小鼠寒证、热证模型建立的方法初探_张海凤.pdf

目的 初步探讨建立小鼠寒证、热证模型的评价指标。方法 选择 60只 68周龄的 C57BL/6雄性小鼠，按随机数字表法分为正常组、热证组、寒证组，每组20只。造模期间正常组按体质量10 mL/（kg d）灌胃生理盐水，连续灌胃 4周；热证组第 1周按体质量 10 mL/（kg d）灌胃 20%乙醇溶液，第 2、3、4周分别按体质量10、15、20 mL/（kg d）灌胃乙醇辣椒素混合液；寒证组第1周按体质量10 mL/（kg d）灌胃冰水混合液，第2、3、4周分别按体质量10、15、20 mL/（kg d）灌胃冰水混合液后在冰上行走10 min。造模后比较3组小鼠体质量、饮食量、饮水量、肛温、体征评分、三磷酸腺苷（ATP）酶、琥珀酸脱氢（SDH）酶含量。结果 与正常组比较，寒证组饮食量、体质量均明显升高（P均0.05），饮水量、肛温、体征评分、ATP酶、SDH酶含量均降低（P均0.05）；热证组饮食量、体质量均明显降低（P均0.05），饮水量、肛温、体征评分、ATP酶、SDH酶含量均升高（P均0.05）；与寒证组比较，热证组饮食量、体质量均明显降低（P均0.01），肛温升高、饮水量、体征评分、ATP酶、SDH酶含量均明显升高（P均0.01）。结论 采用乙醇辣椒素混合液灌胃小鼠可一定程度上建立小鼠热证模型，采用冰水混合液灌胃小鼠并配合在冰上行走可一定程度上建立小鼠寒证模型。关键词：小鼠热证模型；小鼠寒证模型；ATP酶；SDH酶中医理论中，寒热是两个相反的概念，属于八纲辨证之一，在中医临床诊断和治疗方面具有重要意义1。证候模型是研究疾病发生、发展和预后的重要工具，现有证候动物模型文献多针对单一证型研究，然而寒证、热证动物模型同时研究，相互对比，才能更好地阐明其证候特点。因大鼠观察更方便，目前多采用大鼠制备寒证、热证模型2-3。但对于某些特定疾病，小鼠模型更具优势，且其造模方便，价格低廉，随着研究领域不断扩大加深，小鼠的证候模型必将成为趋势。因此，本研究选取寒证、热证病因因素施加于小鼠，建立体征稳定、指标客观的小鼠寒证、热证模型，并进行中医证型探讨，以期为今后小鼠寒证、热证模型的建立提供依据和参考。1实验材料1.1实验动物SPF级C57BL/6小鼠，60只，雄性，68周龄，体质量（202）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK（沪）2017-0005，饲养在福建中医药大学实验动物中心SPF级动物实验室，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2019-0007。以上小鼠在 12 h明暗交替、温度 2127、湿度 45%55%的环境中，自由进食饮水，适应性饲养1周后进行实验。1.2实验药物与试剂辣椒素（上海麦克林生化科技有限公司，批号：G2102274，纯度：97%）；无水乙醇（西陇科学股份有限公司，批号：2203179）；生理盐水（青州尧王制药有限公司，批号：2121040401）；BCA 蛋白质定量试剂盒（批号：20210811）、三磷酸腺苷（ATP）酶含量测定试剂盒（批号：20210821）、琥珀酸脱氢酶（SDH）试剂盒（批号：20210927）均购自南京建成生物工程研究所。1.3实验仪器精密电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司，型号：5810R）；数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司，型号：HH-4）；低温高速离心机（德国 Eppendorf 公司，型号：Centrifuge5418）；多功能酶标仪（美国 TECAN 公司，型号：Nfinite M200 Pro）；电子体温计（深圳市米乐仪器有限公司）。2实验方法2.1灌胃药物配制 20%乙醇溶液：取 10 mL无水乙醇，加纯水定容至 50 mL而成；乙醇辣椒素混合液：精密称定辣椒素0.01 g，溶于10 mL无水乙醇，加纯水定容至50 mL而成；冰水混合液：称取20 g冰块，加入10 g纯水，混匀而成。