盐、碱胁迫下高丹草苗期生理特征及转录组学分析_孔德真.pdf

研究报告生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(6):199-207收稿日期：2022-06-22基金项目：兵团重点领域科技攻关项目（2020AB016）作者简介：孔德真，男，硕士，助理研究员，研究方向：小麦杂种优势利用；E-mail:通讯作者：张鑫，男，硕士，副研究员，研究方向：草业科学；E-mail:盐、碱胁迫下高丹草苗期生理特征及转录组学分析孔德真1 段震宇1 王刚1 张鑫1 席琳乔2（1.新疆农垦科学院作物研究所 谷物品质与遗传改良兵团重点实验室，石河子 832000；2.塔里木大学 新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，阿拉尔 843300）摘 要：高丹草（Sorghum bicolor S.sudanense hybrids）具有抗旱和耐盐碱特性，逐渐成为畜牧业重要的饲料作物，明确高丹草耐盐、耐碱分子调控机制对高丹草分子辅助育种具有重要意义。本文对高丹草种子进行不同浓度的 NaCl 和 Na2CO3胁迫，统计不同浓度下发芽率变化；高丹草幼苗进行200 mmol/L的NaCl和Na2CO3胁迫处理，不同时间段对整株幼苗可溶性糖、脯氨酸（PRO）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和总超氧化物歧化酶（T-SOD）生理指标测定和转录组学表达分析。结果表明，相同浓度中性盐（NaCl）胁迫高丹草种子发芽率、根长均大于碱性盐（Na2CO3）胁迫。随着胁迫时间延长，POD 和 CAT 在中性盐胁迫时表现出逐渐下降趋势，碱性盐胁迫时呈逐渐增加趋势；PRO、可溶性糖和 T-SOD 在中性盐胁迫表现出逐渐增大趋势，碱性盐胁迫时表现出逐渐减小趋势。转录组学分析发现，在中性盐胁迫 6、12 和 24 h 后，分别鉴定出 241 个、293 个和 149 个 DEG，碱性盐胁迫后，分别鉴定出 664 个、641 个和 728 个 DEG。GO 和 KEGG 聚类分析显示，盐和碱胁迫处理下参与氧化还原酶合成、渗透胁迫、细胞膜组分、细胞氧化解毒等相关 DEG 在高丹草苗期生长过程中应对盐碱胁迫响应发挥关键性作用，DEG 主要集中在激素信号转导、光合代谢、氧化还原、糖代谢、核酸修复、苯丙烷生物合成等过程与非生物胁迫或逆境相关。盐碱胁迫条件下，高丹草幼苗应对环境刺激通过激素信号转导和氧化还原酶解毒。糖代谢和还原酶合成转运在耐盐碱品种中起到了重要作用。关键词：高丹草；盐碱胁迫；转录组；生理特性DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.2022-0758Physiological Characteristics and Transcriptome Analysis of Sorghum bicolor S.Sudanense Seedlings Under Salt-alkali Stress KONG De-zhen1 DUAN Zhen-yu1 WANG Gang1 ZHANG Xin1 XI Lin-qiao2（1.Institute of Crop Research,Xinjiang Academy of Agri-Reclamation Sciences,Key Lab of Xinjiang Production and Construction Corps for Cereal Quality Research and Genetic Improvement,Shihezi 832000;2.Tarim University,Husbandry Science and Technology Key Laboratory of Production and Construction Corps of Tarim in Xinjiang,Alar 843300）Abstract:Sorghum bicolor S.sudanense has the characteristics of drought resistance and salt-alkali tolerance,and has gradually become an important feed crop in animal husbandry.It is of great significance to clarify the molecular regulation mechanism of salt-tolerant and alkali-tolerant grass for molecular-assisted breeding.In this paper,the seeds of S.bicolor S.sudanense were treated with different concentration of NaCl and Na2CO3 stress,and the germination