线粒体泛素连接酶1对大鼠心...H9C2缺氧损伤的实验研究_徐方晶.pdf

3期收稿日期：2022-10-23基金项目：国家自然科学基金项目（81660045）；宁夏自然科学基金项目（2020AAC02037）；宁夏重点研发计划项目（2021BEG03115）作者简介：徐方晶（1992），男，在读硕士研究生，研究方向：缺血性心脏病。通信作者：何军（1968），女，博士，主任医师，教授，研究方向：动脉粥样硬化及相关疾病、心血管病代谢组学。文章编号：1674-6309（2023）03-0217-07论著缺血性心脏病（ischemic heart disease，IHD）是目前世界范围内导致死亡的主要原因之一，给个人和社会带来了巨大的经济负担1-2。心肌缺血时，心肌细胞线粒体有氧呼吸减弱、三磷酸腺苷（ATP）合成减少，致使心肌细胞能量供应不足，无法维持正常的生理功能，最终导致心肌细胞凋亡或坏死。心脏是富含线粒体的器官，线粒体占心肌细胞体积的 1/3，心脏收缩所需能量的 90%以上由线粒体生成和提供3。因此，线粒体结构与功能的稳态对维持正常的心脏功能十分重要。线粒体泛素连接酶 1（mitochondrial ubiquitinligase 1，Mul1）是一种线粒体外膜锚定蛋白，也被称为线粒体锚定蛋白连接酶（mitochondrial-anchored protein ligase，MAPL）或生长抑制及死亡E3连接酶（growthinhibitionanddeathE3ligase，GIDE），在心、脑、肝、肾、脾、骨骼肌、小肠、肺及外周血白细胞等组织与细胞中表达。Mul1 分子的 N 端和C 端均含有跨膜结构域，其位于 C 端的环指结构域具备 E3 连接酶活性，发挥蛋白质泛素化或类泛素化（small ubiquitin-like modifier，SUMO）修饰功能4-6，通过调控核因子 B（nuclear factor-KappaB，NF-B）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p53 蛋白和蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB/Akt）等信号分子7-10，直接或间接参与细胞生长、线粒体动力学及炎症与免疫反应。本课题组的前期研究11发现，Mul1 在急性缺血心肌组织中呈特异性高表达，由此推测Mul1 参与调控缺氧心肌的病理生理变化。本研究利用缺氧大鼠心肌细胞模型，通过对 Mul1 过表达和沉默干预，观察 Mul1 对大鼠缺氧心肌细胞存活率和结构的影响，探讨 Mul1 对缺氧心肌细胞损伤的影响。1材料与方法1.1主要材料、试剂与仪器大鼠心肌细胞 H9C2（上海中科院细胞库）；Mul1 过表达慢病毒载体 LV-Mul1 和 Mul1 敲减慢病毒载体 LV-Mul1-RNAi 及其相关空载体（上海吉凯基因公司）；HitransG P 感染增强液（上海吉凯基因公司）；RNA 提取试剂盒（天根生化公司）；线粒体泛素连接酶 1 对大鼠心肌细胞 H9C2 缺氧损伤的实验研究徐方晶1，王洁2，范玉成3，张瑜1，孙美琪1，何静1，何军2（1.宁夏医科大学临床医学院，银川750004；2.宁夏医科大学总医院，银川750004；3.宁夏医科大学附属石嘴山市第一人民医院病理科，石嘴山753600）摘要：目的观察线粒体泛素连接酶 1（mitochondrial ubiquitin ligase 1，Mul1）对心肌细胞缺氧损伤的影响。方法构建大鼠源 Mul1 基因过表达和敲减的慢病毒载体，分别转染大鼠心肌细胞 H9C2。将阴性对照组、Mul1过表达组、Mul1 过表达空载体组、Mul1 敲减组和 Mul1 敲减空载体组细胞分别进行常规培养（5%CO2、21%O2）和缺氧培养（5%CO2、94%N2、1%O2）后，利用倒置显微镜观察各组细胞形态变化，利用 CBM 智能细胞检测平台动态观察细胞存活率，透射电镜观察心肌细胞超微结构。结果与相应的各常规培养组相比，缺氧培养后各组 H9C2 细胞存活率均下降、细胞形态明显改变，细胞器受到损伤。缺氧培养后，与阴性对照组和 Mul1 过表达空载体组相比，Mul1 过表达组细胞状态差，细胞存活率下降（P 均0.05）；Mul1 敲减组与阴性对照组和Mul1 敲减空载体组相比细胞状态较好，存活率上升（P 均0.05）；电镜观察结果显示，与阴性对照组和 Mul1过表达空载体组相比，Mul1 过表达组细胞结构损伤加重，大部分线粒体嵴断裂或溶解呈空泡状、胞质内容物明显减少；Mul1 敲减组细胞结构损伤程度较阴性对照组和 Mul1 敲减空载体组减轻，大部分线粒体结构正常，偶见嵴断裂现象。结论Mul1 可加重缺氧诱导的心肌细胞结构损伤，使心肌细胞存活力下降。