实验课-制药工程生化原理与制备实验指.docx

生化技术理论与实践实验指导
（四年制制药工程专业）

生命科学与工程学院制药工程系
张新国编写 二零一零年六月

实验一 管碟法测定抗生素效价

一 实验目的
　　·了解管碟法的原理。
　　·掌握二剂量法测定抗生素效价单位的技术和计算方法。
二 实验原理
抗生素效价：抗生素是一种生理活性物质，它对生命现象很敏感，可以用抗生素的生物效能表示它的效价，其最小效价单元就叫做“单位”(U)。经由国际协商规定出来的标准单位，称为“国际单位”(IU)。通常各种抗生素的单位，是根据国家抗生素标准品测定出来的，是衡量药物有效成份的一种尺度。
抗生素的剂量常用重量和效价来表示。化学合成和半合成的抗菌药物都以重量表示，生物合成的抗生素以效价表示，并同时注明与效价相对应的重量。效价是以抗菌效能(活性部分)作为衡量的标准，因此，效价的高低是衡量抗生素质量的相对标准。效价以“单位”(U)来表示。
抗生素的生物检定是以抗生素对微生物的抗菌效力作为效价的衡量标准，具有与应用原理相一致、用量少和灵敏度高等优点。管碟法是琼脂扩散法中的一种，已被各国药典广泛采用，作为法定的抗生素生物检定方法。
管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径 6.0±0.lmm，外径8.0±0.lmm，高10±0.lmm），管内放人标准品和检品的溶液，经16~18小时恒温培养，抗生素扩散的有效范围内则产生透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈（图实验-18）。抑菌圈直径大小与抗生素浓度相关，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。抗生素效价常采用二剂量法。将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比例（2:1或4:1）的两种溶液，在同一平板上比较其抗药活性，再根据抗生素浓度对数和抑菌圈直径成直线关系的原理来计算供试品效价。取含菌层的双层平板培养基，每个平板表面放置4个小钢管，管内分别放入检品高、低剂量和标准品高、低剂量溶液。先测量出四点的抑菌圈直径，按下列公式计算出检品的效价。
(1) 求出W和V：
(2) W=（SH+UH）-（SL+UL）
(3) V=（UH+UL）-（SH+SL）
式中： UH：供试品高剂量之抑菌圈直径
UL：供试品低剂量之抑菌圈直径
SH：标准品高剂量之抑菌圈直径
SL：标准品低剂量之抑菌圈直径
求出θ： （2） θ=D·antilog（IV/W）式中：
θ：供试品和标准品的效价比
D：标准品高剂量与供试品高剂量之比，一般为1
I：高低剂量之比的对数，即log2或log4。
求出Pr ： (5) Pr = Ar×θ 式中：
Pr：供试品实际单位数
Ar：供试品标示量或估计单位
当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系。
三 实验材料 -材料和仪器
（1）细菌：短小芽胞杆菌[CMCC（B）63202的芽胞悬液。
（2）培养基：效价检定用培养基（上层、底层）。
（3）抗生素：抗生素检品及标准品（高剂量、低剂量，高剂量与低剂量之比为2:1）。
（4）试剂与器材：灭菌生理盐水，无菌平皿，牛津杯，无菌吸管，镊子，滴管，直尺。
四 实验方法
（1） 取无菌平皿，加入20ml底层培养基，凝固后作为底层。
（2） 用灭菌生理盐水将短小芽胞杆菌的芽胞悬液稀释至一定浓度以能得到清晰的抑菌圈，且标准品高浓度所得抑菌圈直径在18-22mm为基准。用无菌吸管吸取 1ml芽胞悬液，加入到200ml恒温于50℃的上层培养基中摇匀，迅速以无菌吸管吸取5ml，注入到底层培养基上，铺平待凝。
（3） 在平板底部四边，分别对角注明“SH”、“SL” 和“UH”、“UL”标记。
（4） 镊子火焰灭菌3次，然后夹取4个牛津杯垂直放置在平板中标志附近（注：勿使钢管陷入培养基内，各小杯之间尽量等距）。
（5） 以无菌滴管分别在每个牛津杯内加入相应的抗生素溶液至满但不溢出管外，且四杯内液面高度相同，盖上平皿盖，静置30分钟。
（6） 将平皿置于37℃恒温培养箱培养16-18 h，量取各抑菌圈直径（SH、SL、UH、UL），以毫米为单位，误差不超过0.1mm。
（7） 计算抗生素效价
（8） 查放线图计算抗生素效价

