碳点透射电镜表征方法的探究与实践.pdf

第 卷 第 期 年 月电 子 显 微 学 报 ，文章编号：（）碳点透射电镜表征方法的探究与实践梁国弘，邹少兰，石 璘，丁哲远，方 卉，翟 勇，刘士新，靳凤民（天津大学化工学院，大型仪器测试平台，天津；天津大学地球系统科学学院，天津；天津大学化工学院，天津）摘 要 碳点（）由于其独特的物理、化学特性，近年来受到科技工作者的广泛关注。透射电镜（）作为材料表征的重要工具之一，能够直观地展示材料微观形态和微区结构。本文以普遍廉价易得、低毒性的生物质材料作为原料制备。针对 在 表征中制备易团聚、寻样困难、成像衬度低的问题，本文对样品制备方法、观察方法及参数进行优化，探索最佳电镜图像拍摄条件，提出了一种倾斜载网制样、邻位寻样和扫描透射（）成像表征 的方法，为 的 表征工作提供指导思路。关键词 透射电镜；碳点；样品制备；邻位寻样；图像衬度中图分类号：；文献标识码：收稿日期：；修订日期：基金项目：天津大学实验室建设与管理改革项目（）；天津大学研究生院研究生创新人才培养项目（，）作者简介：梁国弘（），女（汉族），天津人，工程师：通讯作者：靳凤民（），男（汉族），天津人，高级工程师：透 射 电 镜（，）作为材料表征的重要工具之一，能在不同尺度对材料的形态及微观结构进行研究，配合能谱仪和电子能量损失谱仪可以对样品元素进行化学信息分析，对材料科学、生命科学以及纳米技术等领域的发展起到了极其重要的作用。碳点（，）在空间三个维度的尺寸都在 以下，作为一种新型发光碳纳米颗粒材料，在过去十余年里备受世界范围内科技工作者的关注。是由晶态碳核和无定形的有机官能团（如羟基、羧基和氨基）组成，与传统的量子点和荧光染料相比，具有优良的光学稳定性、良好的水溶性、较低的细胞毒性以及良好的生物相容性，被广泛应用于医学成像、生物标记、光催化、电催化等诸多领域。随着研究的不断深入，对 尺寸、形貌和微区结构的表征研究越来越重要，如光谱技术、散射与衍射技术、电子显微技术等。这些检测技术在 的结构表征中各有优势。光谱技术可以简单方便地测定 的分子结构和寿命；散射和衍射技术可用于表征 结晶程度、晶体结构和粒径方面的信息。电子显微技术，如扫描电子显微镜（）和透射电子显微镜（），能够直观地展示材料微观形态和微区结构。利用 不仅可以获得 的尺寸信息及高分辨电子显微像（），同时也可以从选区电子衍射（）花样得到样品倒易空间的信息，因此 成为 表征的重要技术之一。对待测样品制备要求苛刻、寻样困难，且 的成像衬度差，利用电镜研究 仍具有很大挑战。刘志昂课题组在 年报道了碳量子点透射电子显微镜样品的制备浓度和点样方式，此后对 的 观察方法鲜有报道。针对 研究 形态和结构面临的挑战，本文对样品制备方法、观察方法和参数进行优化，从倾斜载网制样、邻位寻样技巧、提高 图像衬度的操作技术、扫描透射（）成像等方面入手，探索最佳电镜图像拍摄条件，系统建立和完善 材料 表征方法，为 的 表征工作提供指导思路。实验材料与方法 碳点样品获取 称取 碱木质素溶于 去离子水中，缓慢加入 浓硝酸（，），搅拌并超声处理 后用去离子水稀释。溶液经 滤膜抽滤后用去离子水清洗干净，超声处理，将过滤得到的黑色样品分散在 去离子水 第 期梁国弘等：碳点透射电镜表征方法的探究与实践 中。