关键词：线粒体泛素连接酶 1；心肌细胞；缺氧；线粒体损伤中图分类号：R541.75文献标识码：ADOI：10.16050/ki.issn1674-6309.2023.03.001第 45 卷3 期2023 年 3 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University217宁夏医科大学学报45卷HiScript Q RT SuperMix for qPCR（诺唯赞公司）；QuantiNovaTMSYBRRGreen PCR Kit（凯杰企业管理有限公司）；无糖 DMEM 培养基和胎牛血清（Gibco 公司）；高糖 DMEM 培养基和青链霉素双抗（BI 公司）；全蛋白提取试剂盒、BCA 蛋白含量检测试剂盒和 SDS-PAGE 快速凝胶配制试剂盒（凯基生物公司）；Mul1 抗体（兔多克隆抗体，16133-1-AP，Proteintech 公司）；GAPDH（兔多克隆抗体，bs-2188R，博奥森公司）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG（ZB-2301，中杉金桥公司）；Hoechst 33342 染色液（索莱宝公司）；三气培养箱（Steri-Cycle i250，美国 Thermo Fisher 公司）；荧光定量 PCR 仪（ABI 7500，美国 ThermoFisher 公司）；CBM 智能细胞检测平台（Cytation 5，美国 BioTek 公司）；透射电子显微镜（HT-7800，日本 Hitachi 公司）。1.2实验方法1.2.1大鼠心肌细胞 H9C2 常规培养以含10%胎牛血清、1%青链霉素双抗的 DMEM 高糖培养基培养，置于 5%CO2、37、饱和湿度培养箱中，细胞密度达 80%90%时进行实验。1.2.2慢病毒转染及分组命名分别构建 Mul1过表达、过表达空质粒、Mul1 敲减质粒和敲减空质粒，进行慢病毒包装后用于实验。将 H9C2 细胞接种至 6 孔板内（2104/孔），置于 37、5%CO2培养箱培养。待细胞汇合至 20%30%时，以复感染指数（MOI）10 加入病毒以及 HitransG P感染增强液 40 L/孔。感染 18 h 后更换完全培养基，继续培养 72 h 后，倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达。将各组 H9C2 细胞分别命名为阴性对照组（NC）、Mul1 过表达组（LV-Mul1）、Mul1敲减组（LV-Mul1-RNAi）、Mul1 过表达空载体组（LV-Vector）、Mul1 敲减空载体组（LV-RNAi-Vector），其中 LV-Mul1-RNAi 的干扰靶序列为 5-GGAGCTAAGAAGATTCATTTG-3。1.2.3嘌呤霉素筛选稳定株慢病毒感染 H9C2细胞 72 h 后（80%90%细胞汇合），将细胞继续培养于含 4 g mL-1嘌呤霉素的培养基中进行药筛，筛选 48 h 后，未感染病毒的对照组细胞全部死亡，而感染病毒组未再出现细胞死亡时，调整嘌呤霉素至维持浓度 2 g mL-1，继续对感染后的细胞进行筛选，同时收集细胞进行后续实验。1.2.4RT-qPCR 检测 Mul1 表达载体 mRNA 水平使用 RNA 提取试剂盒提取各转染组细胞RNA，HiScript Q RT SuperMix for qPCR 试剂盒逆转录成 cDNA。加入 Mul1 基因引物进行PCR 反应。Mul1 上游引物：5-GGAGCATAAGATGGTGTGGAA-3，下 游 引 物：5-GTGTTAGTCCTCTGGTGAAT-3。并使用 QuantiNovaTMSYBRRGreen PCR Kit 在荧光定量 PCR 仪上进行 RT-qPCR。以 GAPDH 为内参基因，使用 2-Ct方法计算 Mul1 mRNA 的相对表达水平。1.2.5Western blot 检测 Mul1 表达载体的蛋白水平将各组细胞置于细胞裂解液中，匀浆振荡裂解静置 30 min 后，4、17 000g 离心 10 min，收集上清后 BCA 法测定蛋白浓度。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，每个泳道加样蛋白量为 30 g，并转于聚偏二氟乙烯膜上，10%脱脂牛奶封闭2 h，加入一抗（Mul1 11 000；GAPDH 15 000），4 孵育过夜。复温后洗膜 3 次，加入二抗（山羊抗兔，稀释比为 15 000）室温孵育 1 h，洗膜 3 次后化学发光法检测目的蛋白的相对表达量，并用Image J 软件进行定量分析。1.2.6观察缺氧培养下细胞的形态变化常规培养各组细胞至细胞融合度约 90%时，更换培养基为含 10%胎牛血清的无糖 DMEM，置于含 5%CO2、94%N2、1%O2的三气培养箱培养 12 h。同时，另将各组细胞进行常氧培养作为对照。倒置显微镜下观察各组细胞形态的变化。1.2.7检测缺氧培养下细胞的存活率将各组细胞以 PBS 清洗后加入 Hoechst 33342（11 000）染液、室温孵育 30 min，再以 PBS 洗涤，经 CBM智能细胞检测平台动态观察同一视野并采集图片进行定量分析。1.2.8透射电镜观察缺氧培养下细胞的超微结构收集上述各组正常培养和缺氧培养的 H9C2细胞，室温、700g 离心 5 min，4、戊二醛固定2 h，然后进行常规电镜样品固定、脱水、渗透、包埋，超薄切片，经透射电子显微镜观察并摄片。