思考题
怎样理解抗生素效价测定与抗生素含量测定二者的关系？

实验二 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量
一、目的
1．学习SDS—PAGE测定蛋白质分子量的原理。
2．掌握SDS—PAGE测定蛋白质分子量的操作方法。
二、原理
聚丙烯酰胺凝胶是由单体—丙烯酰胺（acrylamide,简称Acr）和交联剂-N,N-甲叉双丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide,简称Bis）在加速剂和催化剂的作用下聚合而成的高分子物质，具有三维网状结构和分子筛性质。以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, 简称PAGE）。
由于各种蛋白质所带的净电荷、分子量大小和形状不同，在电泳中会产生不同的电荷效应和分子筛效应，不连续电泳还有浓缩效应，因而有不同的迁移率。
聚丙烯酰胺凝胶由于富含酰胺基，故它是稳定的亲水凝胶。结构中不带电荷，因而在电场中电泳电渗现象极为微小。网状结构能限制蛋白质大分子的扩散运动，具有良好的抗对流作用。在合适浓度范围内还具有较好的透明度，一定的机械强度，以及化学上惰性、吸附作用很小等许多优点。
十二烷基硫酸钠（简称SDS）是阴离子表面活性剂，它在水溶液中，以单体和分子团的混合形式存在。单体SDS能与蛋白质结合生成蛋白质—SDS复合物。由于SDS带有大量负电荷，所以生成的蛋白质—SDS复合物所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质所带净电荷的差异，均带有相同密度的负电荷，。在蛋白质溶液中，加入SDS和巯基乙醇，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原，使多肽组分分成单个亚单位，SDS可使蛋白质亚单位中的氢键、疏水键打开，因此SDS与蛋白质结合后，还引起蛋白质构象的改变，蛋白质—SDS复合物形状近似雪茄形的长椭圆棒，不同复合物的短轴相同，约1.8nm，而长轴改变则与蛋白质的分子量成正比。基于上述两种情况，蛋白质—SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率不再受原有电荷和形状的影响，而只是与椭圆棒的长度有关，也就是只与蛋白质分子量有关。在电泳体系中加入十二烷基硫酸钠（简称SDS），则电泳迁移率主要依赖于蛋白质分子量，而与所带的净电荷和形状无关，这种电泳方法称为SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）。
蛋白质分子量在10，000—200，000之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系，可用下列公式表示：

上式中，为蛋白质分子量；为常数；为斜率；为相对迁移率（即蛋白质的电泳迁移距离除以示踪染料迁移距离）。
根据上述方程将已知分子量的标准蛋白质电泳迁移率与分子量的对数作图，可制作出一条标准曲线。在相同条件下只要测得未知分子量的蛋白质的电泳迁移率，即可从标准曲线求得其近似分子量。
不同的凝胶浓度适用于不同的分子量范围（见下表1），可根据所测分子量的范围选择最适凝聚浓度，并尽可能选择分子量范围和性质与待测样品相近的蛋白质作标准蛋白。
表1 分子量范围与凝胶浓度的关系
凝胶浓度
交联度
分子量范围
5%
2.6%
25,000—200,000
10%
2.6%
10,000—70,000
15%
2.6%
10,000—50,000