rates of the seeds were analyzed under different concentrations.The seedlings were treated with 200 mmol/L NaCl and Na2CO3 stress.The physiological indexes of soluble sugar,proline（PRO）,catalase（CAT）,peroxidase（POD）and total superoxide dismutase（T-SOD）were determined and transcriptome expression was analyzed in different time periods.The results showed that the germination rate and root length of S.bicolor S.sudanense under the same concentration of neutral salt stress were higher than those under alkaline salt stress.With the time prolonging,POD and CAT showed a gradually decreasing trend under neutral salt stress,but gradually increasing trend under alkaline salt stress.PRO,soluble sugar and T-SOD increased gradually under neutral salt stress,but decreased 生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.6200土壤盐碱化是影响植物正常生长的主要因素之一，伴随全球气候变暖，我国干旱、半干旱地区土壤盐碱化逐渐加重，影响我国农业和畜牧业发展。盐碱土主要有中性盐和碱性盐两种类型1。常见中性盐有 NaCl 和 Na2SO4，碱性盐包括 Na2CO3和NaHCO32。盐碱可使植物产生渗透胁迫、离子危害和营养亏缺，影响植物正常生长发育和形态建成、光合作用，并产生次生伤害，造成物质代谢紊乱及过氧化物积累，严重影响了作物的产量及品质3-4。高丹草（Sorghum bicolorS.sudanense）为高粱（S.bicolor）与苏丹草（S.sudanense）的杂交种，具有高粱茎粗、叶宽、产量高的特点5-6。高丹草在土壤干旱7和盐碱8逆境方面也表现出较强的优势，作为畜牧饲料具有分蘖力和再生力强、适口性好等优点9，目前作为我国畜牧业发展饲料的首选之一。因此，研究高丹草耐盐碱基因及其功能以及作用机制，对高丹草的适应性改良和抗盐碱品种的培育具有重要意义。关于高丹草幼苗在不同中性盐和碱性盐混合条件下的生长变化已进行了研究，盐浓度对高丹草种子萌发影响较大。而高 pH 胁迫则主要影响其幼苗生长10。高立杰等11对高丹草种子发芽耐盐碱方面进行了研究，在盐分和温度共同作用下，随着不同中性盐浓度的提高，对种子发芽的抑制力逐渐增强，在 35下可以提高种子的发芽率。随着高通量测序技术的发展，转录组测序在牧草种质资源评价、重要性状形成机制以及优异基因资源挖掘、分子标记开发等方面已有较广泛的应用12。Ma 等13首次对 50 mmol/L NaCl 胁迫处理下的多浆旱生植物霸王（Zygophyllum xanthoxylum）进行转录组测序，成功鉴定出了霸王响应盐胁迫的关键基因，为干旱地区重要栽培牧草和作物品种抗逆性的遗传改良提供了丰富的遗传资源。目前关于高丹草对盐碱胁迫响应研究主要集中在单一中性盐和碱性盐及混合胁迫对种子萌发和幼苗生长的生理响应研究，对于高丹草在单一中性盐和碱性盐在生理调控方面的研究较少。本研究通过不同浓度盐碱筛选高丹草种子萌发及生长最适浓度，初步筛选得到高丹草幼苗在 2 种盐胁迫下的应激反应浓度，分别在 4 个时间点取样，利用 RNA-seq 进行转录组测序，结合数据分析及归纳，进而揭示高丹草的耐盐机制，解析高丹草在幼苗期抗盐机制，为培育高丹草抗盐品种提供理论依据和基因资源。1 材料与方法1.1 材料以普通高丹草（Sorghum bicolorS.sudanense）SX-19 为研究对象，由新疆农垦科学院畜牧研究所提供，用于模拟盐碱胁迫条件中性盐和碱性盐为分析纯 NaCl 和 Na2CO3。1.2 方法1.2.1 不同处理下种子发芽率统计 试验于 2021 年在新疆农垦科学院谷物品质与遗传改良兵团重点实验室进行。种子发芽挑选大小均一、成熟饱满的种子，采用次氯酸钠消毒处理，均匀播种于含有两层滤纸的 9 cm 培养皿中萌发，分别用灭菌 ddH2O 和浓 度 为 50、100、200、300、400、500 mmol/L 的NaCl 和 Na2CO3处理，设置 3 个生物学重复，在温度 23、光照强度 400 kcmol/（m2 s）、光周期 12 h/8 h（光/暗），相对湿度 75的人工气候箱中培养 7 d统计发芽率和根长。