1.3统计学方法采用 GraphPad Prism 8.0.2 软件进行统计学分析，计量资料以均数标准差（xs）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组比较采用LSD-t检验。P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1Mul1 慢病毒表达载体转染 H9C2 细胞后绿色荧光蛋白表达情况各组 H9C2 细胞生长状态均良好；阴性对照组 H9C2 细胞中无绿色荧光表达，Mul1 过表达组2183期NCLV-VectorLV-Mul1LV-RNAi-VectorLV-Mul1-RNAiMul1 mRNA 相对表达量40353025201.51.00.50.0*及 Mul1 过表达空载体组阳性率均为 60%70%；Mul1 敲减组及 Mul1 敲减空载体组绿色荧光表达丰度高，阳性率均为 70%80%，见图 1。2.2Mul1 慢病毒表达载体干扰 H9C2 细胞 Mul1mRNA 表达效率鉴定RT-qPCR 检测结果显示，Mul1 过表达组图 1Mul1 慢病毒表达载体转染 H9C2 细胞后绿色荧光蛋白表达情况（100）Mul1 mRNA 水平高于阴性对照组和 Mul1 过表达空载体组（P 均0.05）；Mul1 敲减组 Mul1 mRNA表达水平低于阴性对照组和 Mul1 敲减空载体组（P 均0.05），见图 2。2.3Mul1 慢病毒表达载体干扰 H9C2 细胞 Mul1蛋白表达效率鉴定Western blot 检测结果显示，与阴性对照组和 Mul1 过表达空载体组相比，Mul1 过表达组Mul1 蛋白表达水平升高（P 均0.05）；与阴性对照组和 Mul1 敲减空载体组相比，Mul1 敲减组Mul1 蛋白表达水平降低（P 均0.05），见图 3。该结果表明，Mul1 过表达载体和敲减载体以及相应对照载体均构建成功，并且获得了 Mul1 过表达细胞株、Mul1 敲减细胞株以及相关空载体细胞株。2.4Mul1 对缺氧培养的 H9C2 细胞形态的影响采用倒置显微镜观察各组细胞生长状态，常*P0.05。图 2 Mul1 慢病毒表达载体干扰 H9C2 细胞Mul1 mRNA 表达效率鉴定A.Western blot 结果；B.灰度值分析；*P0.05。图 3Mul1 慢病毒表达载体干扰 H9C2 细胞 Mul1 蛋白表达效率鉴定白光绿色荧光NCLV-VectorLV-Mul1LV-RNAi-VectorLV-Mul1-RNAiABMul1GAPDH40 kDa37 kDaNCLV-RNAi-VectorLV-Mul1-RNAiLV-VectorLV-Mul1NCLV-RNAi-VectorLV-Mul1-RNAiLV-VectorLV-Mul1Mul1 蛋白的相对表达量2.01.51.00.50.0*徐方晶，等.线粒体泛素连接酶1对大鼠心肌细胞H9C2缺氧损伤的实验研究219宁夏医科大学学报45卷规培养下的各组 H9C2 细胞全部贴壁生长，为梭形或多角形，伸出伪足，形成不规则的星形并形成放射状排列的细胞簇，细胞核突出明显。缺氧12 h 后各组 H9C2 细胞形态均发生不同程度的变化，细胞簇周围有部分脱落的细胞，细胞皱缩。与阴性对照组和 Mul1 过表达空载体组相比，Mul1 过表达组细胞质出现空泡和粗大颗粒样物质，大片细胞皱缩、脱落；与阴性对照组和 Mul1 敲减空载体组相比，Mul1 敲减组细胞绝大部分细胞形态较好，偶见死亡细胞，透光性强，见图 4。2.6Mul1 对缺氧培养的 H9C2 细胞超微结构的影响正常含氧培养条件下各组 H9C2 细胞结构正常，细胞核膜边界清晰完整，染色质均匀，细胞质内容物丰富，线粒体结构清晰。缺氧 12 h 后，阴性对照组和阳性对照组（LV-Vector、LV-RNAi-Vector）H9C2 细胞线粒体排列紊乱、肿胀，出现局灶型空化现象，细胞核膜尚完整，染色质及细胞质内容物无异常改变；Mul1 过表达组 H9C2 细胞线粒体肿胀明显、嵴断裂、溶解呈空泡状，胞质内容物减少；Mul1 敲减组 H9C2 细胞大部分线粒体结构正常，偶见线粒体嵴断裂现象，见图 6。2.5Mul1 对缺氧培养的 H9C2 细胞存活率的影响将各组 H9C2 细胞置于 CBM 智能细胞检测平台中持续缺氧 24 h，在同一视野下持续进行细胞计数。结果显示，阴性对照组、Mul1 过表达空载体组、Mul1 敲减空载体组、Mul1 过表达组和Mul1 敲减组在缺氧 24 h 时，细胞存活率分别为（91.380.98）%、（88.431.07）%、（90.171.13）%、（65.422.60）%和（95.501.44）%，缺氧培养 24 h时，Mul1 过表达组细胞存活率低于阴性对照组及 Mul1 过表达空载体组（P 均0.05），Mul1 敲减组细胞存活率高于阴性对照组和 Mul1 敲减空载体组（P 均0.05），见图 5。图 4Mul1 对缺氧培养的 H9C2 细胞形态的影响（100）NCLV-VectorLV-Mul1LV-RNAi-VectorLV-Mul1-RNAi常规培养缺氧培养缺氧时间/h细胞存活率/%1009080706003691215182124#*#NCLV-VectorLV-Mul1LV-RNAi-VectorLV-Mul1-RNAi与阴性对照组比较*P0.05；与 Mul1 过表达空载体组比较#P0.05；与 Mul1 敲减空载体组比较P0.05。