2.2模型制备将60只SPF级C57BL/6雄性小鼠，按随机数字表法分为正常组、热证组、寒证组，每组20只，适应性饲养1周后灌胃给药。正常组按体质量 10 mL/（kg d）灌胃生理盐水，连续灌胃 4 周；热证组第1周按体质量10 mL/（kg d）灌胃20%乙醇溶液，第2、3、4周分别按体质量10、15、20 mL/（kg d）灌胃乙醇辣椒素混合液；寒证组第 1 周按体质量10 mL/（kg d）灌胃冰水混合液，第2、3、4周分别按体质量 10、15、20 mL/（kg d）灌胃冰水混合液后在冰上行走10 min。2.3取材造模结束后隔日取材，取材前 12 h 小鼠禁食不禁水，处死后取小鼠肝脏，生理盐水漂洗后用滤纸吸干水分，迅速转移到液氮中冷却，后转至-80 冰箱保存。2.4指标检测及方法2.4.1小鼠体征评分评定依据 实用中医证候动物模型学4和 辨证论治实验方法学：实验小鼠诊收稿日期：2022-12-12基金项目：福建省财政资助专项（X2018001）通信作者：吴水生，E-mail：DOI：10.13260/ki.jfjtcm.2023.0401342张海凤 等：小鼠寒证、热证模型建立的方法初探第 4 期法与辨证5中“寒证、热证小鼠体征评分标准”（见表1），干预后当天对小鼠爪甲、唇色、粪便性状、耳缘静脉和性情活动的状态进行评分，表1中各项指标评分相加即得体征评分（R）。当R6分时，为热证模型；3分R6分时，为寒证模型；R3分时，为正常模型。2.4.2小鼠体质量、饮水量、饮食量、肛温测定造模期间每周第 7 天记录小鼠体质量、饮水量、饮食量，取材前1 d用电子体温计测量小鼠肛温并记录。2.4.3小鼠肝脏组织ATP酶、SDH酶含量检测取冻存的小鼠肝脏组织，研磨成组织匀浆后，按相关试剂盒说明书进行ATP酶、SDH酶含量检测。2.5统计学方法采用SPSS 24.0软件进行数据分析。计量资料符合正态分布的以（x s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐时采用LSD-t 法，方差不齐时采用 Games-Howell 法。P0.05表示差异有统计学意义。3结果3.13组小鼠体征评分及肛温比较见表2。3.23组小鼠体质量、饮水量、饮食量比较见表3表5。3.33组小鼠ATP酶、SDH酶含量比较见表6。4结论目前中医证型模型造模方法主要包括中药造模、化学造模和物理化学造模6。根据现代生活中寒证人群多为嗜食寒凉、贪凉懒动导致机体温煦作用下降，出现寒性一系列症状7-9。热证人群多为嗜食膏粱厚味、辛辣刺激导致机体凉润功能下降，出现一系列热性症状7-9。故本实验参考李慧璇7、罗培灿8制备寒证、热证大鼠模型的造模方法，选择用冷水加冰上行走模拟现代人寒凉饮食和环境的病因造模，用酒精加辣椒素模拟现代人嗜食辛辣的饮食习惯进行病因造模。此造模方法简便易行且在很大程度上符合临床相关症状人群的发病病因。由于动物不具备主观表达能力，选择合适的客观指标是中医证候模型建立过程中的重要环节7-10。参考 实用中医证候动物模型学4及 辨证论治实验方法学：实验小鼠诊法与辨证5建立寒证、热证小鼠体征评分标准表，并结合 3 组小鼠肛温、体质量、饮食量、饮水量的变化进行比较，结表1寒证、热证小鼠体征评分标准观察项目爪甲唇色粪便性状耳缘静脉性情活动0分淡粉淡红正常正常正常1分偏白淡白溏薄血络少萎靡2分偏枯红干燥血络多狂躁表23组小鼠体征评分及肛温比较（x s）组别正常组寒证组热证组n202020体征评分/分 0.500.673.600.761）8.201.401）3）肛温/35.700.7034.801.101）36.300.401）2）注：与正常组比较，1）P0.05；与寒证组比较，2）P0.05，3）P0.01。表43组小鼠饮水量变化（x s）mL 组别正常组寒证组热证组n202020第1周76.671.7173.341.8181.334.182）第2周88.005.7878.252.281）103.757.521）3）第3周105.332.4986.484.241）129.674.991）3）第4周117.502.6996.262.341）141.252.951）3）注：与正常组比较，1）P0.05；与寒证组比较，2）P0.05，3）P0.01。