0 4 0.8 5a1.6 5 0.4 6a3.2 7 1.0 8aT 2 D M组（n=4 0）4.8 0 1.1 3a1.6 0 0.2 9a3.0 9 0.8 6aN C组（n=2 0）F 值P 值3.6 2 0.6 41 2.9 6 30.0 0 0*0.8 3 0.1 94 5.4 9 20.0 0 0*4.5 4 1.1 91 4.3 8 00.0 0 0*注：组间比较，P 0.01；a 与 NC 组比较，P 0.05。3讨论Treg 细胞能分泌多种具有免疫调节功能的细胞因子，抑制效应 T 细胞的免疫应答，与多种免疫性疾病的发病机制或免疫状态密切相关，在维持机体免疫稳态和调控免疫应答方面具有重要作用。Th17 细胞是一种不同于 Th1、Th2 的新型 CD4+T 细胞，主要分泌白细胞介素-17（IL-17），受转录因子 RORrt 的分化调控，在各种传染性疾病、癌症和许多自身免疫性疾病的发生发展中起着重要作用。本研究中对所有研究对象均进行外周血 Treg 细胞和 Th17 细胞检测，结果发现 GM 组的 Treg 细胞和 Th17 细胞均升高，Treg/Th17 比值降低。国内外相关研究指出，Th17 细胞在DM 中表达上升，增加的 Th17 细胞可分泌效应因子，调节许多致炎因子的表达，从而引起 DM 患者的胰岛 细胞损害和死亡4。Treg 细胞在 DM 的发生发展中发挥着重要作用，DM 患者体内的 Treg 细胞存在数量或功能的缺陷。据报道，Treg 细胞对机体的免疫保护机制减弱可增强慢性炎症的刺激及增加炎性因子的分当代医药论丛 2023 年 第 21 卷 第 15 期检测与诊断124泌，导致胰岛素敏感性进一步减弱，引起 DM 的发生发展。研究发现，Treg细胞在DM的发病初期就会增加。也有研究发现，T1DM 患者体内的 Treg 细胞表达高于对照组。现阶段，关于 Treg 细胞的研究尚存在争议，可能与地区差异或研究人群异质性有关。本文数据显示，GM 患者的 Treg 细胞和 Th17 细胞均随病程进展而逐渐增加，Treg/Th17 比值逐渐降低，其中以T2DM 伴并发症者最为明显。Th17 细胞在 DM 前期就开始增加，而 Treg 细胞在 T2DM 初诊时才开始增加。Hotamisligil 于 1993 年首次在肥胖小鼠的脂肪组织中发现炎症因子与 DM 的发生有关。随后的研究发现，在 DM 发病前数年，患者体内就有炎症反应增强的迹象，而当 DM 伴并发症时，这种炎症反应有所增强5。本研究中通过观察不同类型的 DM 患者，我们还发现 T1DM 组和 T2DM 组的 Treg 细胞和 Th17 细胞均明显增加，提示 Treg 细胞和 Th17 细胞参与了 T1DM 和T2DM 的发病机制。Th17 细胞通过分泌细胞因子导致炎症反应放大，引起胰岛 细胞损害和死亡，最终导致 DM 的发生6；Treg 细胞与效应 T 细胞竞争白细胞介素-2（IL-2），造成效应 T 细胞凋亡，导致机体免疫功能紊乱，诱发 T1DM 等免疫性疾病7。Treg 细胞还可增强慢性炎症的刺激及增加炎性因子的分泌，导致胰岛素敏感性进一步减弱，诱发 T2DM。有学者研究发现，T1DM 患者体内的 Treg 细胞表达高于对照组。而 Glisic 等8发现，T1DM 患儿的 Treg 细胞中一些相关细胞因子低于正常对照组。可见，在病理情况下尽管机体代偿增加了 Treg 细胞的数量，但此类细胞可能存在功能缺陷，并不能通过调节或分泌作用产生相应水平的细胞因子。综上所述，GM 的发生与机体细胞免疫缺陷及体液免疫过度激活有关，主要表现为外周血 Treg/Th17平衡的异常。