1.2.2 幼苗培养及盐碱处理 选取籽粒饱满的种子，清水浸泡 8-10 h，种子吸胀后放入 25恒温培养箱中催芽，待胚根长出后放入双层滤纸的培养盒（40 gradually under alkaline salt stress.Transcriptome analysis showed that 241,293 and 149 DEGs were identified after 6,12 and 24 h of neutral salt stress,and 664,641 and 728 DEGs were identified under alkaline salt stress.GO and KEGG cluster analysis revealed that DEGs involved in oxidative reductase synthesis,osmotic stress,cell membrane composition,cell oxidation and detoxification played a key role in the responses to salt-alkali stress the grass in the seedling.DEG mainly focused on hormone signal transduction,photosynthetic metabolism,redox,glucose metabolism,nucleic acid repair,phenylpropane biosynthesis and other processes related to abiotic stress or stress.Under saline-alkali stress,the grass seedlings responded to environmental stimuli through hormone signal transduction and oxidoreductase detoxification.Glucose metabolism and reductase synthesis and transport play an important role in salt-tolerant varieties.Keywords:Sorghum bicolor S.sudanense;salt-alkali stress;transcriptome;physiological characteristics2023,39(6)201孔德真等：盐、碱胁迫下高丹草苗期生理特征及转录组学分析cm 15 cm 10 cm）中，按照发芽试验进行培养，培育期间每日更换 1 次清水，连续培养 25 d，待植株长至 40 cm，选择苗情长势一致的幼苗放入更换滤纸的培养盒中，采用 ddH2O 和 200 mmol/L 的 NaCl和 Na2CO3处理，分别在 0、6、12、24 h 时，每个时间段取样 5 株，经液氮速冻，置于-80保存备用，测定生理指标和转录组分析。1.2.3 生理指标的测定 取出已经保存备用的幼苗为试验材料，总超氧化物歧化酶（T-SOD）测定方法采用氮蓝四唑14；过氧化物酶（POD）的测定方法采用愈创木酚法14；过氧化氢酶（CAT）的测定方法采用紫外比色法15；脯氨酸（PRO）测定方法采用磺基水杨酸法16；可溶性糖测定方法采用蒽酮比色法17。1.2.4 文库的构建及转录组测序 样品 RNA 由北京康普森生物有限公司制备。RNA 样品通过质量检测进入 Illumina HiSeq 2000 平台进行转录组测序。下机所得的原始数据（raw data）经过过滤得到纯净的数据（clear data），纯净数据在于高粱的基因组高粱基 因 组（ftp:/ftp.jgi-psf.org/pub/compgen/phyt ozome/v9.0/early_release/Sbicolor_v2.1/）进行比对得到比对数据（mapped data）。1.2.5 数据处理与分析 利用 clusterProfiler R18软件实现 DEGs 的 GO 和 KEGG 集分析，P 小于 0.05为显著性富集的阈值。利用 SPSS19.0 软件对不同盐碱浓度下种子发芽率、总超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、脯氨酸、可溶性糖进行方差分析、多重比较。2 结果2.1 不同盐碱浓度对高丹草种子发芽的影响随着盐碱浓度增加，种子发芽率和根长表现出逐渐减小的趋势，碱性盐胁迫下高丹草的发芽率均小于中性盐胁迫，在 200 mmol/L 时，高丹草种子发芽率变化最大（图 1-A），说明该浓度是影响高丹草发芽率的阈值浓度。碱性盐对高丹草种子发芽后根的生长速度影响大于中性盐，随着盐碱浓度的增大，高丹草种子的芽长逐渐变短，当盐碱浓度大于 200 mmol/L 时，种子表面已经变黑，逐渐失去活力（图1-B）。