图 5Mul1 对缺氧培养的 H9C2 细胞存活率的影响2203期黑线框所示为局部线粒体区域；红色箭头所示为线粒体。图 6Mul1 对缺氧培养的 H9C2 细胞超微结构的影响3讨论心脏收缩和舒张的功能活动需要心肌细胞获取足够的氧气，并且心肌细胞较其他类型细胞对缺氧更为敏感12。缺氧可造成心肌细胞生长减慢、活力降低，细胞形态及内部结构受损，尤其造成线粒体明显损伤，细胞色素 C 释放增加，活性氧升高，ATP 合成受阻，引起心肌细胞能量代谢紊乱、氧化应激和炎性反应以及细胞凋亡等13。因此，寻找能够调控缺氧诱导的心肌细胞损伤的基因对研究缺血性心脏病的发生发展十分重要。目前研究4，6，14发现，Mul1 作为一种多功能的线粒体泛素连接酶可诱导细胞凋亡并减缓生长。但在心肌细胞中，尤其在缺氧培养下，Mul1 对心肌细胞损伤的影响报道甚少。为探讨 Mul1 是否调控缺氧心肌细胞的病理生理功能，本研究利用慢病毒转染技术成功实现外源性 Mul1 在 H9C2心肌细胞中过表达和低表达，在缺氧条件下培养Mul1 对 H9C2 细胞的影响结果显示，常规培养时各组细胞株之间的细胞形态结构及死亡率无明显变化，而缺氧培养时过表达 Mul1 可以加重细胞损伤程度，提高细胞的死亡率；敲减 Mul1 后上述现象则相反；进一步观察细胞超微结构提示，缺氧培养下 Mul1 可以进一步加重线粒体损伤，表现为线粒体严重肿胀、局灶性空化、嵴断裂及内膜消失。由此认为，Mul1 引起的心肌细胞损伤与线粒体损伤密切相关。线粒体是细胞内能量代谢的中枢，因此维持线粒体结构与功能的完整性对细胞状态的维持至关重要。Mul1 能够参与调节与线粒体功能障碍相关的蛋白质的水平和功能，其中线粒体动力学变化引起的线粒体代谢紊乱与心血管疾病的发生发展相关6。线粒体作为一种处于动态平衡状态的细胞器，当细胞受到代谢或环境压力时，通过融合、分裂来维持其形状、分布和大小。为了维持线粒体分裂和融合之间的平衡，需要 4 个进化上保守的 GTP 水解酶，包括线粒体融合蛋白 1（mitofusion 1，Mfn1）、线粒体融合蛋白 2（mitofusion 2，Mfn2）和视神经萎缩 1（optic atrophy 1，OPA1）以及动力相关蛋白 1（dynamic related protein 1，Drp1），其中 Drp1 被认为是分裂的“主调节器”14-15。Mul1 作为泛素或SUMO连接酶发挥作用，具有泛素化或 SUMO 化底物的潜力。当 Mul1 表达上调时，Mul1 通过 SUMO 化介导 Drp1 稳定和泛素化介导的 Mfn2 降解都会增强，这会阻碍线粒体融合，同时促进线粒体分NCLV-VectorLV-Mul1LV-RNAi-VectorLV-Mul1-RNAi常规培养缺氧培养30 000 倍10 000 倍10 000 倍30 000 倍徐方晶，等.线粒体泛素连接酶1对大鼠心肌细胞H9C2缺氧损伤的实验研究221宁夏医科大学学报45卷裂，扰乱线粒体动态平衡稳定状态，引起线粒体网状结构崩解、片段化增强以及膜电位损失，最终导致细胞死亡16-17。另外，Mul1 独特的拓扑结构使其能够在膜间“感知”线粒体应激，并通过特定底物的泛素化传递这些信号。其中 Mul1 连接酶失活导致 UBX 结构域蛋白 7（UBX domain protein 7，UBXN7）的积累，伴随缺氧诱导因子1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）蛋白表达水平升高，氧化磷酸化减少和糖酵解增加以维持缺氧细胞的内环境稳定，以适应缺氧18。Wang 等19的研究也表明，在缺血再灌注损伤的大鼠心肌中，Mul1通过 SUMO 化稳定并激活 p53，导致 p53 介导的线粒体功能障碍和细胞死亡。在本研究中，Mul1可增加缺氧培养下大鼠心肌细胞的损伤程度，加重以线粒体为主的细胞结构损伤，并增加细胞死亡率，原因可能为 Mul1 通过扰乱线粒体动力学变化以及对下游信号分子的相互作用进而调控线粒体功能参与缺氧心肌细胞损伤及死亡。参考文献：1Virani SS，Alonso A，Benjamin EJ，et al.Heart disease and stroke statistics-2020 update：a report fromthe American heart association J .Circulation，2020，141（9）：139-596.2 Khan MA，Hashim MJ，Mustafa H，et al.Global epidemiology of ischemic heart disease：results from theglobal burden of disease study J.Cureus，2020，12（7）：9349.3 Wang J，Toan S，Zhou H.Mitochondrial quality control in cardiac microvascular ischemia-reperfusion injury：new insights into the