然后在 下水热反应釜中，热液反应 ，再次用 针式滤膜将反应后的混合溶液过滤、离心，去除不溶性碳，最后用透析袋（截留分子量为 ）透析 天，获得 分散液。样品制备 （）稀释分散：将 分散液转移到离心管中，加入适量的去离子水稀释，超声振荡 ，使样品分散。（）倾斜载网制样：移液器取 样品，滴在倾斜一定角度的超薄碳膜铜载网上，确保液滴一侧边缘在铜载网中间，然后将载网放至干净锡箔纸上，烤灯下烘干。整个制样操作在半密闭条件下进行，尽量减少样品与空气中 及灰尘的接触，降低样品污染的机率。观察方法和参数优化 使用 型号为 的 对 节中获得的 进行观察和表征，首先进行样品高度调整、电子束中心居中、聚光镜光阑对正、电子枪对中、电压中心调节、聚光镜消像散、物镜消像散等电子枪和电子束校正合轴操作。然后对 观察方法进行调整和优化，具体方法包括如下三种。（）邻位寻样：低放大倍数、低电子束剂量下通过电镜的侧插相机，选择颗粒团聚不严重的样品区域，进行样品高度和焦距调整。然后依据 颗粒大小增加放大倍率，在团聚样品周围移动轨迹球，利用电镜底插相机找到均匀分散的 区域，清晰记录样品的形态。（）提高 图像衬度：设置 号聚光镜光阑（孔径 ），号束斑尺寸（约为 ），号会聚角（约为 ），束流约为 ，在均匀分散的 区域，通过调整物镜焦距（正焦、欠焦）和物镜光阑（孔径 ）对 进行表征和分析。（）扫描透射（）成像：移动样品至非晶区域，调整、投影镜偏转线圈电流（）、聚光镜像散线圈电流（）等合轴参数，并设置 号聚光镜光阑（孔径 ），号束斑尺寸（约 ），束流约为 ，相机常数为 ，分别通过 明场像和暗场像对 进行表征和分析。结果与讨论 光谱分析 利用荧光光谱仪对 节中获得的 进行表征，如图 所示，在 处有激发峰，在 处有较强的荧光发射峰，结果与文 献 报 道一致。图 的荧光光谱。倾斜载网制样 样品的制备方式，直接影响到 的观察效果和分析结果。制备 样品的关键是如何将样品颗粒分散均匀，尽量各自独立而不团聚：浓度高时样品会团聚结块，分散不均匀，无法反映真实形态；浓度较低时，尺寸极小的 很难被找到，耗费大量的时间和精力去寻找样品。因此合适的样品浓度和制样方式是高质量 图像的前提，通过将 与水按不同比例混合稀释进行实验，确定将 稀释 倍后效果最佳，用于后续实验中。的表面富含大量羟基或者羧基，具有良好的亲水性，而载网碳膜表面疏水性较强，不利于亲水性样品的吸附，倾斜载网滴样（图 所示）的目的是减小液滴前接触角，增加液滴与载网的接触面积，使之尽量大面积铺展开。随着溶液液滴在载网表面的蒸发和浓缩，液滴在载网表面将从中心向外流动，液滴的流动会将溶质带到接触线上并沉积下来，最终形成环状沉积物，即“咖啡环效应”，因此文中通过控制滴加位置，使 液滴一侧边缘滴在载网中间。另外最后将载网放在锡箔纸上而不是常规 制样的滤纸上，避免液滴样品散开到载网之外区域。利用该方法制样，载网中间（即液滴环状边缘位置）寻样效率高，且 分散性好。通过数次不同倾斜角度实验，发现倾斜角度为 时既方便操作，又能保证 液滴一侧边缘滴在载网中间，在电镜视野中能够快速找到分散均匀的 颗粒，角度太大或太小液滴容易铺展至整个载网，样品团聚结块，寻样困难。