由于SDS—PAGE具有设备简单、快速，分辨率和灵敏度高等优点，广泛应用于生物化学、分子生物学、基因工程、医学及免疫学等方面。
SDS—PAGE作为一种测定蛋白质分子量的方法，尽管对于大部分蛋白质来说，在比较广泛的分子量范围内，蛋白质的迁移率与其分子量的对数确实存在着线性关系，但是有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的（如血红蛋白、胰凝乳蛋白酶等），他们在变性剂和强还原剂的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类的蛋白质，SDS—PAGE测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整蛋白质的分子量。为此，对这类样品分子量的测定，还必须采用其他测定方法作参照。当然这也使得SDS—PAGE特别适用于寡聚蛋白及其亚基的分析鉴定和分子量的测定。
另外，还有一些电荷异常和构象特殊的蛋白质（如组蛋白F1），含有较大辅基的糖蛋白和含有二硫键较多的蛋白质，以及一些结构蛋白（如胶原蛋白）等，它们在SDS—凝胶系统中，电泳的迁移率与分子量的对数不呈线性关系。因此，为了测得真实和完整的蛋白质分子量，通常可采用多种方法进行测定和相互验证。
三、器材
1.夹心式垂直板电泳槽（附带凝胶模135×100×1.5mm，1台/组），
2.直流稳压电源（电压300—600V，电流50—100mA），
3细长头的滴管1只/组
4.1ml注射器，
5.微量注射器（10或50μL），
四、试剂
1. 蛋白Marker20次/支：按使用说明配制
2. BSA（牛血清白蛋白）
3. 连续体系SDS—PAGE有关试剂
1）0.2mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液：
称 Na2HPO4·12H2O51.58g及NaH2PO4·2H2O8.74g，溶于重蒸水中并定容1L。
2) 5×样品溶解液（上样液）
组分浓度：
250 mmol/L Tris•Cl (pH 6.8)
10% (W/V) SDS （电泳级）
0.5% (W/V) 溴酚蓝（BPB）
50% (V/V) 甘油
5% (W/V) β-巯基乙醇（2-ME）
配制量 5 ml
配制方法：
a．称量下列试剂置于10ml 塑料离心管中。
1 M Tris•Cl (pH 6.8) 1.25 ml
SDS （电泳级） 0.5 g
溴酚蓝（BPB） 25 mg
甘油 2.5 ml
b．加去离子水溶解后定容至5 ml。
c．小份（500 ul/份）分装后于室温保存。
d．使用前将25 ul的2-ME加到每小份中。
e．加入2-ME的样品溶解液可在室温下保存一个月左右。
3) 凝胶贮液
称Acr30g，Bis0.8g，加重蒸水至100ml，过滤后置棕色瓶内，4℃贮存可用1—2个月。
4) 凝胶缓冲液
称SDS0.2g，加0.2mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液至100ml。4℃贮存，用前稍加温使SDS溶解。
5) 1%TEMED
取TEMED1ml，加重蒸水至100ml，置棕色瓶内4℃贮存。
6) 10%过硫酸铵（AP）
称AP10g，加重蒸水100ml，置棕色瓶内4℃贮存。
7) 电极缓冲液（0.1%SDS，0.1mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液）：
称SDS1克，加500ml0.2mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液，再用蒸馏水定容至1L。
8) 2%琼脂（糖）粉
称琼脂（糖）2g，加100ml上述电极缓冲液，4℃贮存。
4. 固定液
取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。
5. 染色液
考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液250ml，过滤后应用。
6. 脱色液
冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1L。
五、操作
（一）安装夹心式垂直板电泳槽
夹心式垂直板电泳槽操作简单，不易渗漏。这种电泳槽两侧为有机玻璃制成的电极槽，两个电极槽中间夹有一个凝胶模，该模由1个凵形硅胶框、长与短玻璃板及样品槽模板（梳子）所组成。电泳槽由上贮槽（白金电极在上或面对短玻璃板），下贮槽（白金电极在下或面对长玻璃板）和回纹冷凝管组成。两个电极槽与凝胶模间靠贮液槽螺丝固定。各部分按下列顺序组装：
1） 装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。
2） 将长、短玻璃板分别插到凵形硅胶框的凹形槽中。注意勿用手接触灌胶面的玻璃。
3） 将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。
4） 将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。
5） 竖直电泳槽，用细长头滴管吸取已熔化的2%琼脂（糖）加在长玻璃板下端与硅胶框交界的缝隙内，其目的是封住空隙，加琼脂（糖）溶液时中应避免有气泡。
（二）配胶及凝胶板的制备
1. 配胶
根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。下表表示配制10ml不同浓度分离胶所需各种试剂用量（单位/ml）。
SDS-PAGE 分离胶配制方法