因此，为了确定研究高丹草幼苗生理代谢变化的适宜浓度，选用 200 mmol/L 盐碱浓度进行胁迫处理，以便了解高丹草幼苗生理代谢变化。A02040608010050100200300400500发芽率Germination rate/%盐浓度 Salt concentration/(mmolL-1)CK(Water)NaClNa2CO3B图 1 不同盐碱浓度对高丹草发芽率（A）和表型（B）的影响Fig.1 Effects of different saline and alkali concentrations on germination rates（A）and phenotypes（B）of Sorghum bicolor S.sudanense2.2 盐碱胁迫不同时间段高丹草幼苗生理代谢 变化在盐碱胁迫不同时间段，高丹草抗逆生理代谢物发生了不同变化。如图 2-A 所示，随着胁迫时间延长，中性盐（NaCl）胁迫高丹草脯氨酸含量表现出逐渐增多的趋势，在 24 h 时达到最大，碱性盐（Na2CO3）胁迫高丹草脯氨酸含量表现出逐渐减少的趋势，在 24 h 时达到最小，在不同处理时间下，碱性盐胁迫高丹草脯氨酸含量高于中性盐胁迫，碱性盐处理脯氨酸含量下降速率大于中性盐，表明碱性盐对高丹草胁迫大于中性盐胁迫。如图 2-B 所示，随着胁迫处理时间延长，中性盐（NaCl）胁迫下高丹草过氧化物酶含量表现出先增大后减小的趋势，在 6 h 时达到最大，碱性盐（Na2CO3）胁迫下高丹草过氧化物酶含量表现出先增大后减小的趋势，在12 h 时达到最大，在两种不同盐胁迫下，过氧化物酶含量表现出相反趋势。如图 2-C 所示，随着胁迫时间延长，中性盐（NaCl）胁迫下高丹草过氧化氢生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.6202酶含量表现出逐渐减小的趋势，在 0 h 时最大，碱性盐（Na2CO3）胁迫下高丹草过氧化氢酶含量表现出逐渐增大的趋势，在 24 h 时达到最大，在两种不同胁迫条件下，中性盐胁迫含量大于碱性盐胁迫。如图 2-D 所示，随着胁迫时间的延长，中性盐（NaCl）胁迫下高丹草可溶性糖量表现出增大趋势，但是变化率较小，在 12 h 时最大，碱性盐（Na2CO3）胁迫下高丹草可溶性糖含量表现出逐渐减少的趋势，在0 h 和 6 h 时最大，在两种不同胁迫条件下，可溶性糖在碱胁迫时含量大于盐胁迫。如图 2-E 所示，随着胁迫时间延长，中性盐（NaCl）胁迫下高丹草总过氧化物歧化酶（T-SOD）含量较 0 h 变化不大，碱性盐（Na2CO3）胁迫下总过氧化物歧化酶含量表现出逐渐减小趋势，在 0 h 时最大，两种不同盐胁迫时，总过氧化物歧化酶在碱性盐胁迫时含量大于中性盐，说明碱性盐胁迫对植物伤害大于中性盐。0.000.501.001.50NaClNa2CO3POD活性POD activity/(Unitsg-1 FWmin)Baaabbaabba020406080NaClNa2CO3可溶性糖含量Soluble sugar content/(mgg-1 FW)Daaaaaaab02004006008001000NaClNa2CO3T-SOD 活性T-SOD activity/(Unitsg-1FWmin)Eaaaaaaab020406080100NaClNa2CO3脯氨酸含量Proline content/(gg-1FW)Aabacbdaaab00.20.40.60.81NaClNa2CO3CAT活性CAT activity/(mgg-1 FWmin)abCcdaabb不同字母表示在 0.05 水平上差异显著Different letters mean significant difference at 0.05 level图 2 不同盐碱浓度对高丹草生理特性的影响Fig.2 Effects of different saline and alkali concentrations on the physiological characteristics of Sorghum bicolorS.sudanense2.3 不同处理时间段差异表达基因分析利用 RNA-seq 技术，高丹草在相同盐碱浓度胁迫下不同时间段转录组测序，将中性盐胁迫前后不同时间段高丹草命名为：NaCl-6 vs Ck-6、NaCl-12 vs Ck-12、NaCl-24 vs Ck-24，碱性盐胁迫：Na2CO3-6 vs CK-6、Na2CO3-12 vs CK-12、Na2CO3-24 vs CK-24，结果如图 3 所示，中性盐胁迫 3 个不同时间段分别鉴定到不同的 DEG：NaCl-6 vs Ck-6 有 214 个（上调135 个、下调 79 个），NaCl-12 vs Ck-12 有 293 个（上调186个、下调107个），NaCl-24 vs Ck-24有149个（上调 84 个、下调 65 个）；Na2CO3-6 vs CK-6 有 664 个（上调 438 个、下调 226 个），Na2CO3-12 vs CK-12 有641 个（上调 433 个、下调 208 个），Na2CO3-24 vs CK-24 有 728 个（上调 506 个、下调 222 个），表明碱性盐胁迫下差异基因数量多于中性盐胁迫，说明碱性盐对植物的伤害大于中性盐。