mechanisms and therapeuticpotentials J.Pharmacol Res，2020，156（7）：104771.4Zhang BC，Huang J，Li HL，et al.GIDE is a mitochondrial E3 ubiquitin ligase that induces apoptosisand slows growth J.Cell Res，2008，18（9）：900-910.5Braschi E，Zunino R，McBride HM.MAPL is a newmitochondrial SUMO E3 ligase that regulates mitochondrial fission J.EMBO Rep，2009，10（7）：748-754.6 Calle X，Garrido-Moreno V，Lopez-Gallardo E，et al.Mitochondrial E3 ubiquitin ligase 1（MUL1）as a novel therapeutic target for diseases associated with mitochondrial dysfunction J.IUBMB Life，2022，74（9）：850-865.7 Bae S，Kim SY，Jung JH，et al.Akt is negatively regulated by the MULAN E3 ligase J.Cell Res，2012，22（5）：873-885.8Jung JH，Bae S，Lee JY，et al.E3 ubiquitin ligaseHades negatively regulates the exonuclear function ofp53 J.Cell Death Differ，2011，18（12）：1865-1875.9 Li J，Qi W，Chen G，et al.Mitochondrial outer-membrane E3 ligase MUL1 ubiquitinates ULK1 and regulatesselenite-induced mitophagyJ.Autophagy，2015，11（8）：1216-1229.10 Lokireddy S，Wijesoma IW，Teng S，et al.The ubiquitin ligase Mul1 induces mitophagy in skeletal muscle in response to muscle-wasting stimuli J.CellMetab，2012，16（5）：613-624.11 Wang J，He J，Fan YC，et al.Extensive mitochondrial proteome disturbance occurs during the earlystages of acute myocardial ischemia J.Exp Ther 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Gregorio J，Ambivero CT，et al.Mitochondrial MUL1 E3 ubiquitin ligase regulates Hypoxia Inducible Factor（HIF-1）and metabolic reprogramming by modulating the UBXN7 cofactorprotein J.Sci Rep，2020，10（1）：1609.19Wang SJ，Chen H，Tang LJ，et al.Upregulation ofmitochondrial E3 ubiquitin ligase 1 in rat heart contributes to ischemia/reperfusion injuryJ.Can JPhysiol Pharmacol，2020，98（5）：259-266.（责任编辑：李晓玉）2223期Study of Mitochondrial Ubiquitin Ligase 1 Exacerbating Hypoxic Injuryin Cardiomyocytes H9C2XU Fangjing1，WANG Jie2，FAN Yucheng3，ZHANG Yu1，SUN Meiqi1，HE Jing1，HE Jun2（1.School of Clinical Medicine，Ningxia Medical University，Yinchuan750004，China；2.General Hospitalof Ningxia Medical University，Yinchuan750004，China；3.Department of Pathology，Shizuishan FirstPeople s Hospital Affiliated to Ningxia Medical University，Shizuishan753600，China）Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of