GM 患者的 Treg 细胞和 Th17 细胞均随病程进展而逐渐增加，Treg/Th17 逐渐降低，其中以T2DM 伴并发症者最为明显。Th17 细胞在 DM 前期就开始增加，而 Treg 细胞在 T2DM 初诊时才开始增加。T1DM 和 T2DM 患者的 Treg 细胞和 Th17 细胞均明显增加，提示 Treg 细胞和 Th17 细胞参与了 T1DM 和T2DM 的发病机制。因此，在临床工作中我们应重视T2DM 的发生与免疫机制的关系。参考文献1郭红,何军华.2 型糖尿病的免疫与炎症学说进展 J.临床医药实践,2017,26(4):300-303.2迟林,李昊淼,许晓风.2 型糖尿病患者外周血淋巴细胞亚群及 Treg 细胞检测及临床应用 J.山东医药,2011,51(40):87-89.3朱蕴庆,胡蕴,毛晓明.2 型糖尿病中免疫异常的研究进展 J.中国糖尿病杂志,2015,23(9):859-861.4杜爱民,曾姣娥,宁尚侠.2 型糖尿病患者 Th17 细胞检测及其临床意义 J.临床荟萃,2010,25(6):495-497.5林敏,陈平,李蓬秋.2型糖尿病足坏疽患者血清免疫球蛋白及IgG亚类的观察J.四川医学,2002,23(9):904-905.6Chen X T,Chen L L,Tan J Y,et al.Th17 and Th1 Lymphocytes Are Correlated with Chronic PeriodontitisJ.Immunological Investigations,2016,45(3):243-254.7Almahariq M,Mei F C,Wang H,et al.Exchange protein directly activated by cAMP modulates regulatory T-cell-mediated immunosuppressionJ.Biochemical Journal,2015,465(2):295.8Glisic S,Jailwala P.Interaction between Treg apoptosis pathways,Treg function and HLA risk evolves during type 1 diabetes pathogenesisJ.Plos One,2012,7(4):e36040.过敏原检测在儿童过敏性紫癜诊断中的应用价值研究张雪梅（启东市妇幼保健院儿三科，江苏南通226299）摘要 目的：探讨针对儿童过敏性紫癜采用过敏原检测技术进行诊断的价值。方法：选取启东市妇幼保健院2021 年 1 月至 2022 年 12 月期间收治的过敏性紫癜患儿共计 200 例为研究对象，将其设为讨论组，并选取同期的健康体检儿童共计 200 例，将其设为常模组。对两组均进行血清过敏原特异性免疫球蛋白 E（IgE）抗体检测，并对检测结果进行对比分析。结果：对两组进行食物类（包括蟹类、虾类、鳕鱼、小麦、西红柿、大豆、蛋清及蛋黄、花生、牛奶、坚果混合）血清过敏原检测结果显示，讨论组的食物类血清过敏原特异性 IgE 抗体总阳性率高于常模组，差异有统计学意义（P 0.05）。对两组进行吸入类物质（包括狗毛及猫毛皮屑、屋尘及粉尘螨、豚草、蟑螂、葎草、榆树、梧桐、点青霉/烟曲酶）血清过敏原检测结果显示，讨论组的吸入类物质血清过敏原特异性 IgE 抗体总阳性率高于常模组，差异有统计学意义（P 0.05）。结论：针对儿童过敏性紫癜，可采用血清过敏原检测的方式进行临床诊疗并确定过敏原，这对儿童过敏性紫癜的防治具有重要意义。关键词 儿童过敏性紫癜；过敏原检测；免疫球蛋白 E 中图分类号 R446 文献标识码 A 文章编号 2095-7629-（2023）15-0124-04