2.4 DEG功能富集分析通过对不同处理组鉴定到的 DEG 进行 GO 富集分析。GO 富集分析主要分为生物学过程、细胞组分和分子功能 3 个亚类，对盐碱胁迫抗逆方面的 DEG主要富集在氧化还原酶 CH-NH 为供体、氧化还原酶金属离子、氧化还原酶、氧化还原 NADPH 为供体酶的分子氧化还原功能；渗透胁迫反应、水分亏缺反应、过氧化氢反应、细胞氧化解毒反应等生物学过程；质膜组成部分、质膜和膜组成部分细胞组分相应（图 4）。在 Na2CO3-24 vs ck-24 和 Na2CO3-6 vs ck-6 处理时，分子功能、细胞组分、生物学过程的3 个亚类：氧化还原酶金属离子、膜组成部分、细2023,39(6)203孔德真等：盐、碱胁迫下高丹草苗期生理特征及转录组学分析胞氧化解毒在胁迫过程中表现最高。2.5 KEGG通路分析 KEGG 是系统分析基因产物在细胞中的代谢途径、基因功能及基因组信息的数据库。对 DEGs 进行 KEGG 通路分类注释，并对各组出现的 DEGs 富集可信度（根据 P 值）较高的前 10 个通路进行了比较分析。图 5 表明，在相同碱性盐和中性盐胁迫的不同时间段，基因上调代谢通路主要有植物激素信号转导、植物-病原互作、糖代谢、油酸脂类代谢、内质网蛋白、植物激素信号途径、光合作用代谢、丙酮酸代谢、氨基酸互作代谢、自噬-其他等 10 个主要代谢途径差异表达基因富集程度较高，相关基因表现出上调，表明在相同浓度中性盐和碱性盐胁迫时，在同一代谢途径下植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢和亚麻酸代谢基因表现出高富集上调表达，可能这些代谢途径基因的富集表达是为了植物生长适应高浓度碱性盐胁迫。在相同碱性盐和中性盐胁迫时，基因下调代谢通路主要有光合作用碳循环、磷酸戊糖代谢、脂肪酸合成、核糖体、氨基酸代谢、生物碱合成、淀粉糖代谢、DNA 复制、核酸修复、光合作用相关蛋白、类苯丙烷生物合成、叶1351868443843350679107652262082220100200300400500600NaCl-6 vs CK-6NaCl-12 vs CK-12NaCl-24 vs CK-24Na2CO3-12 vs CK-12Na2CO3-24 vs CK-24Number of DEGs Up-regulated Down-regulatedNa2CO3-6 vs CK-6图 3 不同盐碱处理的 DEG 统计Fig.3 DEG statistics under different saline and alkali treatments0100200300400500600细胞氧化解毒Cellular oxidant detoxification过氧化氢反应Response to hydrogen peroxide水分匮缺反应Response to water deprivation渗透胁迫反应Response to osmotic stress膜组成部分Integral component of membrane质膜Plasma membrane质膜组成部分Integral component of plasma membrane氧化还原NADPH为供体酶Oxidoreductase activity,NAD(P)H donor氧化还原酶Oxidoreductase activity氧化还原酶金属离子Oxidoreductase activity,oxidizing metal ions氧化还原酶CH-NH为供体Oxidoreductase activity,CH-NH donorsDEG的数目Number of DEGsNa2CO3-24 vs CK-24Na2CO3-12 vs CK-12Na2CO3-6 vs CK-6Nacl-24 vs CK-24Nacl-12 vs CK-12Nacl-6 vs CK-6分子功能Molecular functionCellular component生物学过程细胞组分Biological process图 4 差异基因 GO 分析Fig.4 GO analyses of differentially expressed genes生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.6204绿素代谢等 12 个主要代谢途径差异表达基因富集程度较高，相关基因表现出下调，说明在相同盐碱浓度胁迫下，不同时间段 DNA 复制、淀粉和蔗糖代谢部分基因在不同时间段表现出高的富集下调，说明这些途径基因下调是为了保证植物其他代谢途径正常，从而维持植物在盐碱胁迫下正常生长。