mitochondrial ubiquitin ligase 1（Mul1）on hypoxic injuryof cardiomyocytes.MethodsThe lentiviral vectors of Mul1 overexpression and knockdown were constructed and transfected into H9C2 cells，respectively.The negative control group，Mul1 overexpression group，over-expression empty vector group，Mul1 knockdown group and knockdown empty vector group were cultured in routine culture（5%CO2，21%O2）and hypoxia culture（5%CO2，94%N2，1%O2），respectively.Themorphological changes of cells in each group were observed by inverted microscope.CBM intelligent celldetection platform was used to dynamically observe the cell survival rate，and transmission electron microscope was used to observe the ultrastructure of cardiomyocytes.ResultsCompared with the correspondingconventional culture groups，the survival rate of H9C2 cells in each group was significantly decreased，thecell morphology was significantly changed，and the organelles were significantly damaged after hypoxia culture.After hypoxia，compared with the negative control group and the over-expression empty vector group，the cell status of the Mul1 over-expression group was worse，and the survival rate was significantly decreased（P all0.05）.Compared with the negative control group and the knockdown empty vector group，thecell status of the Mul1 knockdown group was better and the survival rate was increased（P all0.05）.Theresults of electron microscopy showed that compared with the control group，the Mul1 overexpression grouphad more severe structural damage，most of the mitochondrial cristae were broken or dissolved into vacuolated shape，and the cytoplasmic content was significantly reduced.The degree of cell structural damage inMul1 knockdown group was lighter than that in each control group，most of the mitochondrial structure wasnormal，and occasionally mitochondrial cristae fracture was observed.ConclusionMul1 aggravated the hypoxia-induced structural damage of cardiomyocytes and decreased the viability of cardiomyocytes.Key words：mitochondrial ubiquitin ligase 1；cardiomyocytes；hypoxia；mitochondrial damage徐方晶，等.线粒体泛素连接酶1对大鼠心肌细胞H9C2缺氧损伤的实验研究有的作者将离心机转速用 rpm 表示，这是非法定单位的写法。正确的写法是：当低速离心时用 r min-1表示；当高速或超速离心时用相对离心力“g”表示，g 是斜体，前面是乘号。（本刊编辑部）离心机转速的写法及相对离心力的正确表示223