电子显微学报 第 卷图 样品滴样示意图。邻位寻样 样品难以在电镜的荧光屏和侧插相机视野范围内找到，而利用电镜底插相机盲目寻样的效率又很低，是 观察 面临的最大的问题。本文采用邻位寻样技术，提高了寻样效率。如图 所示，在荧光屏或侧插相机视野内找到团聚 区域，然后在电镜底插相机视野中沿团聚样品周围移动轨迹球，可较快找到均匀分散的样品区域进行拍照（图）。随机选择 个 样本量取其粒径，统计平均值在 。图 寻样区域示意图。团聚 的 像；分散均匀 的 像（插图为 粒径分布直方图）。；（）提高 图像衬度 衡量 图像质量的一个重要指标是电子图像衬度。的图像衬度（又称对比度或黑白反差）指图像上不同区域间明暗程度的差异，其实质上反映的是透射电子密度（强度）的差别。图像衬度根据成像机制不同可以分为质厚衬度、衍射衬度和相位衬度三种。质厚衬度是由于样品不同区域厚度或不同原子序数差异而形成的衬度，其原理示意图如图 所示。当电子穿过厚样品（或原子数目多）区域时发生弹性散射，产生的离轴电子比薄样品（或原子数目少）区域更多，导致电子透过较厚的样品区域后参与成像的电子数目更少，在 明场像中表现为亮度低，薄的样品区域亮度高，即图像衬度与质量和厚度有关。对于既定样品，影响质厚衬度的 参数有物镜光阑尺寸、物镜焦距和加速电压。布拉格衍射像是由晶体内部结构和样品取向决定的，因此衍射衬度是由于晶体样品满足布拉格反射条件程度不同而形成的衍射强度差异造成的衬度。相位衬度是电子束穿过样品后相位发生变化而造成的，相位衬度与样品厚度、晶体取向、散射因子、物镜离焦量和像散等因素有关，通常人们把相位衬度像和高分辨像等同。材料是由原子序数较低的碳、氢、氧等元素组成的尺寸 的微小颗粒，对入射电子的散射能力较弱，而且与载网的无定形碳支持膜成分较为一致，电子密度差异和质量厚度差异都很小，致使 样品的 图像反差不够强，即图像质厚衬度较弱。目前改善电镜成像衬度的方法主要有重金属染色技术和电子辐照技术：重金属染色是基于进入样品内部的化学物质与样品物质间的“反应”，必须具有高度选择性；电子辐照技术适用于在辐照下发生交联而不发生化学降解的材料，因此这 种方法均不适合 材料。本节从优化 参数和操作技巧出发，在不改变加速电压的前提下，探讨物镜光阑和物镜焦距（正焦和欠焦）与 的 成像衬度关系。在同一物镜焦距下，图 和 分别是不使用物 第 期梁国弘等：碳点透射电镜表征方法的探究与实践 图 形成质厚衬度的原理。镜光阑和使用物镜光阑（孔径 ）的 的 图像，插图为相应的局部放大图。通过 公司的“”（）软件分析图像衬度值（表 所示）：未加物镜光阑时，图像衬度的最大值为“”，与载网碳膜区域衬度相差较小，随图 物镜光阑对 图像影响。未加物镜光阑；加物镜光阑。；着物 镜 光 阑 的 加 入，图 像 衬 度 最 大 值 为“”，图像衬度稍微得到提高。物镜光阑在物镜的背焦面上，当入射电子束穿过样品时，电子与其原子核发生弹性散射偏离中心轴，物镜光阑通过挡住散射角较大的弹性散射电子，使到达荧光屏的电子束减少。由于 颗粒比衬底碳膜区域的散射电子多且散射角度略大，通过物镜光阑挡住散射角较大的弹性散射电子后，到达像平面（接着荧光屏）后参与 成像的电子少，那么 和衬底碳膜区域之间的电子强度差扩大，在 图像中 区域亮度降低，碳膜区域亮度不变，从而提高了图像衬度。