痰液标本细菌学检验(一).doc

痰液标本细菌学检验（一）
关键词：细胞库 菌株培养中心 atcc 北京标准物质网
一、检验程序
痰及呼吸道标本的细菌学检验程序见图34—1。

二、检验方法
(一)显微镜检查
1．一般细菌涂片检查  挑取标本中脓性或带血部分涂片进行革兰染色镜检，描述观察到的细菌的染色性、形态及排列等特征，可发出初步报告。
2．结核分枝杆菌涂片检查  挑取标本干酪样或脓性部分做抗酸染色和金胺“O”荧光染色，前者用油镜，后者用荧光显微镜检查。具体操作详见第十五章分枝杆菌属检验。
3．放线菌及诺卡菌涂片检查  将痰液用生理盐水反复洗涤数次，挑取黄色颗粒(硫黄颗粒)或不透明着色斑点，置玻片上并覆以盖玻片，轻压后置高倍镜下观察。如见中央为交织的菌丝，其末端粗杆呈放线状排列时揭去盖玻片，待干后做革兰染色及抗酸染色镜检。
4．下呼吸道其他标本检查  支气管肺泡灌洗液等直接取自下呼吸道的标本，不易受上呼吸道杂菌的污染，涂片检菌的意义较大。可取离心沉淀物进行革兰染色与抗酸染色检查。
(二)培养和鉴定
1．痰培养标本的前处理  于痰标本中加入一定量无菌生理盐水，剧烈振荡5～10秒后，将沉淀于管底的脓痰小片取出，置于另一试管中，同法再处理2次，可洗去痰中的正常菌群。然后向洗涤过的痰液中加入等量pH 7. 6的1％胰酶溶液，放置35℃环境90分钟，使痰液均质化后备用。
2．培养基与培养环境
(1)血琼脂平板：适用于分离多种细菌，需氧环境，可分离β-溶血性链球菌，葡萄球菌；置于5％CO2环境培养，分离肺炎链球菌和β-溶血性链球菌。根据血琼脂平板生长的菌落特征及镜检形态，得出初步结果，再按各类细菌特性做进一步鉴定。
(2)巧克力色琼脂平板：置于5％CO2环境培养，常用于分离嗜血杆菌和脑膜炎奈瑟菌等有特殊营养需求的细菌。
(3)中国蓝琼脂平板／麦康凯平板：需氧环境培养，常用于分离肠杆菌科细菌。
(4)TTC-沙保弱培养基：需氧环境培养，用于分离白假丝酵母菌及其他酵母菌、诺卡菌、放线菌以及烟曲霉菌等。
(5)厌氧血平板：厌氧环境培养，用于培养厌氧菌。
(6)结核分枝杆菌培养基：需氧或5％～10％CO2环境培养，改良罗氏培养基、米氏7H10培养基或其他合适的培养基，用于培养结核分枝杆菌。
(7)军团菌专用培养基：置于2．5％～5. 0％CO2环境培养，药用炭酵母琼脂(CYE)培养基、F-G琼脂，用于培养军团菌。
3．标本的培养
(1)普通细菌培养：将处理后的痰标本接种于血琼脂平板、中国蓝琼脂平板／麦康凯平板、巧克力色琼脂平板上，分别放入普通环境和5％～10％CO2环境中，35℃培养18～24小时，观察菌落特征，并涂片进行革兰染色，根据菌体的形态特点做进一步鉴定。有条件或必耍时进行厌氧培养。具体操作详见第十七章厌氧性细菌检验。
(2)结核分枝杆菌培养：将处理后的痰标本接种于改良罗氏培养基或米氏7H10培养基，置35℃、5％～10％CO2环境中培养。根据初步生长出菌落时间和是否产生色素等特点，加以判定。
(3)标本的菌落计数培养：液体标本，如保护性支气管肺泡灌洗吸出液(PBAL)、气管穿刺抽吸液(TTA)、保护性标本刷洗液(PSB)标本或定量稀释均质化处理的痰标本，可做菌落计数培养。
常用的改良Gould法是一种半定量的方法，先将平皿分为A、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等4个区，阻3mm接种环取一满环液化痰液(或定量采集的PBAL、TTA、PSB)接种于血琼脂平板或巧克力色琼脂平板，先在A区画线20~40条，然后在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ区分别画线4条。在做Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分区画线前，接种环均须经烧灼灭菌。接种后的培养基置35℃培养1 8～20小时，然后分别计数各区某一特征的菌落数，查阅表34—3即得出每毫升痰液中某一特征菌落细菌的对应数量。

一般认为痰液标本中，某种细菌浓度达到≥107CFU／ml，可视为病原菌；<104，可视为污染菌；若介于105～106CFU／ml两者之间时，要连续分离培养两次阻上，仍为105～106CFU／ml时，亦认为是病原菌。
例如：一份痰标本，经均质化处理过程已经进行了1：16倍稀释，按上述菌落计数方法操作，培养24小时后，某一特征最优势菌落Ⅰ区生长5个(相当于90个)，查表对应于10000行，计算(×103)得菌落数≥107CFU/ml，由此可以判断该特征菌落为病原菌。提倡做菌落计数培养有两方面原因，其一，有的标本中细菌数量可能较少，需通过茼落计数判断是否足以引起化脓性感染；其二，有的标本污染正常菌群的可能性较大，需通过菌落计数判断哪一种菌落是引起化脓性感染的病原菌。痰标本细菌菌落计数培养还没有列入统一规范，供做参考。