2. 凝胶板的制备
按表SDS-PAGE分离胶配制方法配制10ml 10%浓度的胶，按SDS-PAGE浓缩胶（5%Acrylamide）配方表配制5ml5%浓缩胶，将分离胶混合液直接倒入两块玻璃板的缝隙内直至距离短玻璃板上缘0.5cm处，再向两块玻璃板的缝隙内加水，待分离胶凝固后，把水倒出，用滤纸把水吸干。再向两块玻璃板中间加入浓缩胶，插入梳子。凝胶聚合约需30min，小心拔出梳形样品槽模板，用窄条滤纸吸去残余水分，注意不要弄破凹形加样槽的底面。倒入电极缓冲液即可准备加样。
（三）加样
加样体积要根据凝胶厚度及样品浓度灵活掌握，一般加样体积为10—15μL。如果样品槽中有气泡，可用注射器针头挑除。加样时，将微量注射器的针头通过电极缓冲液伸入加样槽内，尽量接近底部，轻轻推动微量注射器，注意针头勿碰破凹形槽胶面。
（四）电泳
上槽接负极，下槽接正极，打开电源，将电流调至20mA，待样品进入分离胶后，将电流调至60mA，待染料前沿迁移至距硅胶框底边1—1.5cm处，停止电泳。
（五）凝胶板剥离
电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅胶框，用不锈钢药铲撬开短玻璃板，在凝胶板切下一
角作为前沿标记。在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。
（六）染色与脱色
先用固定液将凝胶固定1小时，再将染色液倒入培养皿内，染色40min左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。
（七）绘制标准曲线
将大培养皿放在一张坐标纸上，量出加样端距细铜丝间的距离（cm）（即染料迁移距离）以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离（cm）（即样品迁移距离），如图所示。按下式计算相对迁移率mR：

以标准蛋白质的分子量为纵坐标，对应的相对迁移率为横坐标在半对数坐标纸上作图，可得到一条标准曲线，根据待测样品相对迁移率可直接在标准曲线上查出其分子量。

样品及标准蛋白在连续SDS-PAGE分离示意图
样品槽1,2,4,5,为待测样品，样品槽3为标准蛋白
六 注意事项
1. SDS与蛋白质的结合按质量成比例（即：1.4gSDS/g蛋白质），蛋白质含量不可以超标，否则SDS结合量不足。
2. 有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量。
3. 如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清晰等现象，可能是SDS不纯引起。
思考题
1. SDS—PAGE用于蛋白质分子量测定的基础是什么？
2 SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）与PAGE有何不同？