当物镜光阑孔径角越小，被挡住的弹性散射电子越多，落在像平面对应区域上的电子数目更少，相应的亮度就越暗，所形成的 图像质厚衬度越好。另外本文使用的 的物镜光阑是高衬度物镜光阑，样品与光阑的距离被拉大，相应的光阑孔径角变小，使得更多的散射电子被光阑挡住，进一步提高了 图像衬度。表 不同物镜光阑尺寸的 图像衬度值 光阑孔径 衬度最大值衬度最小值 在同一物镜光阑（孔径 ）下，观察经快速傅里叶变换后的图像（）和样品边缘菲涅尔条纹的状态来调节物镜焦距。图 分别是正焦、欠焦、欠焦过量的 的 图像，并利用 软件分析不同离焦量的图像衬度值（表 所示）：正焦状态时（为一个圆盘）的图像衬度较差（图），无法区分 与碳膜区域；适当的欠焦（为 个环）时，边缘明亮且图像对比度最佳（图）；欠焦量的增加（为 个环）会进一步提高图像衬度，但过大的欠焦量导致菲涅尔条纹展宽过大，造成 边缘不明锐（图），粒径尺寸偏大的伪像。实验证明，欠焦技术能够增强图像的明暗对比度，且通过观察 环数可以控制物镜离焦量，在不影响图像质量的前提下，最大化的增强图像衬 电子显微学报 第 卷图 不同物镜焦距的 的 图像。正焦；欠焦量适当；欠焦量过大；插图为傅里叶变换后的图像。；度。欠焦技术能够增强图像衬度，主要是以下两点原因：）在相干的电子束照射下，欠焦状态时 边缘的菲涅尔条纹变宽能够加强样品边缘的反差，图像清晰明锐，从而增加了图像衬度；）当物镜处于正焦时，样品上散射出的电子基本都被会聚到像平面上，导致各个部分的电子强度差别较小，因而图像衬度较差；欠焦状态时，从 样品上散射出的高角度散射电子会聚能力变差，大部分高角度散射电子不能会聚到像平面一点，导致 的像点电子强度变小，呈现的亮度变暗，扩大了 和碳膜区域之间的电子强度差，从而提高了图像的衬度。表 不同物镜焦距的 图像衬度值 物镜焦距（环）衬度最大值衬度最小值 扫描透射成像 利用物镜光阑成像和欠焦技术，对提高 图像衬度有一定的效果，但物镜光阑尺寸越小，对 分辨率影响就越严重，图像强度越低。而且样品厚度比较薄，导致 与碳膜的焦距相差较小，在欠焦量较小的情况下，与碳膜在像平面上的成像电子数量相差较小，因此增加图像衬度的效果相对不够明显；在欠焦量较大的情况下，图像边缘不明锐、不清晰。那么猜想 成像中弱光强度背景是否能够提高 图像的衬度呢？（图）与（图）采用平行电子束聚焦成像不同，它是利用会聚的电子束聚焦到样品上表面，通过扫描线圈控制电子束在样品表面逐点扫描，样品下面的环形探测器接收电子散射，并将接收到的信号转换成图像。成像包含 明 场 像（，）、暗 场 像（，）和高角环形暗场像（，）。图 和 分别为 的 像和 像，其图像衬度明显优于 成像的衬度。模式通过改变相机常数来改变探测器的收集角，当电镜的相机常数 时，明场探测器只收集偏转角度 的透射电子和部分散射电子，其 图像衬度包含质厚衬度和衍射衬度。当电镜的相机常数在 时，暗场探测器接收偏转角度在 的电子，包含散射电子和大部分布拉格衍射电子，其 的图像衬度与样品厚度和经过 的衍射电子有关。当电镜的相机常数，高角环形暗场探测器只接收角度 的电子（主要为非相干散射电子），样品厚度一致时，其图像亮度正比于原子序数 的平方。