表53组小鼠饮食量变化（x s）g 组别正常组寒证组热证组n202020第1周130.134.81136.539.01127.204.492）第2周135.902.42142.506.91120.306.501）3）第3周138.402.21158.602.041）126.131.071）3）第4周145.500.99162.001.381）128.200.691）3）注：与正常组比较，1）P0.05；与寒证组比较，2）P0.05，3）P0.01。表33组小鼠体质量变化（x s）g 组别正常组寒证组热证组n202020第1周22.411.1222.661.7522.531.67第2周22.691.9723.640.2622.510.582）第3周23.240.8424.011.671）22.661.871）2）第4周23.250.7324.441.241）22.971.141）3）注：与正常组比较，1）P0.05；与寒证组比较，2）P0.05，3）P0.01。表63组小鼠ATP酶、SDH酶含量比较（x s）mol/g 组别正常组寒证组热证组n202020ATP酶371.0026.30366.0034.701）384.0035.421）2）SDH酶295.7019.30274.1022.601）362.3037.701）2）注：与正常组比较，1）P0.05；与寒证组比较，2）P0.01。43福建中医药第 54 卷果显示：与正常组比较，寒证组小鼠体征评分升高，肛温降低，第 3周开始饮食量、体质量升高，第 2周开始饮水量降低；与正常组比较，热证组小鼠体征评分升高，肛温升高，第2周开始饮食量、体质量降低，饮水量升高，与已有研究的大鼠寒证、热证模型结果相符合7-9。这表明采用本实验方法制备小鼠寒证、热证模型符合寒证、热证的证候特征，模型建立成功。人和小鼠之间存在种属差异，单纯从体征评价寒证、热证模型的成功与否存在局限性。机体能量代谢是判定中医寒、热证型中的一个重要指标。ATP酶是人体代谢循环中重要的酶，是生物体内能量转换最基本的载体，其水平变化能反映机体内代谢水平的变化11。SDH酶活力直接影响到线粒体氧化磷酸化的过程，其活力增高意味着细胞能量代谢增强12。两者都参与机体普遍存在的代谢途径三羧酸循环，三羧酸循环是机体将糖或其他物质氧化而获得能量的最有效方式，也是糖、脂质、氨基酸代谢相互联络与转化的枢纽。ATP酶、SDH酶含量变化能够反映出机体能量代谢的强弱，寒证机体能量代谢减慢，热证机体能量代谢增强。有研究表明 ATP 酶、SDH 酶含量变化可以作为寒证、热证模型的评价指标12-14。本实验结果表明：热证组小鼠ATP酶、SDH酶含量升高，寒证组小鼠ATP酶、SDH酶含量降低，进一步佐证了本实验方法建立小鼠寒证、热证模型可行。参考文献1许筱颖.中医基础理论 M.济南：山东科学技术出版社，2019：10.2陈芳.寒、热体质大鼠代谢特征及中药调体作用的研究 D.南昌：江西中医药大学，2020：11-13.3李花，苏日古格，包泽阳，等.心力衰竭蒙医寒证热证模型的建立方法及其评价 J.内蒙古医科大学学报，2022，44（5）：462-465，470.4陈小野.实用中医证候动物模型学 M.北京：北京医科大学 中国协和医科大学联合出版社，1993：10.5方肇勤.辨证论治实验方法学：实验小鼠诊法与辨证 M.上海：上海科学技术出版社，2006：10.6李燕，隋峰，林娜.中医寒热证动物模型研究进展 J.中国中医基础医学杂志，2011，17（3）：348-350.7李慧璇，吕智豪，覃景春，等.寒证和热证动物模型的建立方法及评价 J.中药药理与临床，2020，36（1）：222-227.8罗培灿.寒、热证候大鼠大肠癌启动相关机制差异分析及中药干预 D.广州：广州中医药大学，2017：43-45.9苏发智，白晨曦，张文森，等.基于正常及寒热证模型大鼠物质能量代谢的天南星与胆南星的药性研究 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