实验三 质粒DNA的提取及电泳
一、目的
l 了解碱裂解质粒提取过程中各种纯化步骤的设计思想。
l 掌握提取质粒实验中的各项基本技术。
l 掌握水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的方法、步骤。
l 掌握利用溴化乙锭（EB）在紫外下检测DNA的原理。
二 实验原理
裂解法是小量提取质粒最常用的方法，是根据共价闭环质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链相互盘旋，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭环质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，是由D-半乳糖和3,6脱水L-半乳糖连接而的一种线性多糖。琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，通常使用的浓度是1%-3%,加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。尽管琼脂糖本身没有电荷，但一些糖基可能会被羧基、甲氧基特别是硫酸根不同度的取代，使得琼脂糖凝胶表面带有一定的电荷，引起电泳过中发生电渗以及样品和凝胶间的静电相互作用，影响分离效果。
琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的提纯、分析。如浓度为1%的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的，对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小，所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合DNA、RNA分子的分离、分析，由于DNA、RNA分子通常较大，所以在分离过中会存在一定的摩擦阻碍作用，这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。例如对双链DNA,电泳迁移率的大小主要与DNA分子大小有关，而与碱基排列及组成无关。另外，一些低熔点的琼脂糖在62 ℃时熔化，因此其中的样品(如DNA)，可以在加热到熔点的水浴中放置一段时间，重新溶解到溶液中而回收。
三 试剂与仪器
试剂：无水乙醇，70%乙醇，氨苄青霉素，EDTA，SDS，饱和酚，氯仿，琼脂糖，Tris，HCl，NaOH，乙酸钾，冰乙酸，Na2EDTA，溴酚蓝，EB，甘油，RNA酶, NaCl，异戊醇，异丙醇
溶液Ⅰ：50mmol/L Tis-HCl（pH8.0）、10 mmol/L EDTA
溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH、2%SDS，用前等体积混合。
溶液Ⅲ：5mol/L乙酸钾 60ml、冰乙酸11.5ml 、水28.5ml。
TE缓冲液：10mmol∕L Tris.Cl（PH8.0），1mmol∕L EDTA（pH8.0）高压灭菌储存于4℃冰箱中。
10×TAE缓冲液 0.4mol/L Tris·Ac, 0.1mol/L EDTA
6×凝胶加样缓冲液 50%甘油，0.1mol/L Na2EDTA pH 8.0, 0.25%溴酚蓝
裂解缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl pH8.0，100 mmol/L NaCl，50 mmol/L EDTA pH 8.0。
裂解缓冲液2： 2%（v/v）Triton X-100， 1%（v/v）SDS， 100mM NaCl， 10mM Tris 碱(pH8.0)， 1mM EDTA(pH8.0)
琼脂糖凝胶：称取0.8g 琼脂糖,置于250ml 锥形瓶中, 加入100ml TAE 稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀, 此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。待胶溶解好后加入5ulEB，摇匀，倒入插好梳子的制胶模具中。
LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，Nacl10g用5mol/LNaoH调pH至7.0，用去离子水定容至1L。固体培养基向液体培养基中加入2%的琼脂糖。高压121度20min。
YPD培养基：酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，加水至1L，高压121度20min，灭菌后加入葡萄糖20g。固体培养基向液体培养基中加入2%的琼脂糖。
仪器：水平电泳槽，稳压稳流高压电泳仪，紫外分析仪，离心机，灭菌锅，恒温振荡摇床，1.5ml离心管，移液枪，三角瓶。
四 实验步骤
【1】将大肠杆菌划线于固体LB培养基培养，挑选单菌落接种LB液体培养基中，待其达到对数期时收集菌液。
【2】分别取1.4ml菌液至1.5ml离心管，4℃，12500 rpm离心1分钟收集菌体。
【3】弃上清，12500 rpm离心1 分钟，用移液枪将上清液吸干净（此步骤是关键步骤，否则质粒提不出）。取沉淀，重悬于100μl溶液Ⅰ（预冷的），用移液枪吹打至完全分散（必须充分混匀）。
【4】加入新配的溶液Ⅱ200μl立即温和混匀，直到溶液变得澄清(细胞破碎)。（此时溶液应非常粘稠，打开盖时可拉出丝，如果不能，质粒就提不出）。
【5】加入溶液Ⅲ150μl（预冷的），温和混匀（非常轻柔缓慢的颠倒混匀），出现白色沉淀。
【6】12500 rpm，4℃，离心15分钟，取上清液（约400ul）至另一1.5ml离心管，注意不要取到沉淀。
【7】 向上清液中加等体积酚/氯仿，反复混匀，室温放置10分钟，12500 rpm，4℃，离心5分钟，将上清液转至另一离心管中。
【8】 向上清液中加入800ul无水乙醇，混匀后，12500rpm离心10分钟。
【9】弃上清（直接倒掉），将离心管倒扣在吸水纸上数秒，吸干净壁上的残留乙醇。
【10】加入500ul 70%乙醇，混匀，8000rpm离心2分钟。
【11】弃上清（直接倒掉，不用枪吸），充分干燥（室温放置半小时或超净台吹干十分钟左右）。
【12】加10ulTE缓冲液, 5ul 10mg/ml的RNAase(RNA酶)，溶解质粒DNA，充分混匀。
【13】取5ul DNA 样品在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳缓冲液为TAE，于电流50 mA进行电泳，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm 时,停止电泳，紫外分析仪观察, 数码摄像机拍照。
五 对比试验-酵母组DNA提取
【1】10ml菌液过夜培养至饱和（OD600值为2-3）
【2】离心沉降细胞（Sorvall中以2000rpm的速度），然后以冷的、等体积的无菌蒸馏水洗涤
【3】将细胞沉淀在200μl 裂解缓冲液中重悬浮，然后加入约300μl 玻璃珠和200μl的1：1苯酚：氯仿混和液
【4】漩涡摇匀1-2min
【5】加入200μl的 TE缓冲液，倒置混合6-10次。注意：从这步开始漩涡摇匀可能会剪切DNA
【6】在微型离心机中以13000rpm的速度离心样品5min
【7】将上层的水相转移到干净的微量离心管中
【8】本取5ul DNA样品在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳，于电流50 mA 电泳30～60min，紫外分析仪观察结果，数码摄像机拍照。