0102030405060708090100光合作用 Photosynthesis 光合作用-天线蛋白 Photosynthesis-antenna proteins类苯丙烷生物合成 Phenylpropanoid biosynthesis 乙二酸盐 Glyoxylate and dicarboxylate metabolism 叶绿素代谢 Chlorophyll metabolism 错配修复 Mismatch repair 剪切修复 Base excision repair 类黄酮合成 Flavonoid biosynthesis DNA复制 DNA replication 氨基酸代谢 Glycine,serine and threonine metabolism 角质蜡纸生物合成 Cutin,suberine and wax biosynthesis 激素信号转导 Plant hormone signal transduction 淀粉蔗糖代谢 Starch and sucrose metabolism 酪氨酸代谢 Tyrosine metabolism 生物碱合成 Isoquinoline alkaloid biosynthesis 苯丙氨酸代谢 Phenylalanine metabolism 核糖体 Ribosome 脂肪酸生物合成 Fatty acid biosynthesis 磷酸戊糖生物合成 Pentose phosphate pathway 基因数目 Mumber of genesNa2CO324 vs NaCl-24Na2CO3-12 vs NaCl-12Na2CO3-6 vs NaCl-60102030405060708090100植物激素信号转导Plant hormone signal transduction植物-病原互作Plant-pathogen interaction淀粉和蔗糖代谢Starch and sucrose metabolism亚油酸新城代谢Linoleic acid metabolism内质网中蛋白质加工Protein processing in endoplasmic reticulum亚麻酸代谢Alpha-Linolenic acid metabolism甘油磷脂代谢Glycerophospholipid metabolismcAMP信号途径cAMP signaling pathwayMAPK信号途径MAPK signaling pathway醚酯类代谢Ether lipid metabolism光合作用-天线蛋白Photosynthesis-antenna proteins半乳糖代谢Galactose metabolism吩嗪合成Phenazine biosynthesis生物膜形成Biofilm formation-Pseudomonas aeruginosa谷胱甘肽代谢Glutathione metabolism半胱氨酸和蛋氨酸代谢Cysteine and methionine metabolism果糖甘露糖代谢Fructose and mannose metabolism氨基酸降解Valine,leucine and isoleucine degradation脂肪酸降解Fatty acid degradation丙酮酸代谢Pyruvate metabolism丙酸代谢Propanoate metabolism自噬,其他Autophagy-other基因数目 Mumber of genesNa2CO324 vs NaCl-24Na2CO3-12 vs NaCl-12Na2CO3-6 vs NaCl-6ABA：上调基因；B：下调基因A:Up gene.B:Down gene图 5 KEGG 富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis3 讨论植物在进化过程中形成了不同的非生物胁迫响应机制，盐和碱作为植物生长过程中主要的非生物胁迫，在受到盐和碱胁迫时具有不同的分子机制。植物在受到盐碱胁迫时会通过调节体内生理生化过程来适应环境19。渗透胁迫和粒子毒害是影响植物正常生长的主要因素，而碱性盐胁迫是由于改变了植物生长的 pH 值环境，降低了植物对营养元素和2023,39(6)205孔德真等：盐、碱胁迫下高丹草苗期生理特征及转录组学分析离子的吸收特别是可溶性铁的吸收，增大了渗透胁迫的危害20-22，而渗透调节物质是植物遭受渗透胁迫时具有维持细胞渗透压平稳、保护细胞相关结构等功能的物质23。有多种植物在苗期受中性盐和碱性盐胁迫而引起代谢途径差异基因的变化。在本研究中，通过差异基因分析发现，氧化还原酶金属离子和膜组成成分相关基因在碱性盐胁迫时表达量均大于中性盐胁迫，说明在进行碱性盐胁迫时，细胞膜受到渗透胁迫的危害较大，为了使细胞膜正常工作，细胞膜修复相关基因和氧化还原基因表达量较高。植物激素在耐盐碱胁迫过程中发挥着重要的作用，本研究中植物激素信号转导和糖代谢途径相关基因在碱性盐胁迫时较中性盐差异较大，与扎桑等24对青稞进行盐碱胁迫后转录组功能富集发现“植物激素信号转导”途径基因表达量较高，表明它们可能与青稞的盐碱抗性有关的结果相一致，说明植物在受到碱性盐胁迫导致 pH 值环境发生变化，多种植物激素相互作用调控其糖代谢相关基因的过量表达，抵抗碱胁迫带来的危害，因此碱性盐胁迫导致了这两个代谢途径基因之间的差异性。