高角环形暗场像是在非相干条件下成像，成像过程中抑制了衍射信号，因此 图像衬度反应样品不同位置化学成分的变化和厚度的区别。和碳膜化学成分一致，且 结晶性较好，本文选择在相机常数为 时进行 的 像和 像观察，探测器接收的散射电子和布拉格电子比 模式下多，其图像衬度最佳。统计观察到的 个，平均粒径在 。图 中 成像清晰地表征了 形貌和粒径尺寸，结合 和 可以分析 晶体结构。图 插图为对随机选择的单个 的高分辨观察像，晶格间距为 ，与石墨的（）晶面一致，且 的衍射花样（图）与其高分辨的晶格结构相对应。第 期梁国弘等：碳点透射电镜表征方法的探究与实践 图 成像原理示意图；成像原理示意图。；图 的 图像。暗场像；明场像。；图 的，和 衍射花样图像。颗粒分布均匀的 的 像，插图为 的 像；的 衍射花样。，；电子显微学报 第 卷 结语 是集透射成像、成像、成像以及 功能于一体的仪器设备。本文系统研究了 用于 表征的技术，采取倾斜载网制样法（）和邻位寻样技巧，该方法制样成功率高，分散性好，且提高了寻样效率。利用欠焦成像技术、物镜光阑成像技术和 成像技术提高 的电镜图像衬度，通过对比图像拍摄过程难易程度和图像效果，确定了 表征 的图像衬度最好。利用这种制样方法和观察方法的电镜图像质量高，可为 的 表征工作提供更有效的技术参考。参考文献：，：欧阳，李松达，袁文涛，等原位透射电镜在金属纳米颗粒氧化研究中的应用电子显微学报，（）：赵彦伟，李蕊，李艺，等透射电镜在仿硅藻结构的介孔二氧化硅表征和制备中的应用 分析仪器，：王乙潜，梁文双高分辨电子显微学进展及其在材料科学中的应用实验技术与管理，（）：施云峰，薛巍电子显微技术应用于生物纳米材料表征与测试的研究进展分析测试学报，（）：陈勇，张俊霞，江轶，等新冠病毒感染机制的透射电镜研究评述实验技术与管理，（）：，：，（）：，：，（）：张路鹏，张清梅，何松杰，等 碳点的功能化研究进展 发光学报，（）：，（）：，（）：，：章晓中 电子显微分析 北京：清华大学出版社，：柳德橹，权茂华，吴杏芳 电子显微分析实用方法北京：中国质检出版社，袁莉民，周天阳 用于扫描电镜观察的水凝胶样品薄层制备技术 电子显微学报，（）：周武 石墨烯的低电压扫描透射电子显微学成像研究电子显微学报，（）：，（）：袁文涛，李冠星，王勇，等 透射电镜在纳米材料表面科学中的应用浅析：以二氧化钛为例电子显微学报，（）：，：，（）：刘丽月，曾江涛 量子点在透射电镜中的电子辐照损伤行为 电子显微学报，（）：冯远皓，柯小行，隋曼龄 无机双钙钛矿太阳能电池材料 在电子束辐照下的降解行为研究 电子显微学报，（）：王书运，谢英渤，低反差样品电镜图像衬度的提高分析测试技术与仪器，（）：刘志昂，谭青青，渠凤丽一种碳量子点透射电子显微镜的样品制备方法 电子显微学报，（）：，：马秀梅电子显微学专业课的透射电镜样品制备实习课 实验室研究与探索，（）：，第 期梁国弘等：碳点透射电镜表征方法的探究与实践 ：，：王春省，封振宇 磁性微纳米材料透射电镜测试的简单制样方法 实验技术与管理，（）：刘湘花，张彩丽，张俊霞，等 透射电镜负染色技术常见影响因素与对策临床与实验病理学杂志，（）：，：，（，；，；，）（），（），（）；