六 实验注意事项
1. 本实验区为污染区，操作时请戴手套，并注意不要带手套触摸非实验区内物品。
2. 制作凝胶时，每100ml凝胶加入EB量不超过5µl，每50ml凝胶不超过2µl，制作25ml凝胶时加入1µl足够。EB请勿在室温放置，使用完必须放回专门区域。
3. 制作完凝胶后，请及时清理模具内残胶。模具及梳子请放回盘内，勿随意散放在实验区内。
4. 电泳时，使用TAE的工作浓度为1X。电泳前请先检查电泳槽内缓冲液，液面过低请补加相应缓冲液；缓冲液浑浊请及时更换。
5. 电泳后请合上电泳槽上盖，防止异物进入及缓冲液蒸发.
6. 实验后请清理实验桌面，带走自己的实验物品。使用过的东西放回原位。
思考题：
1. DNA含量检测对生物药物质量评价的意义？
实验四 双缩脲法测蛋白质的测定
一 实验目的
1、掌握双缩脲法测量蛋白质含量的原理和方法；
2、了解离心机的使用。
二 实验原理
蛋白质含有肤键，肽键在碱性溶液中可与铜离子形成紫红色化合物，其反应式为：

此化合物在540 nm 处有吸收蜂，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比．而与蛋白质分子量及氨基酸组成无关。

三 试剂与仪器
试剂：
奶粉的配制：称取0.25g市购奶粉于100ml水中。
双缩脲试剂：称取CuSO45H2O 1.5 g，酒石酸钾钠(NaKC4H406·4H2O)6 g。溶于500 ml蒸馏水，在搅拌下加人300ml、10％NaOH 溶液然后用水稀释到1000 ml。配好后贮于塑料瓶中。此试剂若长期存放为防止铜离子自动还原成一价氧化铜沉淀，通常在双缩脲试剂中加人1 g碘化钾，此试剂可长期保存 若试剂中出现黑色沉淀则需重配。
蛋白质标准溶液：利用此法测定奶粉中的蛋白含量，最后以牛血清白蛋白为标准蛋白。准确称取1.0000g牛血清白蛋白，加入少量水溶解，然后定容到100 ml，配成10 mg/ml标准液备用。
仪器：试管，试管架，烧杯，玻璃棒，比色皿，容量瓶，试剂瓶，721 分光光度计
四 实验步骤
【1】标准啦线绘制
分别取牛血清白蛋白标准液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml于试管中，不足1.0 ml者用蒸馏水补齐至1.0ml，然后各试臂中加人4.0 ml双缩脲试剂．混匀，室温下反应30min．然后用721分光光度计在540 nm处测定吸光值。以牛血清白蛋白量为横坐标，吸光值为纵坐标，作标准曲线。
【2】奶粉中蛋白含量的测定
准确吸取9 ml配制好的液态牛奶于10ml离心管中， 5000 r／min下离心10min，收集上清。取上清1ml，加4 ml双缩脲试剂，室温下反应30min．在540 nm 处测定吸光值，之后查对标准曲线，可求得蛋白的含量。
五 注意事项
（1）本实验方法测定范围1－10mg蛋白质。
（2）须于显色后30min内比色测定。30min后，可有雾状沉淀发生。各管由显色到比色的时间应尽可能一致。
（3）有大量脂肪性物质同时存在时，会产生浑浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上清液再测定。
（4）试管一定要干燥，勿使样品粘在试管壁上
思考题：
1.常用的蛋白质含量检测的方法有哪些，分别基于那些原理？