盐碱胁迫引起植物细胞产生大量的活性氧，活性氧主要有超氧阴离子自由基（O2-）、羟自由基（OH）和过氧化氢（H2O2），活性氧对植物体内细胞结构如蛋白质、脂质和核酸的氧化损伤，破坏细胞的完整性25。为了维持植物的正常生长，植物自身会启动由 SOD、POD 和 CAT 等组成的抗氧化酶促系统，来维持植株的正常生理功能26。植物体内SOD、POD 和 CAT 含量反应了植物细胞受到胁迫的严重度，在本研究中，POD 和 CAT 在盐胁迫中随着时间的延长含量逐渐表现出下降的趋势，碱胁迫对高丹草伤害表现出逐渐增加的趋势；可能在盐胁迫初期，盐对高丹草伤害较小，在 0 h 时，由于刚开始受到胁迫影响，植物体内清除活性物质的酶含量较高，随着时间的推移，酶的含量逐渐上升；在碱胁迫时，由于碱对植物伤害较大，随着时间推移，植物体内活性氧物质含量增多，相应清除酶数量逐渐增多，在达到一定程度后逐渐下降，说明植物体细胞受到一定程度伤害后，导致植物细胞自生活性下降，无法产生更多相应的活性酶，表现出下降趋势。徐微风等27研究表明，小于 60%浓度的海水处理使冰菜 SOD、POD 活性随处理时间增加而上升，但大于 60%浓度的海水使冰菜体内 SOD、POD 活性减弱，与本研究结果相一致，说明植物对盐碱胁迫相应有一定的极限值反应度。可溶性糖是高等植物光合作用的主要产物之一，不仅能够为植物体提供能源，还能作为渗透调节物质及信号分子对植物体内相关代谢过程进行调节，对植物生长、发育、抗逆等方面有重要意义28。植物受到盐碱胁迫后，体内糖代谢途径会提高可溶性糖含量，调节渗透压，维持细胞正常功能。宋士伟等29在转录层面发现蔗糖合成途径中蔗糖合酶（SuS）编码基因上调表达。这与本研究 KEGG 代谢途径和差异基因 GO 富集分析研究过程中发现，在受到胁迫后淀粉和蔗糖代谢、甘露糖代谢、半乳糖代谢表现上调结果相一致，光合作用相关蛋白、DNA 复制、DNA 剪切修复等相关途径表现出下调；在 Na2CO3-24 vs CK-24 和 Na2CO3-6 vs CK-6 这两个时期分子功能氧化还原金属离子相关基因，细胞组分膜组成部分相关基因，生物学过程细胞氧化解毒相关基因均表现出较高的表达水平，说明植物在受到胁迫的初期和后期基因代谢水平的变化大于中期。4 结论碱性盐胁迫对高丹草发芽及生长影响较大，随着胁迫时间的延长，POD、CAT、PRO、可溶性糖和 T-SOD 含量均表现出不同的增长趋势，中性盐胁迫差异表达基因数量减少，碱性盐数量增多，代谢途径分析筛选出糖代谢和还原酶合成转运相关基因，为高丹草耐盐碱品种选育和种质资源鉴定提供依据。参 考 文 献 1武玉芬.小麦耐盐碱性评价与分子标记研究D.石家庄:河北科技大学,2011.Wu YF.Assessment and molecular markers of saline-alkali tolerance in wheatsD.Shijiazhuang:Hebei University of Science and Technology,2011.2金微微,张会慧,滕志远,等.盐碱互作胁迫对高丹草叶片叶绿素荧光参数的影响J.草业科学,2017,34（10）:2090-2098.Jin WW,Zhang HH,Teng ZY,et al.Effects of salt and alkali 生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.6206interaction stress on chlorophyll fluorescence in leaves of Sorghum bicolor S.sudanenseJ.Pratacultural Sci,2017,34（10）:2090-2098.3Parihar P,Singh S,Singh R,et al.Effect of salinity stress on plants and its tolerance strategies:a reviewJ.Environ Sci Pollut Res,2015,22（6）:4056-4075.4Acosta-Motos J,Ortuo M,Bernal-Vicente A,et al.Plant responses to salt stress:adaptive mechanismsJ.Agronomy,2017,7（1）:18.5温莹,逯晓萍,任锐,等.高丹草 EST-SSR 标记的开发及其遗传多样性J.遗传,2013,35（2）:225-232.Wen Y,Lu XP,Ren R,et al.Development of EST-SSR marker and genetic diversity analysis in Sorghum bicolor Sorghum sudanenesJ.Hereditas,2013,35（2）:225-232.6李源,游永亮,赵海明,等.种植密度对高丹草农艺性状及饲用品质的影响J.草业科学,2017,34（8）:1686-1693.Li Y,You YL,Zhao HM,et al.Effec